Производство биологически Производные инъекций Материалы для тканевой инженерии миокарда

Резюме

Способы получения инъекционный гель матрицу из decellularized ткани и инъекционных его в крысу миокарда В естественных условиях Описаны.

Аннотация

Этот протокол предоставляет методы для подготовки инъекционной внеклеточного матрикса (ECM), гель для инфаркта приложений тканевой инженерии. Короче говоря, decellularized ткани лиофилизированный, измельчают, ферментативно переваривается, а затем привел к физиологическим рН. Лиофилизации удаляет все содержание воды из тканей, в результате чего сухих ECM, которые могут быть земли в мелкий порошок с небольшим заводом. После фрезерования, порошок ECM переваривается пепсином в форме инъекционных матрицы. После корректировки рН 7,4, жидкий материал матрицы может быть введен в миокарде. Результаты предыдущих анализов характеристик показали, что матрица гели производятся из decellularized перикарда и ткани миокарда сохранить собственные компоненты ECM, включая разнообразные белки, пептиды и гликозаминогликанов. При использовании этого материала для тканевой инженерии, в естественных условиях характеристика особенно полезна, здесь метода для проведения очной инъекции в левого желудочка (ЛЖ) свободной стенки представлена ​​как средство анализа принимающей ответ на матрице геля в маленькая модель животного. Доступ к грудной полости достигается через диафрагму и инъекция сделана чуть выше вершины в стене LV бесплатно. Биологически производных лесов могут быть визуализированы биотин-маркировки до инъекции, а затем окрашивание срезов ткани с пероксидазой хрена, конъюгированных neutravidin и визуализации с помощью диаминобензидина (DAB) окрашивания. Анализ области инъекции может быть сделано с гистологическим и иммуногистохимического окрашивания. Таким образом, ранее рассмотрены перикарда и инфаркта гели матрицы были показаны формы волокнистых, пористых сетей и способствовать образованию судно в области инъекции.

протокол

1. Предварительная обработка тканей Подготовка

1. Перед тем как использовать этот протокол, нужно уже decellularized ткани выбора. Для этого примера, свежих свиных и человеческих образцов перикарда являются decellularized использованием гипотонический и гипертонический полосканий в деионизированной (DI) воде и додецилсульфата натрия (SDS).
2. В частности, первой стирки свиного перикарда в воде DI в течение 30 минут, затем размешайте непрерывно в 1% SDS в фосфатном буферном растворе (PBS) в течение 24 часов, после чего 5 часов DI водой смыть. Для человека pericardia, во-первых промыть в воде DI в течение 30 минут, затем размешайте непрерывно в 1% SDS в ФБР для 60-65 часов, после чего всю ночь DI полоскания. Удалите все экземпляры из их окончательное решение и снова промыть под проточной водой DI ^1.
3. Чтобы убедиться в decellularization, удалить небольшой кусочек, свежие заморозить его в октябре замораживания среды, и принять 10 секций мкм ткани через каждые 100 мкм во всем образце для исследования с помощью гистологического анализа, как сообщалось ранее ^34-36.
4. Используйте гематоксилином и эозином (H & E) пятна изучить ткани отсутствие ядер. Можно также использовать люминесцентные Hoescht 33342 пятно (1,0 мкг / мл) для ДНК, чтобы проверить H & E результатов; кратко, исправить разделов, увлажняет и промыть в воде, пятна на 10 минут, а затем хорошо промыть и хранить в темноте. Кроме того, можно использовать комплект, такие как кровь Qiagen DNeasy и тканей комплект, который предназначен для количественного определения общего содержания ДНК образца.

2. Подготовка инъекций ECM

1. Лиофилизация
   1. После соответствующей подготовки, замораживание decellularized образцов с жидким азотом или хранения при температуре -80 ° C. Lyophilize образцов до полного высыхания. В зависимости от вашей системы и содержания воды в ваших образцов, это может занять от 12 до 72 часов.
2. Фрезерование
   1. После полного высыхания, Милль Wiley Мини используется для измельчения сухой ECM в мелкий порошок. Выберите подходящий размер сито для ваших целей, здесь 40 калибр сетки используется. Как только большинство образцов пришло через фильтр, удалить коллекцию банку с измельченной ECM порошок. Если есть только небольшая выборка, остальные образцы могут быть извлечены из мельницы в различных вариантах; здесь, Q-Tip используется для удаления ECM застрял позади стационарных лопасти мельницы.
   2. Всегда убедитесь, что мельница чистыми и свободными от мусора. Важно также, чтобы убедиться, что обе мельницы и ваш образец полностью сухой, оставшуюся влагу вызовет ECM для агрегирования и слипаются, позволяет успешно завершить фрезерования. ECM могут забрать влагу из воздуха и поэтому должны идти непосредственно от лиофилизатор на мельницу.
3. Пищеварение
   1. Для формирования инъекционный ECM, порошок переваривается пепсина. Следующий протокол был изменен с Freyetes и соавт. (2).
   2. Важно сохранить как стерильные продукт насколько это возможно, так как она будет вводится в естественных условиях и загрязнение может вызвать осложнения. Таким образом, использование стерильных флаконов и весят ложки и фильтровать все решения перед использованием. Лиофилизации шаг после фрезерования и перед пищеварения также поможет сохранить стерильность.
   3. Отвесить нужное количество порошка ECM в соответствующий флакон сцинтилляции. Для общего объема меньше, чем 1 мл, то рекомендуется использовать 2 мл флакон и при больших объемах, 20 мл флакон. Это гарантирует, что есть достаточное количество жидкости на дне флакона мешать эффективно.
   4. Отвесить нужное количество пепсина в сцинтилляционный флакон. Добавить 0,1 М HCl, что пепсина при концентрации 1 мг / мл. Убедитесь, что пепсин полного растворения (без частиц), прежде чем использовать это может быть ускорен вортексе решение пепсина.
   5. Добавить пепсина / HCl решение сцинтилляционный флакон с порошком ECM, так что ЕСМ находится в концентрации 10 мг / мл.
   6. Перемешать раствор непрерывно в течение 60-65 часов, периодически очищая вниз стороны флакон с весом ложкой или лопаточкой.
4. Регулировка рН
   1. Этот шаг выполняется принести жидкий материал матрицы к физиологическим рН и для инактивации пепсина, удерживая его от расщепления ECM дальше. Опять же, не забудьте использовать фильтрованную решения сделаны с водой Millipore.
   2. 1 М NaOH добавляют быть 1 / 10 от первоначального объема. Испытание рН в этой точке и добавить небольшое количество (2-10 мкл) NaOH и соляной кислоты, что желаемого значения (7,4) будет достигнута. Следите за всеми небольших количествах добавляется для нейтрализации или снимаются для рН тестирования. Как только решение было нейтрализовано, добавьте 10х PBS быть 1 / 10 от конечного объема (1 / 9 текущий объем). Определить концентрацию инъекционный ECM, а затем добавить 1x PBS для достижения желаемого конечного сотрудничестваncentration, здесь 6 мг / мл.
   3. Характеристика инъекционный ECM можно сделать с помощью SDS-PAGE, Blyscan колориметрический Пробирной GAG, и масс-спектроскопии.
   4. На данный момент, матричного материала может быть введен в естественных условиях для формирования эшафот миокарда тканевой инженерии.
5. Биотин-маркировки
   1. ECM могут быть помечены с биотином перед инъекцией для легкой визуализации вводят ECM.
   2. Подготовка 10mM решение биотин и добавить к инъекционный ECM в соотношении 0.3mg/mg. ECM должна быть не нужной концентрации для инъекций. Если инъекционных при концентрации 6 мг / мл, добавить 40 мкл биотина на 1 мл ECM. До инъекции, держать биотин-ECM решение на льду в течение не менее 1 часа.
6. Все этапы обработки могут быть выполнены при комнатной температуре. Чтобы сохранить инъекционных матрицу из гелеобразования, шаг регулировки рН может быть сделано на льду.

3. Инфаркт Инъекции

1. Инъекция подготовки
   1. Для самок крыс (225-250 г), используемые здесь, 75 мкл инъекции рН 7,4 инъекционный ECM были подготовлены в 0,1 мл шприцы с наконечниками 30 игл колеи. Если самцов крыс (375-400 г), были использованы, 90 мкл может быть введен.
   2. Все хирургические принадлежности должны быть стерилизованы до операции, а здесь мы используем автоклавного хирургических пакет, который содержит все необходимые инструменты.
2. В день операции, Харлан Sprague-Dawley крыс под наркозом использованием изофлуран на 5%, интубированных использованием отоскоп, а затем поддерживается на уровне 2,5% изофлуран течение всей процедуры.
3. Добавить искусственные слезы мазь для глаз животных для защиты от сухости и волос. Администрирование 3 мл лактата Рингера раствор для гидратации во время операции. Это должно быть сделано с помощью подкожных инъекций в нижней области живота.
4. Место животное в лежачем положении на операционном столе и мягко ленты вниз конечностей. Используйте ножницы, чтобы удалить волосы на животе и вакуум свободного волосы до мытья.
5. Сделайте серию небольших инъекций (примерно 50 мкл каждая) 2% раствора лидокаина по диагонали от zyphoid процесса к нижней правой части брюшной полости. Затем скраб три раза бетадин, начиная с середины и перемещаются наружу. Повторите с 70% этанола. Обложка животных использованием хирургического драпировка с готовых круглым окном, безопасный с полотенцем зажимы, если это необходимо.
6. Использование № 10 скальпеля сделать разрез 3-4 см от xyphoid процесса к нижней правой части брюшной полости. Найдите xyphoid процесса и рассекают вертикально вниз через мышцы справа, соблюдая осторожность, чтобы избежать большого судна справа. После того как вы расчлененный через мышцу, используйте ножницы, чтобы вырезать сбоку через мышцы, подвергая диафрагмы. Будьте осторожны, чтобы избежать печени.
7. Использование 36 дюймов длиной 3-0 Vicrile шва и пару hemostats, привод одной иглы через zyphoid процесса и тянуть шов на полпути. Лента концах шва вместе, и исправить это в точку, выше и позади животного существу подъема zyphoid и подвергая диафрагмы. С другой 36 дюймов длиной 3-0 Vicrile шва, привод иглы через мышцу ближе всего к xyphoid процесса и, опять же, протащить и закрепить концы с другой точкой справа от хирургический стол, полностью подвергая хирургической полости.
8. В этот момент вы должны быть в состоянии видеть сердца через диафрагму. С помощью небольшой пару microforceps крысы зуба, захватить центр диафрагмы, вытяните ее на себя и сделать очень маленький разрез с тупыми ножницами. Крайне важно использовать очень тупыми ножницами, чтобы не тыкать легких. Как только эта дыра была сделана, легкие убирается, что позволит вам сделать 2-3 см разрез по вертикали через диафрагму для визуализации сердца.
9. Вставьте 3-дюймовый Q-Tip, чтобы слева от полости подтолкнуть легких с пути. Используйте полотенце зажим для обеспечения Q-Tip на месте. Используйте другой Q-Tip, чтобы переместить правого легкого в сторону, для того, чтобы найти перикард. Используя пару microforceps и пара крупных щипцы зубчатые, слезоточивый через перикард, выставляя верхушке сердца. Если животное ранее прошли процедуру миокарда, перикарда уже будет отсутствовать.
10. Захватите верхушке сердца с microforceps крысы зуба и вводят жидкий материал матрицы треть путь от вершины. Вставьте иглу параллельно поверхности эпикарда и ввести с скошенным краем иглы влево. Будьте уверены, чтобы избежать большой сердечной вены. Подождите несколько секунд, прежде чем снимать иглы. Вы должны увидеть отбеливания тканей в месте инъекции.
11. Очистка крови в полости и удалить зажим полотенце и Q-Tip, что держал в руках правого легкого. Используйте изогнутые microhemostats и крысыmicroforceps зуб, чтобы закрыть диафрагму. Сделать первоначальный узел, а затем использовать зубчатые щипцы и microhemostats, чтобы закрыть диафрагму с непрерывным швом и конические иглы. Прежде чем закрыть полностью, вставить PE160 всасывающей трубы и использовать шприц 10 мл эвакуировать грудной полости, как шов затягивается.
12. При правильном эвакуирован и закрыт, диафрагма должна быть вогнутой. Диафрагмы выпуклой указывает, что есть еще воздух в полость.
13. На данный момент изофлуран может быть включен до 1%.
14. Выньте и 3-0 Vicrile швов проведения полости открытым. Использование стерильной воды для увлажнения мышц, вытирая избыток покончить с Q-Tip или стерильной марли. Используйте новую длину 3-0 шва, чтобы закрыть мышечного слоя с прерывистыми швами.
15. На данный момент, изофлуран может быть отключена.
16. Чистая площадь стерильной водой и использовать скобы, чтобы закрыть кожи. Если скобы будет вмешиваться в исследовании, 5-0 пролин шва также может быть использован. В этом случае используйте обратную резки (RC) иглой, чтобы закрыть кожи с прерывистыми швами. В обоих случаях место хирургического клея по замкнутой разрез.
17. Использование Q-Tip, чтобы помазать разреза с тройной антибиотик мазь.
18. Разрешить животных восстановить до 100% кислорода.
19. Когда животные начинает дышать вокруг вентилятора, снимите трубку трахеи.
20. Как только животные грудины, администрирования подкожного введения 0,05 мг / кг бупренорфина гидрохлорида и вернуть их в родную клетку на стерильные полотенца.
21. Животные должны получать послеоперационное наблюдение и уход.
22. В то время, достопримечательности, животных усыпляют и сердца снимается для анализа. Короткие сечения оси принимаются и могут быть окрашены гематоксилином и эозином (H & E) за грубые анализа тканей. В короткие моменты времени, вводится регионе появится как розовый, волокнистой сети, которая распространилась interstitially. На более поздних моментов времени, будет наблюдаться приток клеток и возможной деградации вводится матрица после 2 до 3 недель. Если ECM метили биотином перед инъекцией, он может быть более непосредственно визуализировали окрашиванием биотин с HRP-сопряженных стрептавидином. Иммуногистохимическое окрашивание может быть использован для выявления конкретных элементов или структур в области инъекции, здесь слайды были совместно окрашенных FITC-сопряженных isolectin, который связывается с эндотелиальными клетками и флуоресцирует зеленым и анти-актин гладких мышц антитела с Alexafluor вторичной антитело, отчеты ГМК в красный цвет.

4. Представитель Результаты

Предыдущая характеристику матрицы материалы, подготовленные таким образом продемонстрировали сохранение различных макромолекул. В частности, несколько белков и гликопротеинов волокнистых были идентифицированы с помощью масс-спектрометрии (табл. 1). Если матрица материалы обрабатываются в соответствии с этим протоколом оказываются уже не содержат сложный набор макромолекул, может быть, что decellularization протокол занято слишком суровым. После полной лиофилизированный, сушеные перикарда ЕСМ выглядит как очень жесткая, мятой бумаги. Другие типы тканей будет выглядеть упаковка арахиса. Если фрезерованные хорошо, ECM должна опускаться через сито и собрать в банку на дне. Если есть влага остается в образце, ЭСУД слипаются и застрять в фрезерные камере. После переваривания, решение ECM должна быть молочного цвета и полностью свободной от видимых частиц. Он также будет слегка более вязкой, чем HCl в одиночку. Если ECM не переваривает хорошо, все еще будет большой частиц во флаконе, можно также ECM может произойти сбой из раствора. После регулировки рН, нет никаких видимых изменений в решение, и ECM-прежнему облачно, однородной жидкости. Если он начнет гель, вязкость увеличится, и это будет трудно или невозможно сделать материал вверх в шприце. Если это произойдет, выполните шаг регулировки рН на льду, с предварительно охлажденной решений. После инъекции были подготовлены, держите их на льду до использования. Если инъекция успешно, область вокруг кончика иглы отбеливает и небольшой болюсного видна. Если этого не наблюдается, инъекции, возможно, пошли в камеру, а не в стену. При наложении швов животных после инъекции, тщательное закрытие диафрагмы самый важный шаг. Если все сделано правильно, диафрагма будет плотно прилегает легких и появится вогнутой. Если есть воздух, оставшиеся в легкие, диафрагма останется выпуклым, или районе, где он из воздушных шаров. При рассмотрении гистологии инъекции региона на ранней стадии времени (30 минут до 4 часов после инъекции), следует видеть розовые, волокнистых области, которая лишена клетки это собрали материал матрицы после инъекции (рис. 2) . Сети часто распространяется interstitially и может присутствовать во многих разделах. ПОССible объяснение видеть только очень небольшую площадь матрицы геля является то, что часть инъекции пропустил очной цели и был либо вводят в LV камеры или утечка из инъекции месте. Кроме того, в зависимости от времени гелеобразования, интерстициальный распространение которых может варьироваться.

Рисунок 1. Полиакриламидном геле (ПААГ) результаты. () Молекулярная стандартного веса. (B) Крыса хвостом коллагена I типа (2,5 мг / мл) по сравнению с солюбилизированного человека (C) и свиней (D) перикарда ECM (7 мг / мл). Обратите внимание на наличие коллагена, а также ряд других белков и пептидов в перикардиальной образцы матрицы.

Таблица 1. ECM компонентов отождествляется с масс-спектроскопии.

Рисунок 2 Инфаркт инъекции. Гелеобразования в естественных условиях. H & E пятно человека (A) и свиней (B) перикарда инъекции матрицы, которые загущенное в естественных условиях в течение 45 минут. Стрелки обозначают матрицы месте, окрашенные светлее розовый, чем миокард. Шкала бар составляет 500 мкм.

Рисунок 3. Сосудистые клеточная инфильтрация. Флуоресцентные пятна на судах, вводят человека (АС) и свиней (DF) матрицы гелей на две недели. Эндотелиальные клетки помечены зеленым цветом (A, D), а гладкие мышечные клетки помечены красным (В, Е). Объединенный изображения показаны на C и F. шкалы составляет 100 мкм. Белый пунктирной линии показывают области инъекции матрицы, как это определено H & E анализа близлежащих разделе.

Рисунок 4. Стволовые клетки в области инъекции матрицы. Hoescht пятно для ядер (синий) и с-комплекта (зелеными) определяет стволовых клеток человека (A) и свиней (B) областях матрицы инъекции. Шкала бар 50 мкм.

Обсуждение

Этот метод позволяет поколение биологически получены, инъекционные лесов для инфаркта тканевой инженерии. Хотя эти методы были первоначально разработаны для изготовления и в естественных условиях тестирования инфаркт гель матрицы и представлена ​​здесь с перикарда гель матри...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents:
Pepsin	Sigma-Aldrich	p6887-1G	Lyophilized
Biotin	Thermo Fisher Scientific, Inc.	21217
Neutravidin-HRP	Thomas Scientific	21130
Equipment:
Wiley Mini Mill	Thomas Scientific	3383L10
Labconco Lyophilizer	Labconco Corp.	7670520
Surgical supplies:
Betadine	Purdue Products L.P.	67618-154-16
Lactated Ringers Solution	MWI Veterinary Supply	003966
KY Jelly	MWI Veterinary Supply	28658
Lidocaine, 2%	MWI Veterinary Supply	17767
Buprenorphine hydrochloride	Reckitt Benckiser	12496-0757-1
Artificial tear ointment	Fisher Scientific	NC9860843
Triple antibiotic ointment	Fisher Scientific	19082795
Isoflurane	MWI Veterinary Supply	60307-120-25
Otoscope	MWI Veterinary Supply	008699
Stop cock	MWI Veterinary Supply	006245
3-0 Vicrile suture	MWI Veterinary Supply	J327H
5-0 Proline suture	MWI Veterinary Supply	s-1173
Reverse cutting (RC) needle	Ethicon Inc.	8684G
Microhemostats	Fine Science Tools	13013-14
Rat tooth microforceps	Fine Science Tools	11084-07
No. 10 scalpel	Fine Science Tools	10110-01
Blunt scissors	Fine Science Tools	14108-09
Sharp, curved scissors	Fine Science Tools	14085-08
Large, serrated forceps	Fine Science Tools	1106-12
PE160 suction tubing	BD Biosciences	427430
Clippers	MWI Veterinary Supply	21608
Skin staples/stapler	Ethicon Inc.	PRR35
General supplies:
Stir plates
0.1 M HCl
1 M NaOH
10x PBS
1x PBS
70% Ethanol
0.1 mL syringes
10 mL syringe
Q-tips
Surgical glue
Surgical drape
Towel clamps
Small hand-held vacuum