Nossa pesquisa aproveita o modelo de peixe-zebra para estudar distúrbios sanguíneos humanos, com foco na identificação de novos biomarcadores, alvos terapêuticos e tratamentos para condições como leucemia. Ao utilizar as vantagens exclusivas do peixe-zebra, pretendemos explorar os mecanismos moleculares subjacentes às doenças hematológicas e desenvolver estratégias terapêuticas inovadoras para melhorar os resultados dos pacientes. A injeção intravenosa em peixe-zebra adulto é um desafio devido ao seu pequeno tamanho e vasculatura complexa.
Desenvolvemos um método otimizado de injeção intravenosa para entrega precisa e eficiente de substâncias ou células em peixes-zebra adultos. Comparado com a injeção intracardíaca e retro-orbital, o método IV que apresentamos aqui resultou em melhor sobrevivência dos peixes e melhor enxerto celular. Este método torna o peixe-zebra adulto mais utilizável para estudos não termo.
Superando alguns limites de novos modelos, a técnica IV aprimorada aumenta a precisão dos modelos de doenças e triagens de medicamentos, ajudando a avançar em novas terapias. Para começar, coloque o peixe-zebra transgênico mpo:EGFP sacrificado em uma mesa de dissecação. Disseque o peixe-zebra para isolar a medula renal.
Em seguida, transfira a medula renal para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro contendo meio de suspensão celular. Pipetar a suspensão para desagregar as células da medula renal. Filtre a suspensão celular através de um filtro de células de nylon de 40 micrômetros.
Em seguida, centrifugue as células a 500 g durante oito minutos e elimine o sobrenadante, antes de voltar a suspender o sedimento em 500 microlitros de meio de suspensão celular. Usando um contador de células automatizado, conte as células com uma alíquota de 10 microlitros. Lave bem a seringa Hamilton três a quatro vezes com etanol a 75%.
Em seguida, enxágue a seringa três a quatro vezes com água ultrapura para garantir que todos os resíduos de etanol sejam removidos. Depois de administrar anestesia ao peixe-zebra, confirme a profundidade da anestesia pela diminuição do movimento e perda das respostas reflexas. Posicione o lado dorsal do peixe para cima com a cabeça voltada para a esquerda em papel de seda limpo e úmido para estabilizar para a injeção.
Segure firmemente a seringa de Hamilton e incline a agulha a aproximadamente 45 graus em relação à veia caudal. No caso do peixe-zebra Casper, apontar para uma secção visível do recipiente através do corpo translúcido. Insira suavemente a agulha no recipiente e administre dois microlitros de células inteiras da medula renal isoladas do peixe-zebra transgênico mpo:EGFP.
Após a injeção, aplique uma leve pressão no local da injeção com um cotonete por 10 segundos para controlar o sangramento. Observe o peixe-zebra injetado ao microscópio para confirmar os sinais de GFP dentro do recipiente. Deixe o peixe-zebra injetado se recuperar em água de peixe recém-esterilizada por 10 minutos.
Em seguida, transfira o peixe para um tanque estático. O método de injeção intravenosa produziu a maior taxa de sucesso com sinais de GFP visíveis em 41 de 43 peixes. Enquanto o método retro-orbital teve GFP detectado em apenas três dos 37 peixes e o método intracardíaco mostrou sucesso em 11 dos 40 peixes.
O método de injeção intravenosa resultou em melhores taxas de sobrevivência nos peixes injetados, especialmente com doses celulares mais altas em comparação com os métodos retro-orbital e intracardíaco. Os sinais de GFP foram detectados no terceiro dia após o transplante em peixes injetados intravenosos, enquanto os métodos retroorbitais e intracardíacos mostraram início tardio do sinal de GFP. No dia 17, os peixes injetados intravenosos exibiram os sinais de GFP mais proeminentes na medula renal.
A citometria de fluxo da medula renal mostrou cerca de 18% de células positivas para GFP em peixes injetados por via intravenosa com três vezes 10 elevado à potência de cinco células alinhadas com os níveis de GFP na medula renal do doador. Em contraste, os métodos intracardíaco e retro-orbital mostraram 5% e 2% de células positivas para GFP, respectivamente.
