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결과

transuroepithelial 호중구 마이그레이션 분석은 다양한 자극 (그림 1B) 님의 질문에 답변 배양 방광 상피 세포 층에 걸쳐 인간의 PMN 마이그레이션의 양적 평가를 할 수 있습니다. 프로토콜은 간단하지만, PMN 마이그레이션 영향을 미치고 결과적으로이 분석의 재현성에 영향을 미칠 수있는 변수의 숫자가있다. 기술 및 생물 복제 사이의 변동성을 줄이기 위해 침투성 지원과 PMN을 준비하는 동안 조치를 취해야한다. 예를 들어, 만 투과 충분히 합류 5637 세포층이 실험에 사용되어야 함유 지원합니다. 5637 세포의 합류는 액체 불 투과성을 측정하는 기능 분석을 사용하여 평가됩니다. 매체 투과성 지원을 통해 상부 저수지 평형을 추가하면, 5637 세포 실험을 수행 할 충분한 합류하지 않습니다. 상부 저수지에 볼륨이 유지되는 경우,다음 투과성 지원 PMN 마이그레이션을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 우리는 세포의 합류에 따라 소폭 상승이 시스템에 transepithelial 전기 저항을 측정하고,이 방법을 선택하면, 치료는 그렇지 멸균 설치를 오염되지 않도록주의해야한다. 칠일 파종 후 5637 세포의 합류는 세포의 통과 수와 투과 지원에 씨앗을 품고 세포의 수 등 여러 요인에 의해 영향을받을 수있다. 또한, 5637 세포가 파종하는 동안 거꾸로 위치에 투과성 지원을 배양하는 시간은 16 시간 (그림 1A)를 초과하지 않아야합니다. 최적의 재현성을 위해, 프로토콜은 정확하게 따라야한다. 마지막으로, 투과성이 합류 5637 세포층 1-2 일 이내에 사용하시기 바랍니다 함유 지원하고, 지원의 세포막은 5637 세포의 하나 성장하는 동안이나 transuroepithelial 호중구 마이그레이션 분석하는 동안 접촉해서는 안됩니다.

5637 세포뿐만 아니라, 변화는 PMN 준비 중에 도입 할 수 있습니다. 이 숫자가 개별에서 개별로 다릅니다 있지만, PMN을 분리 위에서 설명한 프로토콜을 사용하여, 인간의 혈액 1 ㎖는 일반적으로 6 10 PMN을 얻을 수 있습니다. 개인 기증자의 혈액의 전형적인 수율이 알려지면, 격리 프로토콜을 따라 상하로 조정하거나 할 수 있습니다. 건강에 해로운 아프거나 개인의 PMN은 피해야한다, 및 생물 학적 관찰 결과를 재현 할 수 있는지 확인하기 위해 복제에 대해 서로 다른 PMN 기증자를 사용해야합니다. PMN을 분리하는 동안 활성화를 피하기 위해 부드럽게 무균 처리되어야한다. PMN 한 번 몸에서 제거 오랜 기간 동안 생존하지 않는 마지막으로, 실험 절차의 타이밍이 중요합니다. 우리는 분리 절차를 완료 1 시간 이내 PMN를 사용합니다. 기술 최소 3 복제는 각 생물 복제에 포함되어야한다, 이러한 고려 사항을 고려.

1 시간 후 하부 저수지 PMN의 수는 10 6 입력 PMN로 정규화 그림 2에 표시됩니다. 또한, PMN 번호는 생물 학적 복제 사이의 변화를 줄일 수 있습니다 입력 PMN에 정상화 이후 내부 통제에 비교 될 수있다. 세부 사항에주의를 위에서 설명한 프로토콜을 준수 박테리아 (그림 2A) 및 화학 주성 물질 (그림 2B) 등의 자극에 대한 응답으로 PMN 마이그레이션 열거 할 수 있습니다.

figure-results-3772
그림 1. 실험 설계의 개략도. (A) 5637 방광 상피 세포가 거꾸로 투과성 지원에 씨앗을 품고 있으며, 지원은 24 - 웰 플레이트에 고치게되고, 세포는 합류로 성장하고 있습니다. (B) 투과 저녁을 먹다합류 5637 세포를 포함하는 포트는 E.에 거꾸로 감염 상피 층의 꼭대기면에 대장균. 또한, chemoattractants이 낮은 저수지에 배치 할 수 있습니다. 투과성 지원은 낮은 부착 플레이트로 고치게되며, 갓 고립 된 인간의 PMN은 상부 저수지 (상피 층의 기저 측면을 나타내는)에 적용됩니다. PMN은 상피에 걸쳐 마이그레이션 hemacytometer를 사용하여 하부 저수지에서 열거됩니다.

figure-results-4737
그림 2. PMN는 다양한 자극에 대한 응답으로 방광 상피를 통해 마이그레이션 할 수 있습니다. 비병원성 E.와 (A) 감염 대장균 균주 MG1655은 MG1655 (HKMG) 또는 UPEC 돌연변이 UTI89 ybcL을 열 살해 :: 고양이 개월보다 훨씬 더 PMN 마이그레이션을 이끌어야생 형 UPEC 변형 UTI89와 CK 감염 또는 감염, 방광염 (*, P <0.001) 분리. (B) 모의 치료 (*, P <0.001)보다 훨씬 더 PMN 이주 하부 저수지 결과 fMLF (100 NM) 또는 IL-8 (100 NG / ML)의 추가. 데이터 복제 최소 3 생물의 평균과 표준 편차를 나타냅니다. 통계적으로 유의 한 차이는 짝이 학생의 t 테스트를 사용하여 측정 하였다.

토론

토론

공개

폭로

감사의 말

인정

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
(3-Glycidyloxypropyl)trimethoxysilaneSigma440167GOPS
0.25% Trypsin-EDTA (1X)Gibco25200-056
4-Dodecylbenzenesulfonic acidSigma44198DBSA
96-well plateFalcon353075
AcetoneTechnic530
Acrylic resinFischer scientificNC1455685
agaroseSigmaA9539
autoclaveTuttnauer3150 EL
AZ 10XTMicrochemicalsPositive photoresist
AZ 826 MIF DeveloperMerck10056124960Metal-ion-free developer for the negative photoresist
AZ DeveloperMerck10054224960Metal-ion-free developer for the positive photoresist
AZ nLof 2070MicrochemicalsNegative photoresist
BuprenorphineAxience
CarprofenRimadyl
Centrifuge Sorvall Legend X1RThermo Scientific75004260
CMOS camera Prime 95BPhotometrics
CO2 incubator HERAcell 150iThermo scientific
DAC boardNational InstrumentsUSB 6259
Déco spray PébéoCultura3167860937307Black acrylic paint
Dextran Texas Red 70.000ThermofisherD1830
Die bonding paste "Epinal"HitachiEN-4900GCSilver paste
Dimethyl sulfoxideSigmaD2438
Dispensing machineTianhaoTH-2004C
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium + GlutaMAX™-IGibco10567-014
Dulbecco's Modified Eagle's MediumSigmaD6429
Egg incubator COUVAD'OR 160lafermedemanon.com
Ethylene glycolCarl Roth6881.1
Fertilized eggs of Japanese quailJapocaille
Fetal Bovine SerumVWRS181BH
FlaskGreiner658170
Fluorescence macroscopeLeica MZFLIII
Gl261DSMZACC 802
Gold pellets - Dia 3 mm x 6 mm thNeyco
Handheld automated cell counterMilliporePHCC00000
Heating and drying ovenMemmertUF110
Hexadimethrine Bromide Sequa-breneSigmaS2667
hot plate Delta 6 HP 350Süss Microtec
Illumination system pE-4000CoolLed
Infrared tunable femtosecond laser (Maï-Taï)Spectra Physics (USA)
Ionomycin calcium saltSigmaI3909
Kapton tape SCOTCH 92 33x193MPolyimide protection tape
Lab made pulse generator
Labcoter 2 Parylene Deposition system PDS 2010SCS
Lenti-X 293 T cell lineTakara Bio63218HEK 293T-derived cell line optimized for lentivirus production
Lenti-X GoStix PlusTakara Bio631280Quantitative lentiviral titer test
Mask aligner MJB4Süss Microtec
Micro-90 Concentrated cleaning solutionInternational ProductsM9050-12
Microscope slides 76 x 52 x 1 mmMarienfeld1100420
Needles 30GBD Microlance 3304000
PalmSens4 potentiostatPalmSens
parylene-c : dichloro-p-cyclophaneSCS300073
PCB Processing TanksMega ElectronicsPA104
PEDOT:PSS Clevios PH 1000Heraeus
penicillin / streptomycinGibco15140-122
Petri dishFalcon351029
pGP-CMV-GCaMP6fAddgene40755plasmid
Phosphate Buffer Saline solutionThermofisherD8537
Plasma treatment system PE-100Plasma Etch
PlasmaLab 80 Reactive Ion EtcherOxford Instruments
Plastic maskSelba
Plastic weigh boat 64 x 51 x 19 mmVWR10770-454
Poly-dimethylsiloxane: SYLGARD 184 Silicone Elastomer KitDow chemicals1673921
Polyimide copper film 60 µm (Kapton)GoodfellowIM301522
Propan-2-olTechnic574
Protolaser SLPKF
puromycinGibcoA11103
Round cover glass 5 mm diameterFischer scientific50-949-439
Scepter Sensors - 60 µmMilliporePHCC60050
Silicone adhesive Kwik-SilWorld Precision Instruments
spin coaterSüss Microtec
Spin CoaterLaurellWS-650
Super glueOffice depot
tetracycline-free fœtal bovine SerumTakara Bio631105
Thermal evaporator Auto 500Boc Edwards
Two-photon microscopeZeiss LSM 7MP
U87-MGATCCHTB-14Human glioblastoma cells
Ultrasonic cleanerVWR
Vortex VTX-3000LLMSVTX100323410
Xfect single shots reagentTakara Bio631447Transfection reagent

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