Os autores gostariam de agradecer a Miriam Ester para reprodução do mosquito. Este trabalho foi apoiado por in-house financiamento do Centro de Pesquisa Borstel e juntou-se o financiamento pelo Infecção Leibniz Center.

Medidas de segurança e Declaração de Ética Os estudos aqui apresentados envolvem trabalho com o patógeno humano Mtb eo parasita de roedores malária Plasmodium berghei (P. berghei). Experimentos com Mtb (H37Rv) e P. berghei deve ser realizado sob as condições de biossegurança adequadas. Nível de Biossegurança (BSL) 2 laboratórios são necessários para os parasitas da malária de roedores, tais como P. berghei e BSL 3 para Mtb e, portanto, para todos os estudos co-infecção aqui descrito. NOTA: Ratos infectados com Mtb não espalhar a infecção para outros ratos dentro imediações (a nossa própria observação). Espalhe para o experimentador pode, portanto, ser excluído, roupas de proteção, porém, adequado tem que ser usado dentro do laboratório BSL 3 em todos os momentos. De acordo com nossas regras, os pesquisadores usam aventais cirúrgicos, redes de cabelo, respiradores descartáveis, e dois pares de luvas, dos quais o exterior é descartado sempre que umrms são retirados do gabinete. Os novos são colocados em antes de entrar no gabinete novamente. Dois recipientes, um com 2% Buraton (NOTA: outros desinfectantes aprovados para inativar Mtb podem ser usados ​​na concentração aprovado) para o material de resíduos líquidos e infecciosa e uma para a descontaminação de superfícies, são preparados antes do experimento e colocado dentro do armário. Além disso, os sacos de plástico será utilizada para os resíduos sólidos não infecciosa. De acordo com a legislação alemã, todo o trabalho que envolve a manipulação e processamento de culturas Mtb ou tecidos derivados de Mtb camundongos infectados devem ser realizadas em uma cabine de segurança biológica de classe 2, dentro de um laboratório BSL3. Durante o manuseio de micobactérias, medidas têm que ser tomadas para evitar a geração de aerossóis em todos os momentos. Fêmea C57BL / 6 (Charles River) com idades entre 6-8 semanas foram utilizados para todas as experiências de co-infecção e mantidas sob condições de barreira específicas em instalações BSL 3. Cuidados com os animais e experimentação foram performed de acordo com os protocolos aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal do Ministério da Agricultura, Meio Ambiente e Meio Rural do Estado de Schleswig-Holstein Para a obtenção de estágios do mosquito da malária, os camundongos NMRI foram adquiridos da Charles River Laboratory, Sulzfeld, Alemanha e mantidos em condições livres de patógenos específicos dentro do biotério da Universidade de Heidelberg (IBF). Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com os regulamentos europeus e aprovado pelas autoridades estaduais de Baden-Württemberg (Regierungspräsidium Karlsruhe). 1. Aerosol infecção de camundongos com Mtb usando um aerossol Câmara Glas-Col A melhor maneira de padronizar infecção aerossol de animais experimentais com Mtb é usar micobactérias de estoques congelados com títulos UFC conhecidos. Para preparar culturas de cultura em caldo Middlebrook Mtb 7H9 suplementado com OADC (oleicoácido, Albumina, dextrose, catalase) enriquecimento médio e 0,05% Tween 80, uma fonte de carbono para micobactérias e medir a fim de evitar a aglutinação bacteriana, ao mesmo tempo. As culturas devem ter um ≤ OD 1 na altura da colheita. Na maior OD, aumenta aglomeração bacterianas e diminuições de viabilidade. Armazenar aliquotas de 1 mL a -80 ° C. Determinar o número de unidades formadoras de colônia viável (UFC) nos estoques congelados por chapeamento de uma série de diluições de 10 vezes de três frascos independentes sobre 7H11 placas de ágar, suplementado com 0,5% de glicerol, 1 g / L de asparagina, e OADC e enumerar colônias após 4 semana de incubação a 37 ° C. Realizar infecção por aerossol, tal como descrito abaixo. <ol><li> Estoques Thaw de BTT de título conhecido UFC e cuidadosamente misturar a suspensão de cinco vezes para dispersar aglomerados de bactérias usando uma seringa de 1 ml equipado com uma agulha G 27. Evitar a produção de aerossóis. </li><li> Dependendo da dose de infecção desejada, transferir o volume necessário de estoque em micobactériasum tubo de 50 ml contendo PBS esterilizado. O volume final é de 6 ml. NOTA: Através da variação do número de microrganismos em suspensão, a percentagem de bactérias rolamento gotículas de aerossol é variada. Nós geralmente visam uma absorção de 100 bacilos viáveis ​​por pulmão (infecção de baixa dose). Na nossa experiência, este requer cerca de 1-2 x 10 6 / ml de M. tuberculosis em um volume total de 6 ml de 5,5 ml que são nebulizadas (ver abaixo). Recomenda-se a fazer uma série de desafios em aerossol experimentais com diferentes concentrações de bactérias para encontrar as condições ideais para a sua infecção. Considerando que as infecções com altas doses de até 5.000 micobactérias pode ser feito para acelerar o processo infeccioso, tão poucos como cinco bactérias pode ser utilizado com êxito para infectar ratos por aerossol. A taxa de infecção é geralmente 100%. </li><li> Retirar um volume suficiente (preparado em excesso de volume final obrigatório) para chapeamento para determinar o título de inóculo; normalmente remover 500 mL de placa triplicatas técnicas. </li><li> Colocar animais emuma cesta compartimentado malha (um rato por cesta) dentro da câmara de aerossol circular e feche a tampa da câmara de aerossol. NOTA: Outros modelos estão equipados com uma cesta em forma de torta composta por cinco compartimentos individuais, cada uma com capacidade de 20 ratos. </li><li> Fixe a unidade Venturi-nebulizador para as três articulações soquete de aço inoxidável. </li><li> Retirar a suspensão de micobactérias a partir do tubo de 50 mL com uma seringa de 10 ml, equipado com uma agulha romba de 18 G, e transportar a seringa para a câmara de aerossol numa caixa de transporte fechado. </li><li> Retire a tampa de rosca da unidade nebulizador e cuidadosamente injetar a suspensão micobactérias no nebulizador. Evite a geração de aerossóis. Descarte a seringa em um recipiente apropriado contendo 2% Buraton. Selar o nebulizador com a tampa de rosca. </li><li> Ligue o interruptor de alimentação principal e da lâmpada UV. O visor do teclado de controle mostra &quot;Glas-Col Aparelho Co&quot;. </li><li> Ligue o interruptor de programa por diante. A vontade de exibiçãomostrar &quot;é o nebulizador está pronto?&quot; &quot;É o cesto carregado?&quot; Pressione Enter quando estiver pronto &quot;. Pressione Enter. </li><li> O visor mostra &quot;Enter Pré-aqueça o Tempo 900&quot;, o que significa que o tempo de pré-aquecimento para o incinerador (que descontamina o ar escape) é de 900 segundos. Pressione Enter. </li><li> O display mostrará &quot;Enter tempo Nebulizing 1800&quot;, o que significa que o tempo de nebulização está definido para 1.800 sec como padrão. A fim de estender o tempo de nebulização, digite &quot;2400&quot; e pressione enter. NOTA: Durante o ciclo de nebulização, ar sob pressão atomiza a suspensão, gerando pequenas gotículas de aerossol contendo micobactérias. Com o fluxo de ar principal, estas gotículas (cerca de 2-5 mM de tamanho) são transportadas para a câmara de aerossol. </li><li> O display irá mostrar &quot;Enter Time CD 1800&quot;, o que significa que o ciclo de decadência leva 1.800 sec. Ajuste para &quot;2400&quot; e pressione enter. NOTA: Durante este ciclo, a nuvem que foi construído up na câmara de aerossol durante o ciclo de nebulização pode decair. As pequenas gotículas são inaladas pelos animais experimentais. </li><li> O display irá mostrar &quot;Enter Time dezembro 900&quot;, o que significa que o ciclo de luz UV descontaminação terá 900 segundos. Pressione Enter. A máquina começará a andar de bicicleta através de pré-aquecimento, nebulização, decadência nuvem e descontaminação UV. CUIDADO: O medidor de fluxo de vácuo deve indicar 60 pés cúbicos / hora (verifique quando o ciclo de pré-aquecimento começa, ajuste a válvula de controle de vácuo, se necessário) eo medidor de fluxo de ar comprimido de 10 metros cúbicos / hora (verificar na nebulização começa ciclo; ajuste a válvula de controle de ar de acordo ). </li><li> Quando o ciclo está completo, o teclado irá mostrar &quot;Processo concluído - Retire Specimen&quot;. Desligue o programa, UV e interruptor principal. </li><li> Verificar se a suspensão de micobactérias foi nebulizada completamente e se não, registrar o volume restante, removendo cuidadosamente a suspensão com uma seringa apropriada equipada comuma agulha romba 18 G. O volume restante não deve ser superior a 1 ml. </li><li> Remover o nebulizador das articulações e colocá-lo em uma panela contendo 2% Buraton durante um mínimo de 2 horas, geralmente de desinfecção é feito S / N. Em seguida, transferir o nebulizador para uma nova panela e enxaguar bem com água. Deixe nebulizador para ar seco. </li><li> Abrir a câmara de aerossol e devolver os animais para as suas gaiolas. Saco dos cestos em sacos de autoclave e manter. Limpe as superfícies do interior da câmara de aerossol com 2% Buraton NOTA:. Por razões de segurança, um respirador purificador de ar motorizado deve ser usado durante este procedimento. </li><li> Usando os restantes 500 ul da suspensão de micobactérias (ver passo 1.3) da placa de diluições de 10 vezes de uma técnica triplicado (3 x 100 ul) em placas de ágar 7H11. </li></ol> 2. Verifique Captação de UFC desejado em Pulmões Um dia após infecção por aerossol de animais experimentais determinar o lo bacterianaanúncio nos pulmões de animais de controle designados, a fim de verificar a absorção do UFC desejado. NOTA: Nós geralmente designa um grupo extra de 3-5 camundongos para o dia 1 determinação UFC. Para monitorizar o curso da infecção por M. tuberculosis ao longo do tempo, o peso do tecido de micobactérias podem ser examinadas por plaqueamento de diluições em série de homogeneizados de órgãos inteiros para a determinação de CFU. O pulmão é o principal local para a manifestação da doença em tuberculose no entanto baço, fígado e linfonodos são geralmente analisadas em conformidade. As diluições para ser plaqueadas depender da carga micobacteriana esperado nos órgãos, que dependem do inoculo inicial (dose baixa versus dose elevada), o que dá origem a diferentes cargas bacterianas em tecido, assim como sobre o órgão e ponto de tempo para ser analisado. Após a infecção dose baixa, a carga bacteriana de Mtb H37Rv no pulmão geralmente atinge um patamar entre o dia 25-30. <ol><li> Coloque animais sacrificados (eutanásia: CO 2 asfixia ouanestesia terminal) em papel absorvente em uma placa de dissecação em uma cabine de segurança biológica classe II e desinfectar ratos com etanol 70%. NOTA: álcool 70% é apenas para a descontaminação de superfície e não vai matar Mtb. </li><li> Fazer uma pequena incisão no meio do abdómen e retrair a pele do rato por cima da cabeça. </li><li> Abra o abdômen e caixa torácica, com uma tesoura cirúrgica e retirar da parede torácica para que os pulmões estão acessíveis. </li><li> Retirar os pulmões e transferir para um tubo de 15 ml com tampão de homogeneização (água estéril / 1% v / v de Tween 80/1% w / v de albumina). </li><li> Usando o êmbolo de uma pulmões 5 ml de deformação da seringa através de 100 mM peneiras numa pequena placa de Petri. </li><li> Lave peneiras várias vezes utilizando uma pipeta 1 ml equipado com uma ponta de barreira e distribuem o homogeneizado de pulmão entre 8 placas de agar (cerca de 250 mL / placa;. Verifique se eles têm uma superfície bem seca). </li><li> Placa cuidadosamente as amostras usando espalhadores descartáveis ​​que são rejeitados em 2%Buraton. </li><li> Deixe placas de ágar para secar dentro do gabinete. Seal cada prato único com parafilme, embrulhe em papel alumínio e incubar na vertical a 37 ° C durante pelo menos 4 semanas. </li></ol> 3. Construção de Gaiolas Mosquito à prova de escape Linhagens de roedores Plasmodium não são prejudiciais aos seres humanos. No entanto, uma vez que camundongos infectados com Mtb são os destinatários do parasita eo trabalho é feito sob BSL 3 condições, precauções são necessárias para evitar que os mosquitos de escapar suas gaiolas. Dependendo do regime de infecção planejado, autoclave e gaiolas de metal com estrutura ou gaiolas descartáveis ​​self-made reutilizáveis ​​podem ser utilizados. Estas últimas são recomendadas se por infecção aguda de animais experimentais é necessário para ser realizado por um número definido de mosquitos por ratinho. Se forem necessárias gaiolas self-made, prepare gaiolas com as especificações exatas como a saúde dos mosquitos e da segurança do laboratório depende da sua sound construção (Figura 2). <ol><li> Pegue uma caixa de papelão, como um meio-litro de sorvete caixa ou copo de café de papel (Figura 2). </li><li> Cortar uma pequena abertura para dentro do lado da caixa de cartão e cobrir com uma camada dupla de látex com uma fenda cortada em cada pedaço para criar uma entrada de segurança para os mosquitos. NOTA: A abertura tem um tamanho total de 2 cm x 2 cm, o tubo (dispositivo de aspiração) que usamos para trazer e / ou take-out mosquitos é um tubo de 15 ml Falcon modificado ligado a uma bomba de vácuo e, portanto, serve como um aspirador, com um diâmetro de 1,5 cm. </li><li> Cole um pedaço de papel de filtro na parte inferior interna da caixa para absorver gotas. </li><li> Feche fora taças de sorvete com rede (dupla camada de malha de nylon, tamanho 1 mm x 1 mm) e fixar a caixa com fita e elástico. </li><li> Para as experiências de infecção onde são necessários números definidos de mosquitos por ratinho, preparar gaiolas com mosquitos infectados 10-15, cada uma das quais contém uma idealmente avtura de 10.000 do tipo selvagem glândula salivar P. esporozoítos berghei. </li><li> O ideal é que morrer de fome mosquitos para 24 horas antes de realizar a refeição de sangue. </li></ol> 4. Infecção por malária de Ratos por picada de mosquito O parasita da malária de roedores aqui utilizado é P. berghei no entanto qualquer outra estirpe de Plasmodium de roedor de interesse pode ser utilizado. Para obter os mosquitos infecciosos para a transmissão de esporozoítos de todo o ciclo de vida do parasita seja mantida tanto no hospedeiro vertebrado (rato) e o vector mosquito. Manutenção parasita é realizada num insectary. Para as experiências de transmissão natural, o número mínimo de esporozoítos por glândula salivar não deve ser inferior a 10.000. Para protocolos detalhados sobre a manutenção do parasita nos referimos Métodos em Malaria Research por Moll et al., 2013. <ol><li> Anestesiar ratos ou animais preinfected por 40 dias com Mtb com Ketamina ingênuos (100 mg / kg)solução e Xilazina (7 mg / kg) por injecção intraperitoneal (200 ul / ratinho). NOTA: O tempo entre a infecção pelo Mtb e Plasmodium pode ser ajustado de acordo com a questão de pesquisa subjacente. Da mesma forma, a fim de desafios de agentes patogénicos pode ser invertida, isto é, os ratos podem ser expostos a infeccioso picada de mosquito antes da infecção por M. tuberculosis. </li><li> Coloque os ratos anestesiados para a compensação das gaiolas de mosquitos (um rato por gaiola mosquito para mosquito definido para relação de rato) e permitir que os mosquitos se alimentar através da membrana por 10-15 min. NOTA: A presença de sangue nas vísceras de mosquito de alimentação e implica portanto, a transmissão de esporozoítos. </li><li> Transferir ratos de volta para suas gaiolas e supervisionar constantemente até que eles acordam da anestesia. Nota: Coloque camundongos sobre toalha de papel e não na cama (perigo de asfixia) e manter aquecido (local juntos e cobrir corpos com toalha de papel). </li><li> Matar os mosquitos de pulverização com 70% de etanol ou outros desinfectantes através do nettção da gaiola. Gaiolas autoclave e descartar se foram utilizadas as descartáveis. </li></ol> 5. Monitoramento parasitemia <ol><li> Punção veias da cauda no final do percurso com uma agulha e recolher uma gota de sangue em cada extremidade de uma lâmina. </li><li> Use outro slide para puxar uma gota de sangue sobre a metade do comprimento da lâmina. Vire o espalhador de usar a outra ponta para o segundo esfregaço. Deixe slides para ar seco. </li><li> Giemsa <ol><li> Colocar as lâminas em suportes de lâmina e fixar os esfregaços de sangue por breve imersão em metanol absoluto. NOTA: Como o uso de utensílios de vidro devem ser mantidos no mínimo no BSL 3 usamos tinas de polipropileno para todas as soluções. </li><li> Mergulhe as manchas em Giemsa (1:10 em água deionizada). Após 10 min, mergulhe os slides dentro e fora do tinas de coloração com água deionizada algumas vezes para lavar afastado o excesso de corante. </li><li> Finalmente, as lâminas secas de ar em uma posição vertical. </li></ol></li><li> MANCHA ALTERNATIVA: Wright &amp; #180; s mancha <ol><li> Dissolve-se o corante de Wright, a uma concentração de 1 mg / ml em metanol. </li><li> Filtrar através de um filtro dobrado antes da utilização. </li><li> Mergulhe as manchas de sangue em solução de coloração e incubar por 4 min (Nota: a fixação de esfregaços metanol não é necessário que a solução de coloração é o metanol com base). </li><li> Lavar por lâminas de enxaguamento em água desionizada, como descrito acima e deixar as lâminas de ar seco. </li><li> Uma vez que mancha Giemsa / &#39;s Wright está completa, gentilmente transferir todos os reagentes utilizados em um pote contendo Buraton disposição. </li></ol></li><li> Análise esfregaço de sangue <ol><li> Analisar esfregaços de sangue corados por microscopia de luz com uma ampliação de 100 vezes, com imersão em óleo. </li><li> Contagem eritrócitos não infectados e infectados em uma área do esfregaço de sangue, onde os eritrócitos são dispostos em uma monocamada. </li><li> A fim de alcançar uma parasitemia bem definida, contar pelo menos 10 campos de vista diferentes, que apresentam uma monocamada de eritrócitos. </li><li> CalculComeram a parasitemia relativo (em%) é calculada dividindo o número de eritrócitos parasitados por o número de eritrócitos, e multiplicando por 100. </li></ol></li></ol>

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Os autores não têm nada a revelar.

Nós descrevemos como ratos podem ser produtivamente infectados com Mtb e P. berghei através de suas rotas naturais de infecção. Nós aplicamos estabelecidos protocolos de infecção para estudar a tuberculose ou a malária experimental 13 12 e, recentemente adoptada-los a estudar a co-infecção entre Mtb e Plasmodium no modelo do rato 1. Os passos mais críticos para infecções bem sucedidas são a transmissão de ambos os patógenos para os números desejados. Estoques de micobactérias não deve ser mais de 2 anos, porque eles vão perder a viabilidade ao longo do tempo, eo título originalmente determinado das ações provavelmente não será mais preciso. Como resultado, as doses de infecção seria muito menor do que o esperado. Por isso, os títulos de UFC de culturas de deve ser determinada a cada poucos meses. Igualmente importante é o cultivo padronizado e geração de estoques de Mtb em primeiro lugar. Condições de cultura, tais comomédio, suplementos, tempo e volume devem ser padronizados, a fim de poder comparar os dados de experimentos usando diferentes estoques de Mtb. Micobactérias tendem a aglutinar-se durante a cultura, por isso é importante para manter as condições de cultivo padronizado, as bactérias colheita na mesma fase de crescimento e ressuspender com freqüência durante alíquotas. Caso contrário, pode haver uma grande variação nos títulos de UFC e desfecho infecção. A geração de lotes de mosquitos infectados de forma homogênea é mais um passo crítico. Uma vez que diferentes mosquitos se alimentam de cada ratinho individual, é importante que todos os mosquitos utilizados para um ensaio de infecção vêm do mesmo lote e que apenas os lotes em que mais de 90% dos mosquitos infectados são utilizados. O actual modelo pode ser usado para dissecar as respostas imunes e modulações imunes num hospedeiro co-infectados por comparação com as respostas imunitárias nos hospedeiros infectados individuais. Podemos aplicar various metodologias como histologia, imuno-histoquímica, citometria de análise de populações de células do sistema imunológico, ou PCR e ELISA para detecção de citocinas e quimiocinas no tecido ou fluidos corporais de interesse bem estabelecidos. Deve notar-se, que tais modelos de ratos têm certas limitações. Considerando que a maioria das pessoas infectadas com M. tuberculosis vão desenvolver uma infecção latente, sem sinais de sintomas clínicos, os ratos desenvolvem uma doença crônica com patologia pulmonar progressiva. Ainda, ratinhos C57BL / 6 são relativamente resistentes a infecção por M. tuberculosis e não se desenvolvem os granulomas clássicos como observado em pacientes com tuberculose humana. Como resultado, as reações imunopatológicos no rato nem refletem a doença tuberculose humana latente nem ativo de forma adequada. Apesar da discrepância entre a doença latente e crônica no homem e rato, ratos têm sido amplamente utilizados para identificar e estudar os fatores do hospedeiro que controlam a infecção por M. tuberculosis e que são ferramentas valiosas e indispensáveis ​​para investigarrespostas imunitárias em doenças infecciosas. Importante, a susceptibilidade à infecção por M. tuberculosis varia consideravelmente entre estirpes de ratos consanguíneos comumente utilizados e as estirpes mais sensíveis, tais como DBA ou C3H podem ser incluídas em estudos de co-e com somente uma infecção. Além disso, para além das espécies de agentes patogénicos aqui descritos, quaisquer outras espécies de Mycobacterium de interesse (por exemplo, isolados clínicos) poderia ser utilizado. Da mesma forma, enquanto um modelo único malária reproduz todos os aspectos da doença humana diferentes modelos de ratos que se assemelham muito diferentes aspectos da infecção da malária humana adquirida naturalmente. Por exemplo, P. berghei e P. ANKA yoelii YM/17XL são amplamente modelos de humano (induzida por P. falciparum) malária grave estudada, com P. berghei ANKA ser considerado um excelente modelo para cerebral humano Malari s 14,15. P. berghei NK65 é um excelente modelo para hyperparasitaemia e anemia malária aguda, e tem sido recentementedescrito como um modelo experimental para a síndrome associada à malária do desconforto respiratório agudo (SDRA MA-16). Utilizando o modelo de co-infecção descrito, podemos mostrar que recentemente concomitante P. infecção berghei NK65 agrava a tuberculose crônica 1. Além de usar diferentes parasitas da malária de roedores, a ordem eo tempo dos eventos de infecção podem ser adaptadas de acordo com a questão de pesquisa subjacente. No campo, infecções Plasmodium concomitantes podem estar presentes na altura da infecção por M. tuberculosis ou adquirida posteriormente. Em ambos os cenários das respostas imunes a Mtb e Plasmodium podem ser afetados de forma diferente. Portanto, os ratinhos podem ser infectados com Plasmodium esporozoítos, quer antes ou depois da infecção por M. tuberculosis. Além disso, os ratos podem ser contestadas em diferentes momentos após a infecção Mtb para avaliar o impacto da resposta imune induzida por Plasmodium em aguda contra crônicatuberculose. É importante ressaltar que quando se escolhe um parasita da malária para estudar malária tuberculose co-infecção, deve-se estar ciente de que algumas estirpes de Plasmodium roedores causar doença aguda em certas linhagens de camundongos e sucumbir à infecção dentro de poucos dias ou semanas, enquanto Mtb causa crônica e infecções de longa duração em imunocompetentes ratinhos. Assim, o tempo de co-infecção é fundamental para evitar a morte prematura dos animais experimentais. A modulação da imunidade do hospedeiro por infecção simultânea com várias espécies de patógenos ainda é mal-compreendido. Nosso modelo de co-infecção experimental fornece uma ferramenta poderosa para investigar Mycobacterium - interação Plasmodium com o sistema imunológico de uma série co-infectados e vai contribuir para a nossa compreensão como co-infecções podem afetar a patogênese, evolução da doença, a vacinação, imunodiagnóstico, e terapia.

As populações humanas são raramente exposta a apenas um agente patogénico. Especialmente em regiões com alta incidência de infecções, como a África sub-saariana, co-infecções representam um problema de saúde pública principal, mas altamente subestimada. A tuberculose ea malária são as infecções bacterianas e parasitárias mais prevalentes em seres humanos, respectivamente, e continuam a ser as principais causas de morbidade e mortalidade em populações empobrecidas nos trópicos. Apesar da grande sobreposição geográfica entre a tuberculose ea malária e ao grande número de indivíduos em risco de co-infecção, muito pouco se sabe sobre as interações entre as diversas e, muitas vezes contrariando os reguladores do sistema imunológico e efetores desencadeados simultaneamente contra os parasitas da malária e bacilo da tuberculose em indivíduos co-infectados. Modelos de roedores de infecções mistas permitem caracterizar reações imunes diferenciais contra patógenos diferentes em um host, lançando assim a luz na influência mútuaências modulando patologia e evolução clínica da doença individual, o que também ajudará a identificar novas recomendações para tratamento e prevenção. Nós estabelecemos um modelo experimental do rato que nos permite investigar as ramificações causadas pela infecção concomitante com Mycobacterium tuberculosis (MTB) e as espécies de Plasmodium roedor dentro do mesmo host 1. É importante ressaltar que para emular infecções humanas naturalmente adquiridos, tanto quanto possível, o nosso modelo implementa as rotas naturais de infecção utilizadas por ambos os patógenos. A tuberculose é uma infecção no ar, o que, por conseguinte, se manifesta principalmente nos pulmões. O agente causal, Mtb é transmitida por pessoas com doença ativa por via aerossol quando expelir gotículas de aerossóis infecciosos durante tossir ou espirrar. Assim, a infecção por aerossol é o método de escolha para imitar a infecção natural. Geração de partículas transportadas pelo ar que contêm M. tuberculosis pode ser alcançada através da utilizaçãode um sistema de exposição por inalação. Esta câmara de exposição do corpo inteiro permite expor animais experimentais para Mtb contendo gotículas de aerossóis infecciosos (Figura 1), que se inalada para os alvéolos dos pulmões onde a infecção é iniciada 2. A malária, por outro lado é uma doença transmitida por vetor causada pelo protozoário, apicomplexan parasita Plasmodium, que é transmitido naturalmente pela picada de um mosquito Anofelíneos feminino. Durante a farinha de sangue, esporozoitos infecciosos são depositados sob a pele de acolhimento e subsequentemente atingir o fígado através da corrente sanguínea. Dentro de hepatócitos eles desenvolvem e se multiplicam rapidamente em esquizontes fígado em estágio. Eventualmente, esquizontes maduros rompem e libertam milhares de patogénicos merozóitos de primeira geração para a corrente sanguínea, onde eles iniciam um ciclo progressivo de invasão de glóbulos vermelhos, a replicação, a ruptura dos glóbulos vermelhos, e re-invasão 3. O ciclo de vida do Plasmodium continues como alguns merozoites evoluir para os estágios parasitários sexuais, os gametócitos masculinos e femininos, que podem ser ocupados por mosquitos durante as refeições de sangue. No mosquito, esporozoítos do Plasmodium desenvolver dentro de oocistos que residem no intestino médio do mosquito e, eventualmente, migram para as glândulas salivares para transmissão posterior em outro 3,4 host. Enquanto em modelos animais experimentais da entrega de M. tuberculosis através do aerossol e rota assim mais relevante é muito comum, muitos estudos experimentais de infecção por Plasmodium de roedor, incluindo estudos sobre a malária-tuberculose coinfecção 5-7 foram efectuados através da infecção de ratinhos com eritrócitos parasitados, dando origem à infecção da malária do sangue em estágio, excluindo a fase de fígado em estágio clinicamente silenciosa. No entanto, a fase de fígado é um passo obrigatório durante a infecção e relevantes para a imunidade anti-plasmódio 8-11. Consideramos, portanto, importante para incluir o ph hepáticaase de transmissão e manutenção em estudos de ambos malária e malária tuberculose co-infecção, respectivamente malária. Além disso, tem sido demonstrado que os esporozoítos naturalmente transmissíveis são mais infeccioso do que os que foram transmitidos via infecções agulha 12, o que nos levou a estabelecer a infecção da malária pelo mosquito morder em vez de injetar isolado salivar das glândulas esporozoítos derivados. A única maneira de obter os mosquitos infecciosos para a transmissão natural de parasitas da malária é manter todo o ciclo de vida do parasita, tanto no hospedeiro vertebrado (aqui mouse) eo vetor mosquito. Assim, o acesso a um insetário para a manutenção do parasita é inevitável, a fim de realizar a transmissão natural, através da mordida. Nosso protocolo aqui descrito foi desenvolvido para investigar como a co-infecção com Plasmodium esporozoítos impactos sobre a tuberculose crônica 1. Para fazê-lo, os ratinhos são infectados com M. aerossol tuberculose e 40 dias mais tarde, quando M. infecção por tuberculose atingiu a fase crônica, os ratos são expostos a mosquitos transmissores da malária infecciosa. O resultado de tanto da malária e da tuberculose nos animais co-infectados pode ser seguida monitorizando a parasitemia sanguínea e a carga bacteriana no tecido, respectivamente. Em nosso protocolo, vamos descrever em detalhes como para infectar ratos com ambos os patógenos através de sua rota de infecção natural e como confirmar transmissão de patógenos de sucesso. Em nossas mãos, a taxa de infecção comumente alcançada por ambas as infecções experimentais é 100%. Estes protocolos podem ser aplicados para estudar ambas as infecções separadamente ou, como fazemos, para modelar e estudar a co-infecção entre duas das doenças infecciosas humanas mais difíceis. Este modelo é aplicável a outras espécies de Mycobacterium e de roedores Plasmodium além dos descritos neste protocolo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="650">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Buraton</td>
			<td style="width:124px;">Sch&#252;lke</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:191px;">active ingredients: aldehyds (formaldehyde, glutaraldehyde, oxalaldehyde, ethyl hexanal)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Middlebrook 7H9&#160;</td>
			<td style="width:124px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M0178</td>
			<td style="width:191px;">For Mtb broth cultures</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Middlebrook 7H11&#160;</td>
			<td style="width:124px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">283810</td>
			<td style="width:191px;">Agar medium for Mtb culture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Middlebrook OADC enrichment medium</td>
			<td style="width:124px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">212240</td>
			<td style="width:191px;">Add to 7H9 and 7H11 for Mtb culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Staining Dish</td>
			<td style="width:124px;">Science Services</td>
			<td style="width:119px;">E62542-12</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">24-Slide Holder w/Handle</td>
			<td style="width:124px;">Science Services</td>
			<td style="width:119px;">E62543-06</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Giemsas Azur-Eosin-Methylene blue solution</td>
			<td style="width:124px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:119px;">109204</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Wright&#180;s stain</td>
			<td style="width:124px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">W0625</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Inhalation Exposure System</td>
			<td style="width:124px;">Glas-Col</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nebulizer-Venturi</td>
			<td style="width:124px;">Glas-Col</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ice cream cups</td>
			<td style="width:124px;">H&#228;agen-Dazs</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:191px;">Used as mosquito cages</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Metal-frame mosquito cages</td>
			<td style="width:124px;">BioQuip Products</td>
			<td style="width:119px;">1450A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an experimental model to study tuberculosis-malaria coinfection upon natural transmission of mycobacterium tuberculosis and plasmodium berghei

Co-infecções ocorrem naturalmente devido à sobreposição geográfica dos diferentes tipos de organismos patogênicos. Infecções simultâneas provavelmente modulam a respectiva resposta imune a cada único patógeno e afectar, assim, patogênese e evolução da doença. Pacientes co-infectados também podem responder diferencialmente a intervenções anti-infecciosos. A co-infecção entre a tuberculose como causada por micobactérias e do parasita da malária Plasmodium, sendo que ambos são coendemic em muitas partes da África Subsaariana, não foi estudada em detalhe. A fim de abordar o desafio, mas cientificamente e clinicamente questão de grande relevância como a imunidade do hospedeiro malária tuberculose coinfecção modular eo curso de cada doença, estabelecemos um modelo experimental do rato, que nos permite dissecar as respostas imunes desencadeados para ambos os patógenos no hospedeiro co-infectados . De notar que, a fim de a maioria das infecções humanas naturalmente adquiridos precisamente imitar, realizamos experimentalinfecções de camundongos com ambos os patógenos por suas rotas naturais de infecção, ou seja, aerosol e picada de mosquito, respectivamente.

Infecção de camundongos com Mtb e P. berghei através da via natural, ou seja, de aerossol e picada de mosquito, respectivamente, resulta em infecção consistente e reprodutível de todos os animais (Tabela 1) 1. Podemos monitorar a infecção bem sucedida eo curso de ambos a malária ea tuberculose, determinando a ocorrência inicial (pré-patente) e número de parasitas no sangue (P. berghei parasitemia) ea carga de Mtb em diferentes órgãos, respectivamente. Um exemplo de uma transmissão com sucesso pelo parasita da malária infecciosa picada de mosquito é mostrada na Tabela 1 e na Figura 3. A alimentação de 10 mosquitos infectados com esporozoítos em cada rato resultou em uma taxa de infecção de 100%, como confirmado pela presença de parasitas no sangue em fase de 4-5 dias mais tarde (Tabela 1 e Figura 3A). É importante ressaltar que encontramos números semelhantes parasitas no sangue de camundongos individual do mesmo gr experimentalOUP, indicando que a transmissão de esporozoítos por resultados picada de mosquito em uma infecção consistente e reproduzível. Ao comparar o pré-patente em camundongos controle ingênuos com que, em animais Mtb-co-infectados, podemos ver que a pré-patente é um pouco atrasado em ratos que tinham sido preinfected com Mtb (Tabela 1, Figura 3B) 1. Como já relatado anteriormente 1, podemos determinar o impacto da co-infecção M. tuberculosis no curso de malária por parasitemia acompanhamento diário em esfregaços de sangue corados pelo Giemsa, como mostrado na Figura 3B. Infecção de murganhos com Mtb através da utilização de um sistema de exposição de inalação resulta na deposição de sucesso de bactérias nos pulmões com relativamente baixa variabilidade entre ratos individuais (Figura 4A). Podemos acompanhar cargas de micobactérias em pulmões e outros órgãos de interesse ao longo do tempo por determinação UFC. Um exemplo para a carga micobacteriana nos pulmõesMtb infectados ratinhos C57BL / 6 na ausência ou na presença de P. berghei é mostrado na Figura 4B. Tabela 1. Pré-patente após a transmissão de esporozoítos por picada de mosquito. Todos os ratos desenvolveram infecções do sangue em estágio após a transmissão natural de P. berghei esporozoítos por picada de mosquito. Adaptado de um PLoS One, 7 (10), e48110 com permissão. <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Grupo experimental de rato (C57BL / 6) </td><td> Desafie por 10 picadas de mosquitos infecciosos </td><td> N º de sangue em estágio positivo animais / N º de animais por grupo </td><td> A média pré-patente [d] </td></tr><tr><td> ingênua </td><td> P. berghei </td><td> 7/7 </td><td> 4,4 </td></tr><tr><td> Mtb infectados </td><td> P. berghei </td><td> 7/7 </td><td> 5,5 </t<html> d&gt; </tr></tbody></table><img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50829/50829fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50829/50829fig1.jpg" /> Figura 1. Esquema geral do procedimento experimental. Ratinhos C57BL / 6 são expostos ao Mtb contendo gotículas de aerossóis na câmara de aerossol Glas-Col. Um dia após infecção por aerossol, a absorção de M. tuberculosis é verificada por análise de UFC do pulmão. 40 dias após o desafio Mtb (quando a tuberculose tornou-se crônica em camundongos infectados), os animais são expostos a P. berghei infectados mosquitos. Para confirmar a transmissão bem sucedida de esporozoítos e para seguir o curso da infecção por Plasmodium, parasitemia é monitorizado diariamente em esfregaços de sangue coradas com Giemsa a partir de 3 dias após a picada de mosquito. / Files/ftp_upload/50829/50829fig2highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/50829/50829fig2.jpg &quot;/&gt; Figura 2. Esboço de uma gaiola mosquito. Mosquitos infecciosos estão contidos dentro de uma caixa, como um meio-litro de sorvete de cartão. Uma pequena abertura é cortada no lado da caixa e coberto com uma camada dupla de látex com uma fenda de corte em cada pedaço para criar uma entrada de segurança para os mosquitos. Um pedaço de papel de filtro é colado na parte inferior interna da caixa para absorver gotas. Taças de sorvete são fechadas com compensação (Nylon mesh), que é fixada à caixa com fita e elástico. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50829/50829fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50829/50829fig3.jpg" /> Figura 3. Parasitemia Sangue. A) Exemplo de um `s Wright esfregaço de sangue manchado mostrando eritrócitos parasitados (barra de escala, 20 &amp; #181;. M) B) parasitemia no sangue do rato foi monitorada através da análise esfregaços de sangue corados pelo Giemsa diárias. Camundongos co-infectados têm uma parasitemia reduzida em comparação com camundongos Plasmodium únicos infectados (n = 10); resultados são apresentados como média ± SD; *** p &lt;0,001. Reproduzido a partir de 1 PLoS One, 7 (10), e48110 com permissão. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50829/50829fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50829/50829fig4.jpg" /> Figura 4. Detecção de M. tuberculosis no pulmão. Ratinhos C57BL / 6 foram provocados com aerossol de 100 CFU de M. tuberculosis e 40 dias mais tarde, co-infectadas com P. berghei por picada de mosquito. A) Um dia após a infecção aerossol a captação do número desejado de Mtb foi verificado por plaqueamento homogeneizados de pulmão integrais para a determinação de UFC. b) Bactériasl cargas no momento da co-infecção foi determinado em lisados ​​pulmonares de três ratinhos por meio de análise de CFU (Mtb d40/d0). 12 dias após a co-infecção, lisados ​​de pulmão foram semeadas para análise CFU para determinar o impacto da co-infecção por Plasmodium no controle de M. tuberculosis. Note-se, que os números de Mtb nos pulmões aumentou durante a co-infecção com P. berghei NK65. Rotulagem Eixo X: tempo após Mtb -infection/time após co-infecção. Adaptado de um PLoS One, 7 (10), e48110 com permissão.

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An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Tuberculose e malária são duas das infecções mais prevalentes em seres humanos e as principais causas de morbidade e mortalidade em populações empobrecidas nos trópicos. Nós estabelecemos um sistema de modelo experimental para estudar resultado de malária tuberculose co-infecção em camundongos após o desafio com ambos os patógenos através de sua rota natural de infecção.

Um modelo experimental para estudar a Tuberculose-Malária Coinfection sobre Transmissão Natural de Mycobacterium tuberculosis E Plasmodium berghei</i

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the ...

an-experimental-model-to-study-tuberculosis-malaria-coinfection-upon

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

19.7K visualizações.  University Hospital Heidelberg.  Tuberculose e malária são duas das infecções mais prevalentes em seres humanos e as principais causas de morbidade e mortalidade em populações empobrecidas nos trópicos. Nós estabelecemos um sistema de modelo experimental para estudar resultado de malária tuberculose co-infecção em camundongos após o desafio com ambos os patógenos através de sua rota natural de infecção. 

Vídeo: An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) drug-resistant strains threatens to derail current disease control efforts. Thus, there is an urgent need to develop drugs and vaccines that are more effective than those currently available. The genome of M. tuberculosis has been known for more than 10 years, yet there are important gaps in our knowledge of gene function and essentiality. Many studies have since used gene expression analysis at both the transcriptomic and proteomic levels to determine the effects of drugs, oxidants, and growth conditions on the global patterns of gene expression. Ultimately, the final response of these changes is reflected in the metabolic composition of the bacterium including a few thousand small molecular weight chemicals. Comparing the metabolic profiles of wild type and mutant strains, either untreated or treated with a particular drug, can effectively allow target identification and may lead to the development of novel inhibitors with anti-tubercular activity. Likewise, the effects of two or more conditions on the metabolome can also be assessed. Nuclear magnetic resonance (NMR) is a powerful technology that is used to identify and quantify metabolic intermediates. In this protocol, procedures for the preparation of M. tuberculosis cell extracts for NMR metabolomic analysis are described. Cell cultures are grown under appropriate conditions and required Biosafety Level 3 containment,1 harvested, and subjected to mechanical lysis while maintaining cold temperatures to maximize preservation of metabolites. Cell lysates are recovered, filtered sterilized, and stored at ultra-low temperatures. Aliquots from these cell extracts are plated on Middlebrook 7H9 agar for colony-forming units to verify absence of viable cells. Upon two months of incubation at 37 &deg;C, if no viable colonies are observed, samples are removed from the containment facility for downstream processing. Extracts are lyophilized, resuspended in deuterated buffer and injected in the NMR instrument, capturing spectroscopic data that is then subjected to statistical analysis. The procedures described can be applied for both one-dimensional (1D) 1H NMR and two-dimensional (2D) 1H-13C NMR analyses. This methodology provides more reliable small molecular weight metabolite identification and more reliable and sensitive quantitative analyses of cell extract metabolic compositions than chromatographic methods. Variations of the procedure described following the cell lysis step can also be adapted for parallel proteomic analysis.

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

The metabolomic profile of Mycobacterium tuberculosis is determined after growth in broth cultures. Conditions can be varied to test the effects of nutritional supplements, oxidants, and anti-tuberculosis agents on the metabolic profile of this microorganism. Procedure for extract preparation is applicable for both 1D 1H and 2D 1H-13C NMR analyses.

Preparação de amostras de<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Extractos para Estudos Nucleares metabolômica Ressonância Magnética

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) ...

Imunologia e Infecção

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including antibiotics. Although stress tolerance of M. tuberculosis is one of the likely contributors to the 6-month long chemotherapy of tuberculosis 1, the molecular mechanisms underlying this characteristic phenotype of the pathogen remain unclear. Many microbial species have evolved to survive in stressful environments by self-assembling in highly organized, surface attached, and matrix encapsulated structures called biofilms 2-4. Growth in communities appears to be a preferred survival strategy of microbes, and is achieved through genetic components that regulate surface attachment, intercellular communications, and synthesis of extracellular polymeric substances (EPS) 5,6. The tolerance to environmental stress is likely facilitated by EPS, and perhaps by the physiological adaptation of individual bacilli to heterogeneous microenvironments within the complex architecture of biofilms 7.
In a series of recent papers we established that M. tuberculosis and Mycobacterium smegmatis have a strong propensity to grow in organized multicellular structures, called biofilms, which can tolerate more than 50 times the minimal inhibitory concentrations of the anti-tuberculosis drugs isoniazid and rifampicin 8-10. M. tuberculosis, however, intriguingly requires specific conditions to form mature biofilms, in particular 9:1 ratio of headspace: media as well as limited exchange of air with the atmosphere 9. Requirements of specialized environmental conditions could possibly be linked to the fact that M. tuberculosis is an obligate human pathogen and thus has adapted to tissue environments. In this publication we demonstrate methods for culturing M. tuberculosis biofilms in a bottle and a 12-well plate format, which is convenient for bacteriological as well as genetic studies. We have described the protocol for an attenuated strain of M. tuberculosis, mc27000, with deletion in the two loci, panCD and RD1, that are critical for in vivo growth of the pathogen 9. This strain can be safely used in a BSL-2 containment for understanding the basic biology of the tuberculosis pathogen thus avoiding the requirement of an expensive BSL-3 facility. The method can be extended, with appropriate modification in media, to grow biofilm of other culturable mycobacterial species.
Overall, a uniform protocol of culturing mycobacterial biofilms will help the investigators interested in studying the basic resilient characteristics of mycobacteria. In addition, a clear and concise method of growing mycobacterial biofilms will also help the clinical and pharmaceutical investigators to test the efficacy of a potential drug.

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Mycobacterium tuberculosis forms drug tolerant biofilms when cultured in certain conditions. Here we describe methods for culturing M. tuberculosis biofilms and determining the frequency of drug tolerant persisters. These protocols will be useful for further studies into the mechanisms of drug tolerance in M. tuberculosis.

Crescimento de Mycobacterium tuberculosis Biofilmes

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including ...

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

Plasmodium falciparum, the causative agent of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important health problems worldwide, being responsible for a total of 4 million deaths annually1. Due to their extensive overlap in developing regions, especially Sub-Saharan Africa, co-infections with malaria and HIV-1 are common, but the interplay between the two diseases is poorly understood. Epidemiological reports have suggested that malarial infection transiently enhances HIV-1 replication and increases HIV-1 viral load in co-infected individuals2,3. Because this viremia stays high for several weeks after treatment with antimalarials, this phenomenon could have an impact on disease progression and transmission.
The cellular immunological mechanisms behind these observations have been studied only scarcely. The few in vitro studies investigating the impact of malaria on HIV-1 have demonstrated that exposure to soluble malarial antigens can increase HIV-1 infection and reactivation in immune cells. However, these studies used whole cell extracts of P. falciparum schizont stage parasites and peripheral blood mononuclear cells (PBMC), making it hard to decipher which malarial component(s) was responsible for the observed effects and what the target host cells were4,5. Recent work has demonstrated that exposure of immature monocyte-derived dendritic cells to the malarial pigment hemozoin increased their ability to transfer HIV-1 to CD4+ T cells6,7, but that it decreased HIV-1 infection of macrophages8. To shed light on this complex process, a systematic analysis of the interactions between the malaria parasite and HIV-1 in different relevant human primary cell populations is critically needed.
Several techniques for investigating the impact of HIV-1 on the phagocytosis of micro-organisms and the effect of such pathogens on HIV-1 replication have been described. We here present a method to investigate the effects of P. falciparum-infected erythrocytes on the replication of HIV-1 in human primary monocyte-derived macrophages. The impact of parasite exposure on HIV-1 transcriptional/translational events is monitored by using single cycle pseudotyped viruses in which a luciferase reporter gene has replaced the Env gene while the effect on the quantity of virus released by the infected macrophages is determined by measuring the HIV-1 capsid protein p24 by ELISA in cell supernatants.

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

We have developed an in vitro malaria-HIV-1 co-infection model to study the impact of Plasmodium falciparum on the HIV-1 replicative cycle in human primary monocyte-derived macrophages. This versatile system can easily be adapted to other primary cell types susceptible to HIV-1 infection.

Um<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo de Co-infecção para Estudar<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-HIV-1 Interacções em monócitos humanos primários derivados de células imunes

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

We describe a method for isolation and characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. Infection of susceptible mouse-strains with this parasite strain results in the induction of experimental cerebral malaria, a neurologic syndrome that recapitulates certain important aspects of Plasmodium falciparum-mediated severe malaria in humans 1,2 . Mature forms of blood-stage malaria express parasitic proteins on the surface of the infected erythrocyte, which allows them to bind to vascular endothelial cells. This process induces obstructions in blood flow, resulting in hypoxia and haemorrhages 3 and also stimulates the recruitment of inflammatory leukocytes to the site of parasite sequestration.
Unlike other infections, i.e neutrotopic viruses4-6, both malaria-parasitized red blood cells (pRBC) as well as associated inflammatory leukocytes remain sequestered within blood vessels rather than infiltrating the brain parenchyma. Thus to avoid contamination of sequestered leukocytes with non-inflammatory circulating cells, extensive intracardial perfusion of infected-mice prior to organ extraction and tissue processing is required in this procedure to remove the blood compartment. After perfusion, brains are harvested and dissected in small pieces. The tissue structure is further disrupted by enzymatic treatment with Collagenase D and DNAse I. The resulting brain homogenate is then centrifuged on a Percoll gradient that allows separation of brain-sequestered leukocytes (BSL) from myelin and other tissue debris. Isolated cells are then washed, counted using a hemocytometer and stained with fluorescent antibodies for subsequent analysis by flow cytometry.
This procedure allows comprehensive phenotypic characterization of inflammatory leukocytes migrating to the brain in response to various stimuli, including stroke as well as viral or parasitic infections. The method also provides a useful tool for assessment of novel anti-inflammatory treatments in pre-clinical animal models.

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

A method for isolation of adherent inflammatory leukocytes from brain blood vessels of Plasmodium berghei ANKA-infected mice is described. The method allows quantification as well as phenotypic characterization of isolated leukocytes after staining with fluorescent antibodies and subsequent analysis by flow cytometry.

Isolamento e Análise de Cérebro-sequestrados de Leucócitos<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA infectadas Mice

We describe a method for isolation and  characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. ...

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource environments. An amplification microarray combines asymmetric PCR amplification, target size selection, target labeling, and microarray hybridization within a single solution and into a single microfluidic chamber. A batch processing method is demonstrated with a 9-plex asymmetric master mix and low-density gel element microarray for genotyping multi-drug resistant Mycobacterium tuberculosis (MDR-TB). The protocol described here can be completed in 6 hr and provide correct genotyping with at least 1,000 cell equivalents of genomic DNA. Incorporating on-chip wash steps is feasible, which will result in an entirely closed amplicon method and system. The extent of multiplexing with an amplification microarray is ultimately constrained by the number of primer pairs that can be combined into a single master mix and still achieve desired sensitivity and specificity performance metrics, rather than the number of probes that are immobilized on the array. Likewise, the total analysis time can be shortened or lengthened depending on the specific intended use, research question, and desired limits of detection. Nevertheless, the general approach significantly streamlines microarray workflow for the end user by reducing the number of manually intensive and time-consuming processing steps, and provides a simplified biochemical and microfluidic path for translating microarray-based diagnostics into routine clinical practice.

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

An amplification microarray combines asymmetric PCR amplification and microarray hybridization into a single chamber, which significantly streamlines microarray workflow for the end user. Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource environments.

Demonstrando um multi-resistente<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Ampliação Microarray

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource ...

A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

Microdissection has been used for the examination of tissues at DNA, RNA, and protein levels for over a decade. Laser capture microscopy (LCM) is the most common microdissection technique used today. In this technique, a laser is used to focally melt a thermoplastic membrane that overlies a dehydrated tissue section1. The tissue section composite is then lifted and separated from the membrane. Although this technique can be used successfully for tissue examination, it is time consuming and expensive. Furthermore, the successful completion of procedures using this technique requires the use of a laser, thus limiting its use. A new more affordable and practical microdissection approach called mesodissection is a possible solution to the pitfalls of LCM. This technique employs the MESO-1/MeSectr system to mill the desired tissue from a slide mounted tissue sample while concurrently dispensing and aspirating fluid to recover the desired tissue sample into a consumable mill bit. Before the dissection process begins, the user aligns the formalin fixed paraffin embedded (FFPE) slide with a hematoxylin and eosin stained (H&#38;E) reference slide. Thereafter, the operator annotates the desired dissection area and proceeds to dissect the appropriate segment. The program generates an archived image of the dissection. The main advantage of mesodissection is the short duration needed to dissect a slide, taking an average of ten minutes from set up to sample generation in this experiment. Additionally, the system is significantly more cost effective and user friendly. A slight disadvantage is that it is not as precise as laser capture microscopy. In this article we demonstrate how mesodissection can be used to extract RNA from slides from FFPE granulomas caused by Mycobacterium tuberculosis (Mtb).

A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

Microdissection has been extensively employed for the examination of DNA, RNA, and protein within tissue. Laser capture microscopy (LCM) is the most commonly used method, but a new milling technique, mesodissection, is recently available. We demonstrate RNA extraction from mesodissected formalin fixed paraffin embedded tissue slides of Mycobacterium tuberculosis granulomas.

Uma nova abordagem para Microdissecção Recuperando<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; transcritos específicos de formalina fixo Parafina incorporado Lung granulomas

Microdissection has been used for the examination of tissues at DNA, RNA, and protein levels for over a decade. Laser capture microscopy (LCM) is the most ...

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us understand the disease mechanisms and advance the discoveries of new treatment options. In vitro cell cultures of monolayers or co-cultures lack the three-dimensional (3D) environment and tissue responses. Herein, we describe an innovative in vitro model of a human lung tissue, which holds promise to be an effective tool for studying the complex events that occur during infection with Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis). The 3D tissue model consists of tissue-specific epithelial cells and fibroblasts, which are cultured in a matrix of collagen on top of a porous membrane. Upon air exposure, the epithelial cells stratify and secrete mucus at the apical side. By introducing human primary macrophages infected with M. tuberculosis to the tissue model, we have shown that immune cells migrate into the infected-tissue and form early stages of TB granuloma. These structures recapitulate the distinct feature of human TB, the granuloma, which is fundamentally different or not commonly observed in widely used experimental animal models. This organotypic culture method enables the 3D visualization and robust quantitative analysis that provides pivotal information on spatial and temporal features of host cell-pathogen interactions. Taken together, the lung tissue model provides a physiologically relevant tissue micro-environment for studies on TB. Thus, the lung tissue model has potential implications for both basic mechanistic and applied studies. Importantly, the model allows addition or manipulation of individual cell types, which thereby widens its use for modelling a variety of infectious diseases that affect the lungs.

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

Human tuberculosis infection is a complex process, which is difficult to model in vitro. Here we describe a novel 3D human lung tissue model that recapitulates the dynamics that occur during infection, including the migration of immune cells and early granuloma formation in a physiological environment.

Um modelo de tecido Pulmão humano 3D para estudos funcionais em<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Infecção

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread of multi drug-resistant TB (MDR-TB), there is a real urgency to develop new therapeutic strategies against M. tuberculosis infections. Traditionally, compounds are evaluated based on their antibacterial activity under in vitro growth conditions in broth; however, results are often misleading for intracellular pathogens like M. tuberculosis since in-broth phenotypic screening conditions are significantly different from the actual disease conditions within the human body. Screening for inhibitors that work inside macrophages has been traditionally difficult due to the complexity, variability in infection, and slow replication rate of M. tuberculosis. In this study, we report a new approach to rapidly assess the effectiveness of compounds on the viability of M. tuberculosis in a macrophage infection model. Using a combination of a cytotoxicity assay and an in-broth M. tuberculosis viability assay, we were able to create a screening system that generates a comprehensive analysis of compounds of interest. This system is capable of producing quantitative data at a low cost that is within reach of most labs and yet is highly scalable to fit large industrial settings.

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

We have developed a modular high-throughput screening system for discovering novel compounds against Mycobacterium tuberculosis, targeting intracellular and in-broth growing bacteria as well as cytotoxicity against the mammalian host cell.

Sistema de Eficácia e citotoxicidade Rastreio de inibidores Segmentação intracelular<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to effectiveness in the clinical setting. This is likely due to a lack of consideration for the physiologically relevant cellular penetration barriers that exist in the infected host. We recently established an alternative infection model that generates large macrophage aggregate structures containing densely packed M. tuberculosis (Mtb) at its core, which was suitable for drug susceptibility testing. This infection model is inexpensive, rapid, and most importantly BSL-2 compatible. Here, we describe the experimental procedures to generate Mtb/macrophage aggregate structures that would produce macrophage-passaged Mtb for drug susceptibility testing. In particular, we demonstrate how this infection system could be directly adapted to the 96-well plate format showing throughput capability for the screening of compound libraries against Mtb. Overall, this assay is a valuable addition to the currently available Mtb drug discovery toolbox due to its simplicity, cost effectiveness, and scalability.

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

New models and assays that would improve the early drug development process for next-generation anti-tuberculosis drugs are highly desirable. Here, we describe a quick, inexpensive, and BSL-2 compatible assay to evaluate drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis that can be easily adapted for high-throughput screening.

Um ensaio Compatível de alta capacidade para avaliar droga Eficácia contra macrófagos passadas<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by fluorescence or bioluminescence. We utilize BlaC, an enzyme expressed constitutively by all M. tuberculosis strains. REF allows rapid quantification of bacteria in lungs of infected mice. The same group of mice can be imaged at many time points, greatly reducing costs, enumerating bacteria more quickly, allowing novel observations in host-pathogen interactions, and increasing statistical power, since more animals per group are readily maintained. REF is extremely sensitive due to the catalytic nature of the BlaC enzymatic reporter and specific due to the custom flourescence resonance energy transfer (FRET) or fluorogenic substrates used. REF does not require recombinant strains, ensuring normal host-pathogen interactions. We describe the imaging of M. tuberculosis infection using a FRET substrate with maximal emission at 800 nm. The wavelength of the substrate allows sensitive deep tissue imaging in mammals. We will outline aerosol infection of mice with M. tuberculosis, anesthesia of mice, administration of the REF substrate, and optical imaging. This method has been successfully applied to evaluating host-pathogen interactions and efficacy of antibiotics targeting M. tuberculosis.

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

We describe the optical imaging of mice infected with Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) using reporter enzyme fluorescence (REF). This protocol facilitates the sensitive and specific detection of M. tuberculosis in pre-clinical animal models for pathogenesis, therapeutics and vaccine research.

Mycobacterium tuberculosis em camundongos com fluorescência de enzima do repórter de imagem

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by ...