Not Published
лиц введенный здеÑÑŒ Ñтепени: Micro: μ амперÑанд: & торговой маркой: теÑтирование ∂ Σ Ω ≈ γ γδ γδ γδ иÑпытаний
Sample Text
Sample Text
Sample Text
Transuroepithelial анализа миграции нейтрофилов позволÑет количеÑтвенной оценки миграции человека ПМРчерез культурные Ñлои ÑÐ¿Ð¸Ñ‚ÐµÐ»Ð¸Ñ Ð¼Ð¾Ñ‡ÐµÐ²Ð¾Ð³Ð¾ Ð¿ÑƒÐ·Ñ‹Ñ€Ñ ÐºÐ»ÐµÑ‚Ð¾Ðº в ответ на различные Ñтимулы (риÑ. 1Ð’). Ð’ то Ð²Ñ€ÐµÐ¼Ñ ÐºÐ°Ðº протокол ÑвлÑетÑÑ Ð¿Ñ€Ð¾Ñтым, ÑущеÑтвует Ñ€Ñд переменных, которые могут влиÑть на миграцию нейтрофилов и, Ñледовательно, влиÑет на воÑпроизводимоÑть Ñтого анализа. Должны быть принÑты меры при подготовке проницаемой опор и ПМРуменьшить изменчивоÑть между техничеÑкими и биологичеÑких повторÑет. Ðапример, только проницаемую поддерживает Ñодержащие доÑтаточно Ñливной 5637 клеточные Ñлои должны быть иÑпользованы в ÑкÑперименте. СлиÑние 5637 клеток оценивали Ñ Ð¿Ð¾Ð¼Ð¾Ñ‰ÑŒÑŽ функционального анализа, который измерÑет непроницаемоÑть Ð´Ð»Ñ Ð¶Ð¸Ð´ÐºÐ¾Ñти. ЕÑли Ñреды, добавленной к верхней уравновешиваетÑÑ Ñ€ÐµÐ·ÐµÑ€Ð²ÑƒÐ°Ñ€ через проницаемую поддержки, то 5637 клетки не ÑвлÑÑŽÑ‚ÑÑ Ð´Ð¾Ñтаточно Ñливной провеÑти ÑкÑперимент. ЕÑли объем в верхний резервуар ÑохранÑетÑÑ,Затем проницаемой поддержки может быть иÑпользован Ð´Ð»Ñ Ð¾Ñ†ÐµÐ½ÐºÐ¸ PMN миграции. Мы измерили транÑÑÐ¿Ð¸Ñ‚ÐµÐ»Ð¸Ð°Ð»ÑŒÐ½Ð°Ñ ÑлектричеÑкого ÑÐ¾Ð¿Ñ€Ð¾Ñ‚Ð¸Ð²Ð»ÐµÐ½Ð¸Ñ Ð² Ñтой ÑиÑтеме, ÐºÐ¾Ñ‚Ð¾Ñ€Ð°Ñ ÑƒÐ¼ÐµÑ€ÐµÐ½Ð½Ð¾ возраÑтает при ÑлиÑнии клеток, еÑли Ñтот метод будет выбран, Ñледует проÑвлÑть оÑторожноÑть, чтобы не загрÑзнить иначе Ñтерильные уÑтановки. СлиÑние 5637 клетки 7 дней поÑле поÑева может завиÑеть от неÑкольких факторов, Ð²ÐºÐ»ÑŽÑ‡Ð°Ñ Ñ‡Ð¸Ñло паÑÑажей клеток и количеÑтво клеток, поÑеÑнных на проницаемой поддержки. Кроме того, количеÑтво времени, 5637 Клетки инкубируют на проницаемой поддержки в перевернутом положении во Ð²Ñ€ÐµÐ¼Ñ Ð¿Ð¾Ñева не должна превышать 16 ч (фиг. 1Ð). Ð”Ð»Ñ Ð¾Ð¿Ñ‚Ð¸Ð¼Ð°Ð»ÑŒÐ½Ð¾Ð¹ воÑпроизводимоÑти, протокол должен Ñтрого выполнÑтьÑÑ. Ðаконец, проницаемые ноÑители, Ñодержащие ÑливающийÑÑ 5637 Ñлоев клеток Ñледует иÑпользовать в течение 1-2 дней, и мембраны из опор не должны быть затронуты во Ð²Ñ€ÐµÐ¼Ñ Ð»Ð¸Ð±Ð¾ роÑÑ‚ клеток или 5637 во Ð²Ñ€ÐµÐ¼Ñ transuroepithelial анализа миграции нейтрофилов.
Ð’ дополнение к 5637 клеток изменчивоÑть может быть также введен в процеÑÑе подготовки PMN. ИÑпользование протокола опиÑано выше, чтобы изолировать PMN, 1 мл человечеÑкой крови обычно дает около 10 6 PMN, Ñ…Ð¾Ñ‚Ñ Ñто количеÑтво варьируетÑÑ Ð¾Ñ‚ индивидуума к индивидууму. Как только типичный выход крови отдельных доноров, как извеÑтно, изолÑÑ†Ð¸Ñ Ð¿Ñ€Ð¾Ñ‚Ð¾ÐºÐ¾Ð» может быть увеличен или уменьшен ÑоответÑтвенно. ПМРот нездоровых или больных людей Ñледует избегать, и различных доноров ПМРдолжны иÑпользоватьÑÑ Ð´Ð»Ñ Ð±Ð¸Ð¾Ð»Ð¾Ð³Ð¸Ñ‡ÐµÑких повторÑет, чтобы наблюдаемые результаты воÑпроизводимы. ПМРÑледует обращатьÑÑ Ð°ÐºÐºÑƒÑ€Ð°Ñ‚Ð½Ð¾ и Ñтерильно, чтобы избежать активации при выделении. И наконец, выбор времени ÑкÑпериментальных процедур имеет решающее значение, так как PMN не выживают в течение длительного периода времени поÑле ÑƒÐ´Ð°Ð»ÐµÐ½Ð¸Ñ Ð¸Ð· организма. Мы иÑпользуем ПМРв течение 1 чаÑа Ð·Ð°Ð²ÐµÑ€ÑˆÐµÐ½Ð¸Ñ Ð²Ñ‹Ð´ÐµÐ»ÐµÐ½Ð¸Ñ. С учетом Ñтих Ñоображений, по крайней мере, три техничеÑких повторÑет должны быть включены в каждый биологичеÑкий репликации.
КоличеÑтво нейтрофилов в нижнем резервуаре через 1 Ñ‡Ð°Ñ Ð¿Ð¾ÐºÐ°Ð·Ð°Ð½ на риÑунке 2 нормированы на 10 6 входных PMN. Кроме того, PMN номера можно Ñравнить Ñ Ð²Ð½ÑƒÑ‚Ñ€ÐµÐ½Ð½Ð¸Ð¼ контролем поÑле нормализации на входе PMN, что может уменьшить Ñ€Ð°Ð·Ð»Ð¸Ñ‡Ð¸Ñ Ð¼ÐµÐ¶Ð´Ñƒ биологичеÑкой репликации. ПриÑоединение к Протоколу, изложенных выше, Ñ Ð²Ð½Ð¸Ð¼Ð°Ð½Ð¸ÐµÐ¼ к деталÑм позволÑет перечиÑÐ»ÐµÐ½Ð¸Ñ Ð¼Ð¸Ð³Ñ€Ð°Ñ†Ð¸Ð¸ нейтрофилов в ответ на Ñтимулы, Ð²ÐºÐ»ÑŽÑ‡Ð°Ñ Ð±Ð°ÐºÑ‚ÐµÑ€Ð¸Ð¸ (риÑ. 2а) и хемоаттрактант вещеÑтв (риÑ. 2Ð’).
РиÑунок 1. Схема ÑкÑперимента. (A) 5637 мочевого Ð¿ÑƒÐ·Ñ‹Ñ€Ñ Ñпителиальные клетки выÑевают на перевернутой проницаемой опоры, опоры иÑправлено в 24-луночный планшет, и клетки выращивали до ÑлиÑниÑ. (B) Проницаемый вирпортов Ñодержащий Ñливной 5637 клетки переворачивали и инфицированных E. палочки на апикальной Ñтороне Ñпителиальных Ñлоев. Кроме того, хемоаттрактанты могут быть помещены в нижнем резервуаре. Проницаемой опоры иÑправлено в низкой крепежной плаÑтиной и Ñвежевыделенным PMN человека, применÑÑŽÑ‚ÑÑ Ðº верхний резервуар (предÑтавлÑющий базолатеральной Ñтороне Ñпителиальных Ñлоев). ПМРмигрируют через Ñпителий и нумеруютÑÑ Ñ Ð½Ð¸Ð¶Ð½ÐµÐ³Ð¾ плаÑта иÑпользованием гемацитометре.
РиÑунок 2. ПМРмигрируют через Ñпителий мочевого Ð¿ÑƒÐ·Ñ‹Ñ€Ñ Ð² ответ на различные Ñтимулы. (Ð) заражение патогенными E. штамма E.coli MG1655, убитых нагреванием MG1655 (HKMG) или УПÐК мутанта UTI89 YbCl :: кошка вызывает значительно больше, чем Ð¼Ð¸Ð³Ñ€Ð°Ñ†Ð¸Ñ ÐŸÐœÐ MoCK инфекции или инфекции дикого типа штамма UTI89 УПÐК, циÑтит изолÑÑ‚ (*, P <0,001). (Б) добавление fMLF (100 нМ) или IL-8 (100 нг / мл) в нижнем резервуаре приводит к значительно более PMN миграцию, чем макет обработки (* Ð <0,001). Данные предÑтавлÑÑŽÑ‚ Ñобой Ñреднее и Ñтандартное отклонение по крайней мере, три биологичеÑких повторÑет. СтатиÑтичеÑки значимые Ñ€Ð°Ð·Ð»Ð¸Ñ‡Ð¸Ñ Ð±Ñ‹Ð»Ð¸ определены Ñ Ð¸Ñпользованием Т-теÑÑ‚ непарный СтуденчеÑкаÑ.
РаÑкрытие
Name | Company | Catalog Number | Comments |
(3-Glycidyloxypropyl)trimethoxysilane | Sigma | 440167 | GOPS |
0.25% Trypsin-EDTA (1X) | Gibco | 25200-056 | |
4-Dodecylbenzenesulfonic acid | Sigma | 44198 | DBSA |
96-well plate | Falcon | 353075 | |
Acetone | Technic | 530 | |
Acrylic resin | Fischer scientific | NC1455685 | |
agarose | Sigma | A9539 | |
autoclave | Tuttnauer | 3150 EL | |
AZ 10XT | Microchemicals | Positive photoresist | |
AZ 826 MIF Developer | Merck | 10056124960 | Metal-ion-free developer for the negative photoresist |
AZ Developer | Merck | 10054224960 | Metal-ion-free developer for the positive photoresist |
AZ nLof 2070 | Microchemicals | Negative photoresist | |
Buprenorphine | Axience | ||
Carprofen | Rimadyl | ||
Centrifuge Sorvall Legend X1R | Thermo Scientific | 75004260 | |
CMOS camera Prime 95B | Photometrics | ||
CO2 incubator HERAcell 150i | Thermo scientific | ||
DAC board | National Instruments | USB 6259 | |
Déco spray Pébéo | Cultura | 3167860937307 | Black acrylic paint |
Dextran Texas Red 70.000 | Thermofisher | D1830 | |
Die bonding paste "Epinal" | Hitachi | EN-4900GC | Silver paste |
Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2438 | |
Dispensing machine | Tianhao | TH-2004C | |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium + GlutaMAX™-I | Gibco | 10567-014 | |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma | D6429 | |
Egg incubator COUVAD'OR 160 | lafermedemanon.com | ||
Ethylene glycol | Carl Roth | 6881.1 | |
Fertilized eggs of Japanese quail | Japocaille | ||
Fetal Bovine Serum | VWR | S181BH | |
Flask | Greiner | 658170 | |
Fluorescence macroscope | Leica MZFLIII | ||
Gl261 | DSMZ | ACC 802 | |
Gold pellets - Dia 3 mm x 6 mm th | Neyco | ||
Handheld automated cell counter | Millipore | PHCC00000 | |
Heating and drying oven | Memmert | UF110 | |
Hexadimethrine Bromide Sequa-brene | Sigma | S2667 | |
hot plate Delta 6 HP 350 | Süss Microtec | ||
Illumination system pE-4000 | CoolLed | ||
Infrared tunable femtosecond laser (Maï-Taï) | Spectra Physics (USA) | ||
Ionomycin calcium salt | Sigma | I3909 | |
Kapton tape SCOTCH 92 33x19 | 3M | Polyimide protection tape | |
Lab made pulse generator | |||
Labcoter 2 Parylene Deposition system PDS 2010 | SCS | ||
Lenti-X 293 T cell line | Takara Bio | 63218 | HEK 293T-derived cell line optimized for lentivirus production |
Lenti-X GoStix Plus | Takara Bio | 631280 | Quantitative lentiviral titer test |
Mask aligner MJB4 | Süss Microtec | ||
Micro-90 Concentrated cleaning solution | International Products | M9050-12 | |
Microscope slides 76 x 52 x 1 mm | Marienfeld | 1100420 | |
Needles 30G | BD Microlance 3 | 304000 | |
PalmSens4 potentiostat | PalmSens | ||
parylene-c : dichloro-p-cyclophane | SCS | 300073 | |
PCB Processing Tanks | Mega Electronics | PA104 | |
PEDOT:PSS Clevios PH 1000 | Heraeus | ||
penicillin / streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
Petri dish | Falcon | 351029 | |
pGP-CMV-GCaMP6f | Addgene | 40755 | plasmid |
Phosphate Buffer Saline solution | Thermofisher | D8537 | |
Plasma treatment system PE-100 | Plasma Etch | ||
PlasmaLab 80 Reactive Ion Etcher | Oxford Instruments | ||
Plastic mask | Selba | ||
Plastic weigh boat 64 x 51 x 19 mm | VWR | 10770-454 | |
Poly-dimethylsiloxane: SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | Dow chemicals | 1673921 | |
Polyimide copper film 60 µm (Kapton) | Goodfellow | IM301522 | |
Propan-2-ol | Technic | 574 | |
Protolaser S | LPKF | ||
puromycin | Gibco | A11103 | |
Round cover glass 5 mm diameter | Fischer scientific | 50-949-439 | |
Scepter Sensors - 60 µm | Millipore | PHCC60050 | |
Silicone adhesive Kwik-Sil | World Precision Instruments | ||
spin coater | Süss Microtec | ||
Spin Coater | Laurell | WS-650 | |
Super glue | Office depot | ||
tetracycline-free fœtal bovine Serum | Takara Bio | 631105 | |
Thermal evaporator Auto 500 | Boc Edwards | ||
Two-photon microscope | Zeiss LSM 7MP | ||
U87-MG | ATCC | HTB-14 | Human glioblastoma cells |
Ultrasonic cleaner | VWR | ||
Vortex VTX-3000L | LMS | VTX100323410 | |
Xfect single shots reagent | Takara Bio | 631447 | Transfection reagent |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены