Nossa pesquisa está centrada em nossas mangas de expansão intestinal e mangas de expansão vaginal, que fornecem uma força distraída que demonstrou alongar significativamente os canais intestinais e vaginais. Esperamos otimizar nossos dispositivos com a adição de terapias baseadas em proteínas para ajudar a minimizar a inflamação e fibrose locais após a implantação desses dispositivos. Ao ligar esses agentes terapêuticos diretamente aos nossos dispositivos, podemos contornar a necessidade de administração sistêmica direcionada diretamente às nossas áreas de interesse com uma dose localizada.
Essa localização permitirá uma dosagem mais baixa do medicamento, diminuindo o risco de efeitos colaterais sistêmicos e também diminuindo o custo dos tratamentos. No futuro, queremos determinar a taxa de liberação dessas terapias baseadas em proteínas que estão ligadas aos nossos dispositivos revestidos com PVA, que serão necessários para determinar as dosagens de medicamentos para diferentes tipos de tratamentos. Para começar, prepare a solução de álcool polivinílico a 5% ou PVA adicionando cinco gramas de PVA em 100 mililitros de água deionizada.
Mexa a mistura em uma placa quente para ajudar na dissolução. Em seguida, prepare um miligrama por mililitro de peptídeo 2 semelhante ao glucagon ou solução de GLP-2 adicionando um miligrama de GLP-2 em um mililitro de água deionizada. Pré-contraia as mangas de expansão intestinal e as mangas de expansão vaginal sobre uma pipeta de vidro, estabilizando as extremidades com pipetas de plástico cortadas bem encaixadas ao redor da pipeta de vidro e das mangas.
Pinte as mangas pré-contraídas com a solução de 5% PVA usando um pincel pequeno. Deixe as mangas secarem em temperatura ambiente por 10 minutos entre cada demão. Quando a quinta demão estiver seca, coloque as mangas pré-contraídas em um desidratado sob uma capa de segurança química.
Adicione três mililitros de glutaraldeído a 25% e três mililitros de ácido sulfúrico de 94 a 98% em copos abertos separados no dessecador para permitir a reação de vapor e reticular as membranas de PVA nas mangas. Após reticulação por 48 horas, remova as mangas da câmara e deixe o glutaraldeído evaporar por 15 minutos. Pipete 50 microlitros de solução de GLP-2 em cada manga reticulada para uso posterior.
Para fazer a curva padrão de GLP-2 ligada ao PVA, pipete 50 microlitros de 5% de PVA no fundo de 18 poços de uma placa de 24 poços. Deixe seis poços em branco para segurar as mangas de expansão intestinal e as mangas de expansão vaginal com três poços para cada tipo de dispositivo. Deixe a camada de PVA secar durante a noite em um forno a 120 graus Celsius.
No dia seguinte, coloque a placa de 24 poços em um dessecador sob uma capa de segurança química. Adicione três mililitros de glutaraldeído a 25% e três mililitros de ácido sulfúrico a 94 a 98% em copos abertos separados dentro do dessecador para permitir a reação de vapor e reticular as membranas de PVA na placa de 24 poços. Após 48 horas de reticulação, remova a placa de 24 poços do dessecador e deixe o glutaraldeído evaporar por 15 minutos.
Em seguida, crie um gradiente de concentração adicionando 250, 150, 25 e zero microlitros de um miligrama por mililitro de solução de GLP-2 em seus respectivos poços marcados. Em seguida, coloque as mangas de expansão intestinal e vaginal revestidas com drogas em seus respectivos poços. Depois de adicionar a respectiva concentração de GLP-2 e mangas de expansão intestinal revestidas com drogas e mangas de expansão vaginal aos poços, refrigere a placa de 24 poços durante a noite a quatro graus Celsius para permitir a ligação do medicamento.
No dia seguinte, adicione dois mililitros de um miligrama por mililitro de leite em pó em uma solução de bloqueio de água deionizada em cada poço por uma hora. Após o bloqueio, lave cada poço três vezes com PBS por cinco minutos por lavagem. Prepare a solução de anticorpo anti GLP-2 de coelho adicionando 40 microlitros de anticorpo anti GLP-2 de coelho em 50 mililitros de água deionizada.
Em seguida, adicione dois mililitros da solução de anticorpos a cada poço da placa. Leve o prato à geladeira durante a noite a quatro graus Celsius. No dia seguinte, lave cada poço três vezes com PBS por cinco minutos por lavagem.
Prepare a solução de anticorpo secundário de fosfatase alcalina IgG anti-coelho adicionando 20 mililitros de anticorpo em 40 mililitros de água deionizada. Adicione dois mililitros da solução de anticorpo secundário a cada poço e incube em temperatura ambiente por duas horas. Depois de lavar os poços com PBS, adicione dois mililitros do substrato de micro poço azul de fosfatase alcalina a cada poço e incube por 20 minutos.
Durante a incubação, monitore a reação à medida que a solução muda de cor de amarelo para azul. Pare a reação pipetando 200 microlitros da solução de cada poço em uma placa de 96 poços rotulada. Leia a placa de 96 poços usando um leitor de microplacas de absorbância em um comprimento de onda de 620 nanômetros.
Gere a curva padrão e calcule a concentração de GLP-2 nas mangas revestidas com PVA. A concentração de GLP-2 dos dispositivos de mangas de expansão intestinal e mangas de expansão vaginal é em média de 22,69 microgramas por centímetro quadrado, semelhante à concentração nos poços de 50 microgramas na placa de 24 poços com 23,7 microgramas por centímetro quadrado.
