O foco da minha pesquisa é obter as informações críticas de confirmação da beta-amiloide 1-40 quando ela é absorvida sobre a superfície da nanopartícula de ouro e ocorre um processo de agregação reversível. O desafio que enfrentamos neste campo de pesquisa é obter informações térmicas, químicas e dinâmicas do processo de agregação reversa. A grande descoberta deste projeto é que somos capazes de identificar o modo de movimento ou vibração específico que contribui para a confirmação dobrada ou desdobrada da beta-amilóide 1-40 quando eles são absorvidos sobre a superfície da nanopartícula de ouro.
A grande vantagem de usar SERS, espectroscopia de espalhamento Raman aprimorada por superfície, é detectar sinais de espalhamento muito pequenos e fracos para identificar o modo que é crítico para causar dobramento e desdobramento. Ao mesmo tempo, somos capazes de identificar a morfologia dos agregados. As descobertas que podemos produzir a partir deste projeto são a interação chave da interação proteína-proteína, que será importante para causar o oligômero e que levará à fibrogênese.
Para começar, usando uma micropipeta, adicione um mililitro de água destilada deionizada a um miligrama de beta-amiloide liofilizado, ou A beta 1-40. Misture a solução com um misturador de vórtice por aproximadamente 30 segundos. Certifique-se de que nenhuma partícula sólida permaneça na solução à temperatura ambiente, aproximadamente 20 graus Celsius.
Em seguida, prepare soluções de estoque de peptídeos usando água desionizada e destilada. Determine a concentração de peptídeos medindo espectroscopicamente a absorção de tirosina a 275 nanômetros. Armazene as soluções de estoque A beta 1-40 a menos 80 graus Celsius.
Descongele a solução estoque de peptídeos aproximadamente cinco minutos antes da coleta de dados. Em um tubo de centrífuga de 15 mililitros, misture oito microlitros da solução peptídica com 800 microlitros de partículas coloidais de ouro. Adicione 4,2 mililitros de água destilada deionizada e, em seguida, vortex a amostra por 10 segundos.
Fixe a concentração de peptídeos beta 1-40 em 1,8 nanomolar e ajuste a proporção de peptídeos para partículas coloidais de ouro dentro da faixa específica. Usando a unidade de controle de temperatura do espectrofotômetro UV visível, ajuste a solução à temperatura ambiente, aproximadamente 22 graus Celsius. Monitore o pH inicial da solução de amostra usando um medidor de pH e ajuste-o para um pouco abaixo do pH sete.
Colete o espectro de absorção dentro da faixa de 400 a 800 nanômetros. Em seguida, ajuste o pH da amostra para aproximadamente pH quatro, adicionando incrementos de 1,0 microlitro de ácido clorídrico 1,0 molar. Colete o espectro de absorção na mesma faixa de 400 a 800 nanômetros.
Em seguida, ajuste o pH da amostra para aproximadamente pH 10 adicionando incrementos de aproximadamente 1,5 microlitro de hidróxido de sódio 1,0 molar. Colete o espectro de absorção dentro da mesma faixa de comprimento de onda de 400 a 800 nanômetros. Depois disso, altere o pH entre pH quatro e pH 10 10 vezes adicionando ácido clorídrico ou hidróxido de sódio.
Colete continuamente o espectro de absorção a 25 graus Celsius. Obtenha o conjunto de dados ASCII de comprimentos de onda em função da absorbância. Use o programa PeakFit para extrair as posições médias dos picos da banda.
Usando a função de plotagem, plote o conjunto de dados para visualizar a densidade óptica em função do comprimento de onda. Identifique e marque os comprimentos de onda de pico iniciais, lambda um e lambda dois, selecionando suas posições aproximadas nos dados plotados. Ajuste os dados usando a função de ajuste de pico do programa de origem.
Obtenha o gráfico exibindo as posições de pico central para cada lambda rotulado como XCI, juntamente com as áreas de banda correspondentes, denotadas como AI. Exporte as posições de pico extraídas e as áreas correspondentes para um programa de planilha para análise. Calcule o fator de ponderação, AI, para cada centro de pico, comparando a área da banda com a área total de todas as bandas usando a fórmula exibida. Em seguida, extraia a posição média do pico usando a equação exibida na tela.
Para gerar um gráfico de reversibilidade, tabule as posições médias de pico em função do número da operação N.Atribua o número da operação N conforme mencionado na tela. Analise a posição de pico em N usando a fórmula exibida. Transfira o conjunto de dados calculado para o software de origem e plote-o.
Selecione o ajuste de curva não linear da análise, insira os valores iniciais para A, B, C, D e E e clique em executar para concluir o processo de ajuste de curva. Para realizar a imagem Raman, para cada amostra na operação número N, coloque 100 microlitros de solução em um disco de mica com diâmetro de um centímetro. Deixe as amostras secarem durante a noite antes da medição.
Em seguida, colete imagens de luz branca para cada número de operação N.Prepare a amostra separada em um novo disco de mica, pois o pH é continuamente alterado entre quatro e 10. Colete a imagem Raman para cada número de operação e usando as especificações mencionadas de um laser com comprimento de onda de 633 nanômetros. Capture imagens em uma grade de 100 por 100 pixels com um tempo de integração específico, focando na região espectral desejada.
Plote o espectro representativo para cada número de operação N alinhado em função de N.Construa uma espectroscopia Raman tridimensional aprimorada por superfície, ou espectro SERS, em função de N para um ouro beta de 20 nanômetros revestido com 1-40. Utilize a vista superior do espectro como um mapa de contorno para extrair os modos específicos associados a uma condição de pH específica. Identifique recursos espectrais aprimorados exclusivamente apenas em números de operação pares ou ímpares.
A banda SPR de nanopartículas de ouro revestidas com beta 1-40 mudou de 530 nanômetros para cerca de 650 nanômetros quando a solução se tornou mais ácida. Isso correspondeu à formação de agregados colóides de ouro com monômeros A beta 1-40 desdobrados, conforme observado por TEM. A mudança de cor dependente do pH do ouro revestido com A beta 1-40 também foi evidente.
O deslocamento reversível dependente do pH da banda média atingiu o pico entre um comprimento de onda mais curto e mais longo, e a morfologia dispersa e agregada alternada observada no MET confirmou a natureza quase reversível do processo. A imagem de luz branca mostrou um padrão de agregação claro e reversível correspondente às mudanças de pH, enquanto os espectros SERS exibiram mudanças sutis dependentes do pH na região da impressão digital.
