אנו מודים לחברים קודמים ונוכחיים במעבדת קים שתרמו לפיתוח פרוטוקולים אלה לאורך זמן. הנתונים המייצגים התאפשרו על ידי P01 AI102851/AI/NIAID NIH HHS/United States ו-P01 HL018208/HL/NHLBI NIH HHS/United States. פרסום זה התאפשר בחלקו הודות למענק מספר T32 GM135134 מטעם פרס שירות המחקר הלאומי ע"ש רות ל. קירששטיין.

הפרוטוקולים של בעלי החיים אושרו על ידי הוועדה האוניברסיטאית למשאבי בעלי חיים באוניברסיטת רוצ'סטר. העכברים במחקר זה הוחזקו בחלל נטול הפתוגנים של מתקן בעלי החיים של אוניברסיטת רוצ'סטר. עכברי C57BL/6 זכרים/נקבות, בגילאי 6-12 שבועות (15-30 גרם), שימשו במחקר הנוכחי. בידוד רקמות עכבר יכול להתבצע על ספסל עם כפפות לכיסוי ידיים ומסכת פנים לכיסוי האף והפה, או בתוך ארון בטיחות ביולוגית. כל תרבית התאים והכנת הצלחת חייבים להתבצע בארון בטיחות ביולוגית. הריאגנטים והציוד ששימשו במחקר זה מפורטים בטבלת החומרים.
1. טיהור והפעלה של תאי CD8+ T
<ol><li>הכנת חומרים<ol><li>לברירה שלילית של תאי CD8+ T: הכינו מדיום ברירה שלילי מהסופרנאטנט של קווי תאי היברידיומה GK1.5 ונוגדנים M5/114, המייצרים נוגדנים נגד CD4 ואנטי MHCII, בהתאמה. מערבבים את הסופרנאטנט ביחס של 1:1, מסננים אותו ומאחסנים אותו בטמפרטורה של 4°C לשימוש עתידי (>0.5 מיקרוגרם מכל נוגדן למיליון תאים בסך הכל). לחלופין, קיימות ערכות מסחריות לבידוד תאי CD8+ T.</li>
		<li>להפעלת תאי T: יש להוסיף 500 μL של נוגדני CD3 (10 מיקרוגרם/מ"ל) ו-CD28 (16 מיקרוגרם/מ"ל) ב-1x DPBS (ללא סידן ומגנזיום) לתרבית שאינה רקמה (TC) שטופלה בצלחת 24 בארות ולאחסן למשך הלילה ב-4°C כדי להבטיח קשירת צלחת. הערה: נוגדנים וחלבונים מצפים צלחות/צלחות תרבית שאינן מטופלות ב-TC טוב יותר מאשר צלחות תרבית רגילות שטופלו ב-TC, כך שצלחות תרבית שאינן מטופלות ב-TC משמשות לייצור תאי T.</li>
	</ol></li>
	<li>הכינו צלחת תרבית בקוטר 10 ס"מ (או שווה ערך) על ידי הכנסת מסננת תאים של 70 מיקרומטר לתוך המנה והזריקו 2 מ"ל של מדיום R9 לתוך המסנן (מדיום R9: RPMI 1640x בתוספת 10% FBS, 1% אנטיביוטי-אנטי-מיקוטי, 20 mM HEPES buffer, 1% MEM חומצות אמינו לא חיוניות, 50 מיקרומטר β-מרקפטואתנול).</li>
	<li>השג עכבר עם רקע גנטי מתאים, מין, גיל ומשקל כפי שנקבע על ידי תכנון הניסוי.</li>
	<li>יש להרדים את העכבר באמצעות CO2 ולאחר מכן לבצע פריקת צוואר הרחם, או אסטרטגיות המתת חסד מתאימות כפי שהוגדרו על ידי פרוטוקולים מקומיים לטיפול ושימוש בבעלי חיים ואושרו על ידי המוסד.</li>
	<li>הניחו את העכבר בתנוחת שכיבה, מתחו את כל ארבעת הגפיים בניצב לגוף והצמידו את כריות הרגליים ללוח דיסקציה באמצעות סיכות T לנתיחת עכבר, או שווה ערך. בצע חתך שטחי ומרכזי דרך השכבה העורית בבטן התחתונה הגחונית בעזרת מספריים כירורגיים של עכבר וחתך ישר עד הסנטר (~8 ס"מ). יש להפריד את העור מרירית הצפק כדי לחשוף את בלוטות הלימפה. מתחו את העור בניצב הרחק מתא המטען ונעצו אותו כלפי מטה5.<ol><li>יש לכרות בעדינות את בלוטות הלימפה הצוואריות, הציריות, הברכיאליות והמפשעות באופן דו-צדדי באמצעות מלקחיים קהים (או מהסוג המועדף מערכת דיסקציה כירורגית סטנדרטית של עכבר). העברה למסננת התא שהוכנה בשלב 1.2.</li>
		<li>פתח את הצפק והסר את הטחול. העברה למסננת התא שהוכנה בשלב 1.2.</li>
		<li>יש להשליך את פגר העכבר בכלי הקיבול המתאים לסיכון ביולוגי.</li>
	</ol></li>
	<li>הכינו תרחיף חד-תאי של רקמות הלימפה המשניות על ידי הפרעה מכנית מעל מסננת התאים של 70 מיקרומטר עם 2 מ"ל של מדיום R9 משלב 1.2 על ידי סיבוב כלי שיבוש הרקמות, חצי סיבוב בכיוון השעון ונגד כיוון השעון שוב ושוב. הערה: קצה הבוכנה של מזרק luer-lock, או 3 מ"ל או 10 מ"ל, עובד היטב כדי למחוץ הומוגניזציה של הרקמה. ניתן להשתמש בחומרים חלופיים לפי שיקול דעתו של המשתמש.</li>
	<li>שטפו את התאים, קצה המזרק, המסננת וכלי התרבית עם 7 מ"ל של מדיום, וודאו שהמסננת נשארת זקופה כדי למנוע העברה של חתיכות גדולות יותר של רקמה או אגרגטים תאיים שעשויים להימצא בתרחיף החד-תאי.</li>
	<li>מעבירים את תרחיף התא לצינור חרוטי של 15 מ"ל.</li>
	<li>משחררים את התאים ב 270 x גרם בטמפרטורת החדר (20 ° C) במשך 5 דקות ומרוקנים את supernatant.</li>
	<li>הוסף 500 μL של חיץ שוכב למשך דקה אחת כדי להסיר תאי דם אדומים. לדלל עם 9.5 מ"ל של R9 בינוני ולהסתובב ב 270 x גרם (20 ° C) במשך 5 דקות. דקנט את הסופר-נטנט.</li>
	<li>השהה מחדש את הגלולה ב -10 מ"ל של מדיום הבחירה השלילית שהוכן בעבר המכיל אנטי MHCII ואנטי CD4 (שלב 1.1.1). רוק בטמפרטורת החדר (20 מעלות צלזיוס) למשך 30 דקות.</li>
	<li>משחררים את התאים ב 270 x גרם במשך 5 דקות ומרוקנים את הסופרנטנט. יש לשטוף 3x עם 10 מ"ל של R9 בינוני.</li>
	<li>במקביל, בצינור חרוטי של 15 מ"ל, לשטוף 200 μL של חרוזי IgG נגד חולדות כבשים ב 7 מ"ל של בינוני. הניחו את הצינור על מגנט, הסירו את המדיום וחזרו על שלב השטיפה פעמיים. להשעות את החרוזים ב 7 מ"ל של R9 בינוני.</li>
	<li>גלולה את התאים ב 270 x גרם (20 ° C) במשך 5 דקות, decant את supernatant, ולאחר מכן להשעות מחדש את הגלולה ב 7 מ"ל של השעיית חרוזים משלב 1.13. רוק בטמפרטורת החדר (20 מעלות צלזיוס) במשך 45 דקות.</li>
	<li>העשרת תאי CD8+ T על ידי דלדול חרוזים מגנטי. הניחו את הצינורית החרוטית ישירות על המגנט ללא מכסה למשך 3 דקות כדי להסיר תאים הקשורים לנוגדנים/חרוזים. יש לשמור תאי CD8+ . כאשר הצינור עדיין בתוך המגנט, אספו את תרחיף התא באמצעות צינור סרולוגי או שווה ערך והעבירו אותו לצינור חדש של 15 מ"ל. צנטריפוגה בטמפרטורה של 270 x גרם (20°C) למשך 5 דקות וכביסה של 3 פעמים בטמפרטורה בינונית.</li>
	<li>שטפו את צלחת ההפעלה המצופה מראש (שלב 1.1.2) עם DPBS אחד פעמיים מבלי לשפשף ישירות על המשטח התחתון של הצלחת.</li>
	<li>אופציונלי: בצע הפרדת לימפוציטים חיים/מתים כדי להסיר תאים מתים.<ol><li>העברת תאים לצינור חרוטי של 15 מ"ל. הוסף בעדינות 2 מ"ל של אמצעי הפרדת לימפוציטים לתחתית השעיית התא. צנטריפוגה במהירות 900 x גרם למשך 10 דקות (בטמפרטורת החדר) בתאוצה והאטה נמוכות. הערה: תאים חיים ייפרדו בממשק של מדיה בינונית ומדיה הפרדה (שכבה לבנה אמצעית). תאים מתים יכדורו בתחתית הצינור ועשויים להיות מושלכים בקצהו.</li>
		<li>מעבירים את השכבה האמצעית המכילה לימפוציטים חיים לצינור וצנטריפוגה חדשים במהירות 270 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. דקנט את הסופר-נטנט.</li>
	</ol></li>
	<li>השהה מחדש את הגלולה ב 12 מ"ל של בינוני עם 10 U/mL עכבר רקומביננטי IL-2. צלחת 1 מ"ל לכל באר בצלחת שאינה TC מטופלת 24 בארות ולהעביר ל 37 ° C בן לילה.</li>
</ol>2. הרמת תאי CD8+ T מופעלים
<ol><li>דמיינו תאים באמצעות מיקרוסקופ אור סטנדרטי, באמצעות המטרה 4x או 10x. הערה: תאי T פעילים ייראו גדולים יותר, עגולים או מוארכים בהשוואה לתאי T בלתי פעילים, וצריכים להיות להם אשכולות צפופים של תאים ברחבי הבאר.</li>
	<li>כדי להרים את התאים המופעלים, לשבש את התאים עם פיפטה 1 מ"ל, הקפד לערבב היטב בשולי הצלחת. העברת תאים לצינור חרוטי חדש של 15 מ"ל. הערה: תאים פעילים הם דביקים יותר ודורשים פיפטינג נמרץ יותר.</li>
	<li>לשטוף את הבארות עם 1 מ"ל של מדיום R9 כדי להסיר את כל התאים שנותרו. חזור על הפעולה פעם נוספת במידת הצורך. צנטריפוגה את התאים ב 270 x גרם (20 ° C) במשך 5 דקות. השליכו את הסופרנטנט.</li>
	<li>בצע הפרדת לימפוציטים חיים/מתים כדי להסיר תאים מתים כמו בשלבים 1.17-1.18.</li>
	<li>שמור על תאי T על ידי הסרת תאים חיים/מתים כל 3-4 ימים בתווך R9 עם IL-2 בצלחת 6 בארות שאינה TC. הערה: תאי T מתרבים טוב יותר בבארות בעלות ממדים קטנים במהלך ההפעלה המוקדמת, אולי בשל מגעים בין תאי T לתאי T או גורמים מסיסים שמקורם בתאי T המסייעים להפעלתם. התפשטות מהירה של תאי T גורמת לתרבית להצהיב תוך 24-48 שעות לאחר התרבית. בשלב זה, הרימו את התאים והעבירו אותם לבאר גדולה יותר (צלחת לא מצופה, לא TC 6 בארות) עם מספיק תרבית טרייה כדי להזין את התאים (בדרך כלל 5 מ"ל לבאר). החלף מדיום מדולדל בטרי בכל פעם שמצוין בשינוי צבע בינוני צהוב, או כל 3-4 ימים.</li>
</ol>3. הכנת צלחת זכוכית
<ol><li>הכינו תאי נדידת תאי זכוכית או צלחות על ידי ציפוי ב-300 מיקרוליטר/ס"מ2 חלבון A (0.1 מ"ג/מ"ל) למשך הלילה ב-4°C, שטפו פעמיים עם DPBS אחד על ידי ניפוק על הכלי וניקוי לפני המעבר לשלב הבא.</li>
	<li>צפו את תא הנדידה או הצלחת בכימרה של300 μL/cm 2 עכבר רקומביננטי ICAM-1 או VCAM-1 Fc כימרה (0.1-2.75 מ"ג/מ"ל) יחד עם כימוקין עכבר רקומביננטי (0.1-10 מיקרוגרם/מ"ל) למשך 2-3 שעות בטמפרטורת החדר. ליגנדות אינטגרין אחרות כגון פיברונקטין (fibronectin), קולגן IV של עכבר ו-E-cadherin של עכבר ניתנות לציפוי ישיר של התא ב-2.5-10 מיקרוגרם/מ"ל למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C.<ol><li>יש לשטוף את התאים פעמיים עם DPBS אחד על ידי ניפוק על הצלחת וניקוי מיד לאחר מכן לפני הוספת תאים. הערה: תאי T יכולים לנדוד באופן שונה בריכוזים שונים של ליגנדות אינטגרין וכימוקינים בהתאם למצב ההפעלה, ההתמיינות, הרגישות והפריימינג. מומלץ מאוד לבצע נדידת תאים במספר ריכוזים שונים.</li>
	</ol></li>
	<li>לוחית את התאים הדבקים על לוחות מצופים זכוכית 24 שעות לפני תחילת ההדמיה אם תרבית תאי T יחד עם תאים אחרים, כגון תאים סרטניים, כדי למדוד הרג תאי T של תאים סרטניים בזמן אמת.</li>
</ol>4. הכנת תאים
<ol><li>אופציונלי: צביעת תאי T ותאים דבקים עם צבע מעקב תאים לבחירה ב 1 מיקרוגרם / מ"ל לכל 1 x 107 תאים ב 1x DPBS למשך 15 דקות ב 37 ° C, או על פי פרוטוקול היצרן.</li>
	<li>ספירת תאים באמצעות המוציטומטר או שווה ערך.</li>
	<li>צלחת 1 x 105 CD8+ תאי T (או כמות רצויה) בתווך L-15 של לייבוביץ בתוספת 1-5 גרם / ליטר גלוקוז בתא 37 מעלות צלזיוס. הערה: L-15 בינוני מיוצר לשימוש ללא מערכת CO2-נתרן ביקרבונט. הוא נאגר באמצעות חומצות אמינו בסיסיות חופשיות, מאגרי פוספט וגלקטוז כדי לשמור על רמות pH.</li>
	<li>אופציונלי: ביצוע חסימת אינטגרין.<ol><li>קדם-דגירה של תאי T עם נוגדן חוסם לאינטגרין (1-10 מיקרוגרם/מ"ל, CD11a נגד עכבר (M17/4), CD18 נגד עכבר (M18/2), VLA-4 נגד עכבר (9C10) למשך 10 דקות ולאפשר לזחול בנוכחות אותו נוגדן.</li>
	</ol></li>
</ol>5. מיקרוסקופ קיטועי זמן
<ol><li>בצע מיקרוסקופ וידאו.</li>
	<li>עבור תאי T, קבל תמונות שדה בהיר ופלואורסצנטי כל 10-60 שניות למשך 10-60 דקות, או הגדרות רכישה רצויות. הערה: נדידת תאי T רגישה לטמפרטורה, והטמפרטורה האופטימלית לנדידת תאי T של עכבר היא 37°C. מערכת בקרת הטמפרטורה בה משתמש פרוטוקול זה מורכבת מסיפון מיקרוסקופ סגור ומבודד עם מערכת חימום מחוברת. תא ההדמיה יושב על סיפון ההדמיה. היקף החדר הזה יש באר מלאה מים מזוקקים המאפשר חום ולחות עקביים במהלך ההדמיה. המיקרווול ממוקם במרכז תא ההדמיה.</li>
</ol>6. ניתוח בעזרת תוכנה של נדידת תאי T
<ol><li>השתמש בתוכנת Volocity כדי להעריך נדידת תאי T.<ol><li>פתח את Volocity וצור רצף תמונות חדש.</li>
		<li>בחר והזז את כל סרטי מיקרוסקופ הווידאו עם קיטועי זמן לאזור הכחול בוולוסיטי.</li>
		<li>התאם את הבהירות והניגודיות באמצעות כלי שיפור הניגודיות להגדרות הרצויות של החוקר.</li>
		<li>בדוק גדלי תמונה: 0.325 מיקרומטר עבור 20x, 0.65 מיקרומטר עבור 10x.</li>
		<li>רצף: הגדר נקודות זמן (לדוגמה: 81 תמונות אם מצלמים תמונה כל 15 שניות למשך 20 דקות, 4 תמונות לדקה).</li>
		<li>בטל את הסימון של כל נקודות הזמן בכרטיסיה מדידה.</li>
		<li>מצא אובייקטים באמצעות עוצמה - החלק את הסרגל כך שיהיה בדיוק מימין לפסגה.</li>
		<li>אל תכלול עצמים לפי גודל: כל התאים שקוטרם קטן מ-10 מיקרומטר וגדול מ-100 מיקרומטר, כדי לא לכלול פסולת תאים או חלקיקים שאינם תאיים. אל תכלול תאי T שנודדים פחות מ- 20% מזמן ההקלטה (דבר שיכול להשתנות בהתאם להגדרה של כל חוקר).</li>
		<li>התעלם מאובייקטים סטטיים (תיבת סימון).</li>
		<li>צירוף אוטומטי של אסופות מנותקות (תיבת סימון).</li>
		<li>הגדר את הנתיב הקצר ביותר ללא יותר מ -20 מיקרומטר.</li>
		<li>המסלול של נדידת תאים הוא הקו המחבר את המיקום של אותו תא לאורך זמן. ודא שאלגוריתם המעקב עוקב על-ידי זיהוי היכן אובייקטים בודדים מזוהים לפי סגמנטציה בכל מסגרת, והאובייקטים מותאמים בין מסגרות.</li>
		<li>שמור פרוטוקול חדש על-ידי בחירה באפשרות מדידות > שמור פרוטוקול > תן שם לפרוטוקול חדש.</li>
		<li>לחץ על מדידת כל נקודות הזמן בכרטיסיה מדידה.</li>
		<li>מיין רצועות לפי טווח זמן, מגבוה לנמוך.</li>
		<li>רשום מספרי זיהוי של רצועות עבור כל התאים עם מסלולים טובים כפי שהוגדרו על-ידי החוקר. לאחר מעקב אוטומטי אחר תאים, יש צורך בהערכה ידנית של כל מסלול תא כדי לא לכלול מסלולים שזוהו באופן שגוי או שבורו. אל תכלול תאים עם רצועות פגומות.</li>
		<li>ייצא את הקובץ כטקסט מופרד באמצעות פסיקים והעבר נתונים לתוכנת הניתוח הרצויה. הערה: פרמטרים בסיסיים: מהירות (מיקרומטר לדקה), תזוזה (תנועה נטו, מיקרומטר), אורך מסלול (אורך נתיב כולל, מיקרומטר) ואינדקס מתפתל (MI; תזוזה נטו/אורך מסלול. MI = 1 מציין מסלול ליניארי ישר לחלוטין).</li>
	</ol></li>
	<li>בצע מעקב ידני באמצעות תמונה J.<ol><li>פתח תוספים ובחר מעקב ומעקב ידני. הגדר את הפרמטרים - מרווחי זמן, כיול x/y (גודל פיקסל) וכיול z (במצב מעקב ידני). התחל מעקב אחר תאים בודדים על-ידי לחיצה על הוסף מסלול, בחירת תא אחד בנקודת הזמן הראשונה והמשכו לאורך כל נקודות הזמן. לאחר מכן, לחץ על סיום מסלול. חזור על כך עבור כל התאים המעניינים. הערה: Trackmate, כלי נוסף למעקב אחר תאים, הוא תוכנת מעקב אוטומטית הזמינה דרך תוסף ImageJ.</li>
	</ol></li>
</ol>

הבהרת קינטיקה של תאי T: שיטות לניתוח נדידה בזמן אמת

<ol>
	<li>Sun, L., Su, Y., Jiao, A., Wang, X., Zhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cells+in+health+and+disease.">T cells in health and disease.</a> Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 235 (2023).</li><li>Fowell, D. J., Kim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spatio-temporal+control+of+effector+T+cell+migration.">The spatio-temporal control of effector T cell migration.</a> Nat Rev Immunol. 21 (9), 582-596 (2021).</li><li>Tabdanov, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+t+cells+to+enhance+3d+migration+through+structurally+and+mechanically+complex+tumor+microenvironments.">Engineering t cells to enhance 3d migration through structurally and mechanically complex tumor microenvironments.</a> Nat Commun. 12 (1), 2815 (2021).</li><li>Kameritsch, P., Renkawitz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+leukocyte+migration+strategies.">Principles of leukocyte migration strategies.</a> Trends Cell Biol. 30 (10), 818-832 (2020).</li><li>Flaherty, S., Reynolds, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+naive+CD4++T+cell+isolation+and+in+vitro+differentiation+into+t+cell+subsets.">Mouse naive CD4+ T cell isolation and in vitro differentiation into t cell subsets.</a> J Vis Exp. (98), e52739 (2015).</li><li>Sailer, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pd-1(hi)+CAR-T+cells+provide+superior+protection+against+solid+tumors.">Pd-1(hi) CAR-T cells provide superior protection against solid tumors.</a> Front Immunol. 14, 1187850 (2023).</li><li>Lim, K., Hyun, Y. M., Lambert-Emo, K., Topham, D. J., Kim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+integrin+mac-1+in+vivo.">Visualization of integrin mac-1 in vivo.</a> J Immunol Methods. 426, 120-127 (2015).</li><li>Lim, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+trails+guide+influenza-specific+CD8++T+cells+in+the+airways.">Neutrophil trails guide influenza-specific CD8+ T cells in the airways.</a> Science. 349, 4352 (2015).</li><li>Lim, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+neutrophil+efferocytosis+shapes+T+cell+immunity+to+influenza+infection.">In situ neutrophil efferocytosis shapes T cell immunity to influenza infection.</a> Nat Immunol. 21 (9), 1046-1057 (2020).</li><li>Reilly, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T(rm)+integrins+CD103+and+CD49a+differentially+support+adherence+and+motility+after+resolution+of+influenza+virus+infection.">T(rm) integrins CD103 and CD49a differentially support adherence and motility after resolution of influenza virus infection.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (22), 12306-12314 (2020).</li><li>Amitrano, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+control+of+CD8(+)+T+cell+metabolism+and+effector+functions.">Optical control of CD8(+) T cell metabolism and effector functions.</a> Front Immunol. 12, 666231 (2021).</li><li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+control+of+chemokine+receptor+signal+and+t-cell+migration.">Optogenetic control of chemokine receptor signal and t-cell migration.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (17), 6371-6376 (2014).</li><li>Capece, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+intracellular+pool+of+IFA-1+is+critical+for+asymmetric+CD8(+)+T+cell+activation+and+differentiation.">A novel intracellular pool of IFA-1 is critical for asymmetric CD8(+) T cell activation and differentiation.</a> J Cell Biol. 216 (11), 3817-3829 (2017).</li><li>Hirai, T., Whitley, S. K., Kaplan, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migration+and+function+of+memory+CD8(+)+T+cells+in+skin.">Migration and function of memory CD8(+) T cells in skin.</a> J Invest Dermatol. 140 (4), 748-755 (2020).</li><li>Mouchacca, P., Schmitt-Verhulst, A. M., Boyer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+cytolytic+T+cell+differentiation+and+granule+exocytosis+with+T+cells+from+mice+expressing+active+fluorescent+granzyme+B.">Visualization of cytolytic T cell differentiation and granule exocytosis with T cells from mice expressing active fluorescent granzyme B.</a> PLoS One. 8 (6), e67239 (2013).</li><li>Nuzzi, P. A., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+neutrophil+chemotaxis.">Analysis of neutrophil chemotaxis.</a> Methods Mol Biol. 370, 23-36 (2007).</li><li>Heit, B., Tavener, S., Raharjo, E., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+intracellular+signaling+hierarchy+determines+direction+of+migration+in+opposing+chemotactic+gradients.">An intracellular signaling hierarchy determines direction of migration in opposing chemotactic gradients.</a> J Cell Biol. 159 (1), 91-102 (2002).</li><li>Zigmond, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ability+of+polymorphonuclear+leukocytes+to+orient+in+gradients+of+chemotactic+factors.">Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors.</a> J Cell Biol. 75 (2), 606-616 (1977).</li><li>Jowhar, D., Wright, G., Samson, P. C., Wikswo, J. P., Janetopoulos, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open+access+microfluidic+device+for+the+study+of+cell+migration+during+chemotaxis.">Open access microfluidic device for the study of cell migration during chemotaxis.</a> Integr Biol (Camb). 2 (11-12), 648-658 (2010).</li><li>Sai, J., Walker, G., Wikswo, J., Richmond, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+IL+sequence+in+the+LLKIL+motif+in+CXCR2+is+required+for+full+ligand-induced+activation+of+Erk,+Akt,+and+chemotaxis+in+HL60+cells.">The IL sequence in the LLKIL motif in CXCR2 is required for full ligand-induced activation of Erk, Akt, and chemotaxis in HL60 cells.</a> J Biol Chem. 281 (47), 35931-35941 (2006).</li><li>Choi, Y., Sunkara, V., Lee, Y., Cho, Y. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exhausted+mature+dendritic+cells+exhibit+a+slower+and+less+persistent+random+motility+but+retain+chemotaxis+against+ccl19.">Exhausted mature dendritic cells exhibit a slower and less persistent random motility but retain chemotaxis against ccl19.</a> Lab Chip. 22 (2), 377-386 (2022).</li><li>Harding, M. G., Zhang, K., Conly, J., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+crawling+in+capillaries:+A+novel+immune+response+to+staphylococcus+aureus.">Neutrophil crawling in capillaries: A novel immune response to staphylococcus aureus.</a> PLoS Pathog. 10 (10), e1004379 (2014).</li><li>Rommerswinkel, N., Niggemann, B., Keil, S., Zanker, K. S., Dittmar, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cell+migration+within+a+three-dimensional+collagen+matrix.">Analysis of cell migration within a three-dimensional collagen matrix.</a> J Vis Exp. (92), e51963 (2014).</li><li>Wu, P. H., Giri, A., Sun, S. X., Wirtz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+migration+does+not+follow+a+random+walk.">Three-dimensional cell migration does not follow a random walk.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (11), 3949-3954 (2014).</li><li>Lammermann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+leukocyte+migration+by+integrin-independent+flowing+and+squeezing.">Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing.</a> Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).</li><li>Overstreet, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation-induced+interstitial+migration+of+effector+CD4(+)+T+cells+is+dependent+on+integrin+&#945;v.">Inflammation-induced interstitial migration of effector CD4(+) T cells is dependent on integrin &#945;v.</a> Nat Immunol. 14 (9), 949-958 (2013).</li></ol>

המחברים מצהירים כי כל המחקר והכנת כתבי היד נעשו בהיעדר קשרים מסחריים או פיננסיים שיכולים להתפרש כניגוד עניינים פוטנציאלי.

הבנת ההשפעה הביולוגית של התכנסות אותות in vivo היא מאתגרת ולא קלה לפרשנות. הפרוטוקולים המוצגים כאן מספקים שיטה סבירה להבנת נדידת תאי T בתנאים מוגדרים מאוד ורלוונטיים ביולוגית. תנאים אלה יכולים להיות מוגדרים על פי שיקול דעתו של החוקר, וניתן לשנות את הפרוטוקולים כך שיתאימו לצרכים של אוכלו...

תאי T הם הגורמים העיקריים לתגובה חיסונית נרכשת, ספציפית לאנטיגן. ברמת האוכלוסייה, תאי T הם הטרוגניים, המורכבים מתת-קבוצות תאיות בעלות פונקציות מיוחדות שונות. חשוב לציין, תאי CD8+ T הם המשפיעים הציטוליטיים העיקריים של המערכת החיסונית, אשר מבטלים ישירות תאים נגועים או לא מתפקדים1.
תאי T בוגרים מסוג CD8+ שוכנים ברקמה וזורמים דרך הדם והלימפה בחיפוש אחר אנטיגנים. במהלך ההדבקה, תאי T מוצגים עם אנטיגנים בדם או ברקמה ומתנקזים במהירות לטחול או לבלוטת הלימפה המתנקזת הקרובה ביותר כדי להתחיל תגובה חיסונית פרודוקטיבית. בכל מקרה, תאי T מופעלים, עוברים הרחבה שבטית ועוזבים את מערכת הלימפה כדי להיכנס לדם, אם עדיין לא שם. במהלך תהליך זה, איתות תוך-תאי מעניק את הירידה בוויסות של קולטני הביות הלימפטיים ואת ה-upregulation של קולטני אינטגרין וכימוקין רבים החיוניים לנדידה ספציפית לרקמה2. בסופו של דבר, ההגירה המכוונת של תאי T לאתרי זיהום מונעת על ידי אותות סביבתיים מתכנסים הכוללים איתות אינטגרין וכימוקין.
ניתן לסווג כימוקינים באופן כללי לשני סוגים עיקריים: (1) אותות הומיאוסטטים, החיוניים להתמיינות, הישרדות ותפקוד בסיסי, ו-(2) אותות דלקתיים, כגון CXCL9, CXCL10 ו-CCL3, הנדרשים לכימוטקסיס. באופן כללי, כימוקינים יוצרים שיפוע אות המניע נדידה כיוונית, המכונה כימוטקסיס, בנוסף להפעלת ביטוי אינטגרין1. כימוטקסיס מווסתת היטב ורגישה מאוד, עם תאי T המסוגלים להגיב לשינויים זעירים בשיפוע שיכולים להוביל אותם לכיוון או מיקום מסוים.
בנוסף לגורמים אלה הקשורים לתאי T, ההגירה מושפעת גם מההרכב והצפיפות של המטריצה החוץ תאית (ECM). ה-ECM מורכב מרשת צפופה של חלבונים, כולל קולגן ופרוטאוגליקנים, המספקים את הפיגום לקולטני אינטגרין דביקים על תאי T. אינטגרינים הם משפחה מגוונת של חלבונים טרנסממברנליים, שלכל אחד מהם תחומי קישור מיוחדים מאוד והשפעות איתות במורד הזרם. ביטוי דינמי של קולטני אינטגרין על פני תא T מאפשר הסתגלות מהירה לסביבתם המשתנה3. חשוב לציין, אינטגרינים מחברים את רשתות האקטין ECM והאקטין הציטו-שלד התוך-תאי שפועלות יחד כדי ליצור את כוח ההנעה הדרוש לתנועת תאי T.
לסיכום, דפוסי ההגירה משתנים בהתאם לפנוטיפ של תא החיסון או לאותות סביבתיים. תהליכים ביולוגיים מורכבים אלה מווסתים היטב על ידי ביטוי של ציטוקינים, כימוקינים ואינטגרינים על פני השטח של תא T, התאים הסובבים אותו, והרקמה המקומית הנגועה. In vivo, מנגנוני נדידה אלה יכולים להיות מורכבים ועשויים לנבוע ממספר אותות מוספים4. בשל מורכבות זו, זה יכול להיות בלתי אפשרי לקבוע קשר סיבתי בין משתנים שלובים לכאורה. כדי להתגבר על כך, ישנן מספר גישות במבחנה לחקר היבטים ספציפיים של נדידת תאי T כגון תגובה לאותות כימוקינים ספציפיים והאינטראקציה בין אינטגרינים של תאי T וחלבונים קושרי ECM. פרוטוקול זה מטפל בשיטות לבידוד והפעלה של תאי T מסוג +CD8, עם מבחני נדידת מבחנה במרחב דו-ממדי וכלי ניתוח חישוביים לניתוח נדידת תאי T שצוינו. שיטות אלה מועילות למשתמש מכיוון שהן אינן דורשות חומרים או התקנים מתוחכמים, כמו בכמה מבחני נדידת תאים אחרים המתוארים בספרות. נתוני נדידת תאים הנוצרים בשיטות אלה יכולים לספק ראיות לתגובות חיסוניות באופן פשטני המאפשר חקירה נוספת ומושכלת in vivo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 cm dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353003</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tube</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>339650</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td>without calcium and without magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate non-TC treated</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3736</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m cell strainer</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>352350</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK lysing buffer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A1049201</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra 6KR centrifuge</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>sorvall 16R with tx400 3655 rotor and bucket</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3148</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTrace Violet</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C34571</td>
			<td>Or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>Sorvall ST 16R</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen (IV)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354233</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DeltaT culture dish .17 mm thick glass clear</td>
			<td>Bioptechs</td>
			<td>04200417C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads Sheep anti-Rat IgG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag 15 Magnet</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12301D</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Easy sep mouse T cell isolation kit</td>
			<td>Stem Cell</td>
			<td>19851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>F2442-500ML</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>10838039001</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td></td>
			<td>http://fiji.sc/</td>
			<td>weblink</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter cubes</td>
			<td>Nikon or Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GK1.5</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15630080</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HQ CCD camera</td>
			<td>CoolSNAP</td>
			<td></td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>http://imagej.nih.gov/ij/h</td>
			<td>weblink</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ automatic tracking plug in</td>
			<td></td>
			<td>http://imagej.net/TrackMate</td>
			<td>weblink</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ manual tracking plug in</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/track.html</td>
			<td>weblink</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-15</td>
			<td>Various</td>
			<td>See Materials</td>
			<td>Medium Recipe: Leibovitz&#8217;s L-15 medium without phenol red (Gibco) supplemented with 1-5 g/L glucose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liebovitz&#39;s L-15 medium, no phenol red</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>21083027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer Lok disposable syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-459</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphocyte separation medium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-072-CI</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M5/114</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11140050</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope heating system</td>
			<td>Okolab</td>
			<td>okolab.com</td>
			<td>Custom designs available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell EZ slide</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>C86024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mojosort mouse CD8+ Na&#239;ve T cell isolation kit</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>480043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse E-cadherin</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>8875-EC-050</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse surgical dissection kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-820-096</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS elements</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>non-TC 24wp</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353047</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R9</td>
			<td>Various</td>
			<td>See Materials</td>
			<td>Medium Recipe: RPMI 1640x supplemented with 10 % FBS, 1 % antibiotic-antimycotic (Gibco), 20 mM HEPES buffer (Gibco), 1 % MEM Non-Essential Amino Acids (Gibco), 50 &#956;M &#946;-mercaptoethanol (Sigma-Aldrich)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant mouse ICAM-1 Fc chimera</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>796-IC-050</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse IL2</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>575410</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640x</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11875093</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T pins</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S99385</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE2000-U microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Various recombinant mouse chemokine</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td></td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VCAM-1 Fc chimera</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>643-VM-050</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time in vitro migration assay for primary murine cd8+ t cells

התגובה החיסונית הנרכשת מסתמכת על יכולתו של תא T לנדוד דרך דם, לימפה ורקמות בתגובה לפתוגנים ולגופים זרים. נדידת תאי T היא תהליך מורכב הדורש תיאום של קלטי אותות רבים מהסביבה ומתאי מערכת החיסון המקומית, כולל כימוקינים, קולטני כימוקין ומולקולות הידבקות. יתר על כן, תנועתיות תאי T מושפעת מרמזים סביבתיים דינמיים, שיכולים לשנות את מצב ההפעלה, נוף השעתוק, ביטוי מולקולות ההיצמדות ועוד. In vivo, המורכבות של גורמים אלה השלובים לכאורה זה בזה מקשה להבחין באותות בודדים התורמים לנדידת תאי T. פרוטוקול זה מספק שורה של שיטות מבידוד תאי T ועד ניתוח בעזרת מחשב כדי להעריך נדידת תאי T בזמן אמת בתנאים סביבתיים ספציפיים ביותר. תנאים אלה עשויים לעזור להבהיר מנגנונים המווסתים את הנדידה, לשפר את הבנתנו את הקינטיקה של תאי T ולספק ראיות מכניסטיות חזקות שקשה להשיג באמצעות ניסויים בבעלי חיים. הבנה עמוקה יותר של האינטראקציות המולקולריות המשפיעות על נדידת תאים חשובה לפיתוח טיפולים משופרים.

T cells are the major effectors of the adaptive, antigen-specific immune response. On a population level, T cells are heterogeneous, comprised of cellular subsets with distinct specialized functions. Importantly, CD8+ T cells are the main cytolytic effectors of the immune system, which directly eliminate infected or dysfunctional cells1.
Mature CD8+ T cells reside in tissue and circulate through blood and lymphatics in search of antigens. During infection, T cells are presented with antigens in blood or tissue and quickly drain to the spleen or nearest draining lymph node to begin a productive immune response. In either case, T cells become activated, undergo clonal expansion, and leave the lymphatic system to enter the blood, if not already there. During this process, intracellular signaling confers the downregulation of lymphatic homing receptors and the upregulation of numerous integrin and chemokine receptors essential for tissue-specific migration2. Ultimately, the directed migration of T cells to sites of infection is driven by converging environmental signals that include integrin and chemokine signaling.
Chemokines can be broadly categorized into two main classes: (1) homeostatic signals, which are essential for differentiation, survival, and basal function, and (2) inflammatory signals, such as CXCL9, CXCL10, and CCL3, which are required for chemotaxis. Generally, chemokines create a signal gradient that drives directional migration, known as chemotaxis, in addition to activating integrin expression1. Chemotaxis is finely regulated and highly sensitive, with T cells capable of responding to tiny changes in gradient that can lead them toward a specific direction or location.
In addition to these T cell-related factors, migration is also affected by the extracellular matrix (ECM) composition and density. The ECM is made up of a dense network of proteins, including collagen and proteoglycans, which provide the scaffold for adhesive integrin receptors on T cells. Integrins are a diverse family of transmembrane proteins, each with highly specialized binding domains and downstream signaling effects. Dynamic expression of integrin receptors on the surface of a T cell enables quick adaptation to their changing environments3. Importantly, integrins connect the ECM and intracellular cytoskeletal actin networks that work together to generate the propelling force required for T cell movement.
In summary, migration patterns vary based on the immune cell phenotype or environmental signals. These complex biological processes are tightly regulated by the expression of cytokines, chemokines, and integrins on the surface of the T cell, surrounding cells, and the local, infected tissue. In vivo, these migratory mechanisms can be&#160;complex and may result from several additive signals4. Due to this complexity, it can be impossible to establish a causal relationship between seemingly interlocked variables. To overcome this, there are several in vitro approaches to study specific aspects of T cell migration such as response to specific chemokine signals and the interaction between T cell integrins and ECM binding proteins. This protocol addresses methods to isolate and activate murine CD8+ T cells, with in vitro migration assays in two-dimensional space and computational analysis tools for analyzing specified T cell migration. These methods are advantageous to the user because they do not require sophisticated materials or devices, as with some other cell migration assays described in the literature. Cell migration data generated with these methods can&#160;provide evidence of immune responses in a simplistic manner that enables further, informed investigation in vivo.

מחבר זרקור: הבנת מנגנוני מחלה באמצעות ניתוח בזמן אמת של נדידת תאי T

בדיקת הגירה חוץ גופית בזמן אמת עבור תאי T ראשוניים מסוג +CD8

The goal of our research is to understand T cell migration patterns in highly defined environmental conditions to enable informed in vitro experimentation and decipher molecular interactions impacting migration. Live imaging, such as intravital multiphoton microscopy, is used for in vivo understanding of immune cell kinetics. But microfluidic devices are a common in vitro tool that offer precise control over the microenvironment that cannot be afforded in a live specimen.Our protocol allows us to analyze intricate signaling pathways and provides better understanding for targeted in vitro experiments to further address the biological roles of individual signals in a cell type specific manner. Our method is simple, reproducible and easy to access in research labs that have a brightfield microscope featuring an attached digital camera. Therefore, our approach ensures a reliable set of methods to study dynamic cell migration events.Our lab will focus on investigating the migration of immune cells, including T cells and neutrophils in a variety of disease settings, such as tumors and infection, thereby comprehending the mechanisms that are important to regulate immune cell migration. This will help in developing the therapeutic methods to help treat and prevent disease.

אישור להפעלת תאי T יכול להיות מושג על ידי ציטומטריית זרימה, המחפשת ביטוי מוגבר של CD69 ו- CD44, שהם סמנים קנוניים של הפעלה בתאי T מורין6. בנוסף, ניתן לקבוע את טוהר אוכלוסיית תאי T על ידי ציטומטריית זרימה עבור תאי CD3+ CD8+ T. שיטה זו מניבה >90% אוכלוסיית תאי CD8+ T.
<p class="jove_cont...

פרוטוקול זה מספק שיטה של בידוד תאי T ראשוניים ומיקרוסקופ בהילוך מהיר של נדידת תאי T בתנאים סביבתיים ספציפיים עם ניתוח כמותי.

The adaptive immune response is reliant on a T cell&#39;s ability to migrate through blood, lymph, and tissue&#160;in response to pathogens and foreign ...

מטרת המחקר שלנו היא להבין דפוסי נדידת תאי T בתנאים סביבתיים מוגדרים מאוד כדי לאפשר ניסויים מושכלים במבחנה ולפענח אינטראקציות מולקולריות המשפיעות על הגירה. הדמיה חיה, כגון מיקרוסקופ מולטיפוטון תוך-חיוני, משמשת להבנה in vivo של קינטיקה של תאי מערכת החיסון. אבל התקנים מיקרופלואידים הם כלי מבחנה נפוץ המציעים שליטה מדויקת על המיקרו-סביבה שלא ניתן להרשות לעצמה בדגימה חיה.הפרוטוקול שלנו מאפשר לנו לנתח מסלולי איתות מורכבים ומספק הבנה טובה יותר לניסויים ממוקדים במבחנה כדי להמשיך ולטפל בתפקידים הביולוגיים של אותות בודדים באופן ספציפי לסוג התא. השיטה שלנו פשוטה, ניתנת לשחזור וקלה לגישה במעבדות מחקר בעלות מיקרוסקופ שדה בהיר הכולל מצלמה דיגיטלית מחוברת. לכן, הגישה שלנו מבטיחה מערך אמין של שיטות לחקר אירועי נדידת תאים דינמיים.המעבדה שלנו תתמקד בחקירת נדידת תאי מערכת החיסון, כולל תאי T ונויטרופילים במגוון מצבי מחלה, כגון גידולים וזיהומים, ובכך להבין את המנגנונים החשובים לוויסות נדידת תאי מערכת החיסון. זה יעזור בפיתוח שיטות טיפוליות כדי לסייע בטיפול ומניעת מחלות.

real-time-in-vitro-migration-assay-for-primary-murine-cd8-t-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Real-Time In Vitro Migration Assay for Primary Murine CD8+ T Cells

739 Views.  University of Rochester. מטרת המחקר שלנו היא להבין דפוסי נדידת תאי T בתנאים סביבתיים מוגדרים מאוד כדי לאפשר ניסויים מושכלים במבחנה ולפענח אינטראקציות מולקולריות המשפיעות על הגירה. הדמיה חיה, כגון מיקרוסקופ מולטיפוטון תוך-חיוני, משמשת להבנה in vivo של קינטיקה של תאי מערכת החיסון. אבל התקנים מיקרופלוא?...

Video: מחבר זרקור: הבנת מנגנוני מחלה באמצעות ניתוח בזמן אמת של נדידת תאי T

The adaptive immune response is reliant on a T cell&#39;s ability to migrate through blood, lymph, and tissue&#160;in response to pathogens and foreign bodies. T cell migration is a complex process that requires the coordination of many signal inputs from the environment and local immune cells, including chemokines, chemokine receptors, and adhesion molecules. Furthermore, T cell motility is influenced by dynamic surrounding environmental cues, which can alter activation state, transcriptional landscape, adhesion molecule expression, and more. In vivo, the complexity of these seemingly intertwined factors makes it difficult to distinguish individual signals that contribute to T cell migration. This protocol provides a string of methods from T cell isolation to computer-aided analysis to assess T cell migration in real-time&#160;under highly specific environmental conditions.&#160;These conditions&#160;may help&#160;elucidate mechanisms that regulate migration, improving our&#160;understanding of T cell kinetics and providing&#160;strong mechanistic evidence that is difficult&#160;to attain through animal experiments. A deeper understanding of the&#160;molecular interactions that impact cell&#160;migration is important to develop improved therapeutics.

This protocol providesa method of primary murine T cell isolation and time-lapse microscopy of T cell migration under specific environmental conditions with quantitative analysis.