Esses métodos foram utilizados para desenvolver o primeiro modelo de zebrafish de metástase neuroblastoma. E para demonstrar que esse modelo pode recapitular fielmente muitas características da metástase observadas em pacientes com alto risco de neuroblastoma. A principal vantagem desse modelo metastático de zebrafish é a imagem in vivo em tempo real da disseminação do tumor para entender melhor quando, e possivelmente como a metástase ocorre.
Esta técnica não é específica para neuroblastoma. Pode ser aplicado a modelos de zebrafish de diversos tipos de câncer, desde que as células tumorais possam ser identificadas e rastreadas levando a uma série de possibilidades. Para começar, desenvolva uma linha de peixes transgênicos heterozigosos que expresse tanto MYCN quanto LMO1, intercalando linhas transgênicas MYCN e LMO1.
Em um dia pós-fertilização, use um microscópio de fluorescência estereoscópica para classificar a progênidade do outcross para a expressão EGFP, que apresenta como pontos positivos EGFP. Após a classificação, isole embriões selecionados em pratos Petri separados e rotule pratos como MYCN positivo ou MYCN negativo. Visualize e classifique embriões de ambos os grupos para expressão LMO1 de três a quatro dias após a fertilização.
Procure por manchas de fluorescência vermelha tanto no gânglio cervical superior quanto nas células neuronais não PSNS dopaminérgicas, especialmente na medula oblongata do cérebro traseiro. Realize a triagem antes que os embriões atinjam cinco dias após a fertilização. Em seguida, isole os peixes classificados em quatro grupos de genótipos diferentes e rotule apenas como MYCN, somente LMO1, MYCN e LMO1, ambos e tipo selvagem.
Elevá-los em condições idênticas de acordo com os protocolos padrão. Visualize tumores com um microscópio de fluorescência estereoscópica lançando peixes suavemente com uma espátula metálica em ambos os lados laterais para ver o tumor. Após a identificação do possível peixe portador de tumor, isole-os em um tanque separado com rótulos apropriados que incluem a data de nascimento, data em que o tumor foi examinado e genótipo.
Com seis semanas após a fertilização, repita etapas anteriores para a triagem de peixes portadores de tumores e peixes sem tumores para confirmar a presença de tumores para peixes previamente examinados ou identificar novos possíveis peixes portadores de tumores. Procure o tamanho sustentado ou aumentado da massa positiva da fluorescência e peixes com tumor confirmados. Depois de identificar peixes portadores de tumores, monitore-os quinzenalmente para obter evidências de migração de células tumorais, que apresentam como pequenas massas tumorais EGFP ou mCherry positivas longe do local principal da gênese tumoral.
Isole esses peixes em tanques separados conforme necessário e rotule adequadamente para indicar possíveis metástases. Depois de interpretar o HEterozigos MYCN em peixes LMO1, e ao classificar sua descendência, a expressão EGFP MYCN foi proeminente nas células neuronais não PSNS dopaminérgicas em um dia após a fertilização. Em contraste, a expressão LMO1 foi proeminente em ambas as células PSNS e células neuronais não PSNS.
Massas tumorais positivas fluorescentes foram detectadas em tecidos em órgãos, distantes do local do tumor primário no composto de peixes transgênicos com superexpressão tanto do MYCN quanto do LMO1, mas não apenas nos peixes transgênicos com a expressão de MYCN. A coloração de H&E das seções cirúrgicas mostra que o tumor primário surgiu da região da glândula interrenal, o equivalente a zebrafish da glândula suprarrenal humana que é o local mais comum da doença primária no paciente neuroblastoma. Massas tumorais distantes da glândula interrenal foram detectadas em várias regiões, incluindo a porção distal do rim, órbita, brânquia, baço e a parede interna da câmara atrial do coração.
A linhagem neuroblasto do PSNS de células tumorais no tumor primário e todos os locais metastáticos foi confirmada. Quantidades significativamente amplificadas e aumento da espessura das fibras de colágeno manchadas de PSR foram encontradas em tumores MYCN LMO1 quando comparados com os tumores que expressam apenas MYCN. Após o uso desse procedimento, podem ser aplicadas terapias de rastreamento e teste de novos cânceres, o que pode potencialmente levar ao desenvolvimento de agentes alternativos para prevenir e tratar cânceres metastáticos.
