Кристаллизация Мембранные белки в липидных Мезофазы

Резюме

Протоколы описать основные шаги для получения дифракционных качество кристаллов мембранный белок, начиная от воссоздания белков в липидный кубической фазы (КСУ), найти начальные условия с LCP-FRAP предварительной кристаллизации анализов, создание LCP испытаний кристаллизации и уборки кристаллов .

Аннотация

Мембранные белки выполняют важные функции в живых клетках, связанных с передачи сигнала, транспортных и энергетических преобразований, и, как таковая, вовлечены в множество сбоев и заболеваний. Тем не менее, структурные и функциональные пониманию мембранных белков сильно отстает от своих партнеров растворимым, главным образом, из-за трудностей, связанных с их растворения и образования кристаллов дифракционных качества. Кристаллизация в липидных мезофаз (также известный как при кристаллизации мезо или ЛКП) является перспективной техники, которая была успешно применена для получения высоких структур разрешение микробных rhodopsins, фотосинтетических белков, внешний баррелей бета-мембраны и G-белком рецепторы. В мезо кристаллизации использует родной подобные мембраны окружающей среды и обычно производит кристаллы с более низким содержанием растворителя и лучше заказов по сравнению с традиционными кристаллизации из моющих растворов. Метод не сложно, но требует понимания липидного поведение фазы и практики в обработке вязких материалов мезофазы. Здесь мы показываем, простой и эффективный способ сделать LCP и восстановлении мембранных белков в липидный бислой LCP при помощи шприца смеситель, затем выдачи nanoliter части LCP в анализе или кристаллизации пластины, проведении предварительной кристаллизации анализов и сбора урожая кристаллов из Матрица LCP. Эти протоколы обеспечивают базовое руководство для приближения в испытаниях мезо кристаллизации, однако, как и любой эксперимент кристаллизации, обширные проверки и оптимизации требуется, и успех не всегда гарантирован.

протокол

Типичный контур в эксперименте кристаллизации мезо показано на рис.1 ^1,2. Предварительно кристаллизации LCP-FRAP анализы не являются обязательными, однако, они могут значительно ускорить процесс поиска начальных условий кристаллизации, особенно в случае сложных белков мембраны ^3.

1. Белки Восстановление в КСУ

1. Purify мембранного белка интереса к моющим раствором и сосредоточиться белка / моющего средства комплексов до ~ 10 - 20 мг / мл, заботясь, чтобы не за-концентрат ^1,4 моющего средства.
2. Передача ~ 25 мг LCP липидного хоста (как правило, моноолеина) или липидные смеси в 1,5 мл пластиковая трубка и инкубировать при температуре 40 ° С в течение нескольких минут, пока липидного расплавов.
3. Прикрепите шприц переходник для 100 мкл газонепроницаемый шприц.
4. Нагрузка шприц с расплавленным липидного использованием регулируемой пипетки объемом. Запись объема липидов в шприц.
5. Нагрузка еще 100 мкл шприц раствор белка в растворе белка-на-липидный соотношение 2 / 3 В / В.
6. Подключите оба шприцы вместе через шприц муфты.
7. Нажмите шприц плунжеров попеременно двигаться липидов и белков через внутреннюю иглу ответвитель, назад и вперед, пока липидного мезофазы становится однородным. LCP формы спонтанно после механического перемешивания, а белок становится воссоздана в липидный бислой LCP. Формирование КСУ может быть проверена путем ее прозрачной и гелеобразной консистенции и из-за отсутствия birefringency, если смотреть под микроскопом оснащен кросс-поляризаторы, или, если возможно, с помощью малоуглового рентгеновского дифракционного ^1.

2. LCP-FRAP предварительной кристаллизации Анализы

LCP-FRAP тесты предназначены для измерения свойств диффузии мембранных белков воссоздана в КСУ в различных условиях скрининга ^3. Дальний диффузии мембранных белков в КСУ имеет важное значение для успешной кристаллизации, однако, микроструктуры LCP ограничивает диффузию больших белков или олигомерных агрегатов белка. Распространенная причина провала в эксперименте кристаллизации мезо это быстрый агрегации белков приводит к потере диффузии. Было показано, что агрегация поведение белка зависит от конкретного построить белка, липидов и хост состав скрининга решение ^3.

1. Этикетка белок с флуоресцентным красителем (Cy3 или подобный) на белок / краска отношение ~ 100 / 1, удаления непрореагировавшего красителя и концентрат белка до ~ 1 мг / мл. Этикетка либо бесплатно, амины или бесплатно тиолов. При маркировке свободных аминов, использование рН между 7 и 7,5 до преимущественно этикетке свободных N-конца. Помните, что аминокислоты маркировки может также этикетки липидов совместно с очищенным белком ^2,3.
2. Развести меченых белков в КСУ, как описано в разделе 1).
3. Настройка анализа пластин, как описано в разделе 3), используя LCP-FRAP решения скрининга вместо кристаллизации экраны ^2.
4. Инкубируйте пластин при 20 ° С в темноте в течение не менее 12 часов для достижения равновесного состояния.
5. Разместите один из пластин на LCP-FRAP станции и сосредоточиться на первой скважины использовании 10x цели.
6. Приобретать 5 флуоресцентные изображения для захвата начальной предварительно просветленного состояния.
7. Триггер лазера. Мощность лазера и количество импульсов должна быть скорректирована, чтобы отбелить ~ 30 - 70% меченого белка в середине беленой месте.
8. Сразу же после запуска лазера, начать запись быстро после отбеливания последовательность ~ 200 изображений в максимально возможной скоростью.
9. Следуйте с записью медленный после отбеливания последовательность ~ 50 изображений, выбор задержки между снимками, как 1-20 с, в зависимости от скорости диффузии белка.
10. Интеграция интенсивности внутри отбеливателя место во всех кадрах и исправить ее для отбеливания и световую интенсивность колебаний при приобретении путем деления интенсивности внутри беленой пятно усредненная интенсивность ссылкой месте за пределами лазерной беленой области.
11. Нормализация исправлены интенсивности, чтобы предварительно отбеленной интенсивности равны 1, а начальная беленой интенсивность равна 0.
12. Fit кривой нормированной интенсивности в зависимости от времени, F (т), по следующей формуле ^5:
    F (т) = М х ехр (-2Т / т) х (я ₀ (2Т / т) + I ₁ (2Т / т)), (Eq.1)
    где М мобильных долю диффундирующих молекул, T-характерное время диффузии, т есть реальное время каждого записанного кадра, I ₀ и I ₁ в ^0-й и ^1-го порядка модифицированные функции Бесселя.
13. Вычислить коэффициент диффузии, D, как:
    D = R ² / 4Т (Eq.2)
    где R-радиус беленой месте.
14. Перемещение то следующем хорошо и повторите шаги 2,5) - 2.13).
15. Сравнить мобильный фракций и коэффициентов диффузии, полученные для различных условий отбора. Дизайн новой кристаллизации экранов на основе компонентов, которые облегченной диффузии белка и без учета условий, при которых белок диффузии не наблюдалось. Если белка не диффундируют в любом из экранированных условиях, рассмотреть вопрос о расширении пространства скрининга или пытаются построить новый белок.

3. Настройка LCP Испытания Кристаллизация

1. Развести белка в КСУ, как описано в разделе 1).
2. Передача белка нагруженные LCP в 10 мкл газонепроницаемый шприц прилагается к повторяющимся диспенсер шприц.
3. Прикрепите короткое съемной иглой (калибр 26, 10 мм длина) до 10 мкл шприц.
4. Внесите 200 нл болюсов LCP на поверхности четырех соседних скважин формирования квадрат 2х2.
5. Наложение каждого из болюсов КСУ с 1 мкл соответствующего решения экране кристаллизации.
6. Cap четыре загружены скважин с 18 мм квадратных покровного стекла. Применить мягкое давление на покровное для герметизации скважин.
7. Повторите шаги 3.4) -3,6) со следующим набором 4 скважины, пока вся пластинка будет заполнен.
8. Инкубируйте планшет при постоянной температуре, периодически проверяя образования кристаллов и роста.

4. Сбор кристаллов из LCP

1. Место пластина с кристаллами белка под стерео микроскоп с переменным увеличением, оснащен линейными вращающимся поляризатором и анализатором.
2. В центре внимания также интерес использование низких трансфокации так что все хорошо помещается в поле зрения.
3. Оценка покровного стекла в четыре удара решения квадратных внутри и границы использования острый угол керамического капиллярного резки камня.
4. Пресс всему периметру забил с сильным острым пинцетом точки для распространения через царапины толщина покровного стекла.
5. Удар два маленьких отверстия на противоположных углах квадрата забил.
6. Inject несколько мкл осадителя раствора через одно из отверстий, чтобы уменьшить обезвоживание во время последующих шагов.
7. Использование угловой резкое зонда иглы разбить стекло вдоль одной или двух сторон, чтобы освободить выреза площади.
8. Аккуратно поднимите смотреть стекло квадрат для кубических болюсного фазу. Если болюсного прилипла к покровным, затем переверните стекло квадрат снова и место на дне колодца.
9. Добавить дополнительные несколько мкл осадителя решения, дополненные крио-защитное, в случае необходимости, на вершине подвергается кубических болюсного фазы в скважине.
10. Увеличение увеличением микроскопа и сосредоточиться на кристалле.
11. Отрегулируйте угол между поляризатором и анализатором, чтобы увеличить контраст между двулучепреломляющих кристалла и фона, сохраняя при этом достаточно света, чтобы увидеть уборки петли.
12. Выберите MiTeGen MicroMount с диаметром соответствующий размер кристалла, а затем урожай кристалла непосредственно из КСУ по черпая ее в MicroMount.
13. Flash Freeze MicroMount с собрано кристалла в жидком азоте, и отправить ее в beamline синхротронного источника рентгеновского сбора данных ^6.

5. Представитель Результаты:

Инженерии человека бета-2 адренергические G-белком рецептор (β _2-АР T4L) была высказана в бакуловирусной инфицированных Sf9 клетках насекомых и очищенный в dodecylmaltoside (DDM) / гемисукцинат холестерина (ХС) раствором моющего средства связаны с частичным обратным агонистом carazolol ^7. Белка была помечена Cy3 эфир NHS и используются в LCP-FRAP предварительной кристаллизации анализы (рис. 2). Грубые экранов сетка основана на нескольких условиях, выбранных по результатам LCP-FRAP анализы производятся начальные кристаллические хитов (рис. 3). Дальнейшая оптимизация осадителя условия дали дифракции качество кристаллов (рис. 4).

Рисунок 1. Блок-схема типичного эксперимента кристаллизации LCP. Шаги в серые коробки, не описанных в текущих протоколов.

Рисунок 2. LCP-FRAP пробы с β ₂ AR-T4L/carazolol в моноолеина основан LCP. ) Результаты LCP-FRAP анализ выполняется в автоматическом высокой пропускной режим, в котором каждый образец 96-луночного планшета отбеливается последовательно и флуоресценции восстановления измеряется после 30 мин инкубации. Получить флуоресценцию возмещений, которые представляют собой мобильные долю в каждом образце, построены для всех 96 образцов. Скрининга растворы содержат 0,1 М Трис рН 8, 30% об. / ПЭГ 400 в сочетании с 48 различных солей в двух различных концентрациях. Б) восстановления флуоресценции профилей для нескольких репутацияставителем условиях. Сплошные кривые линии представляют подходит уравнением. 1.The мобильных фракций и коэффициентов диффузии определяются по формулам. 1 и 2. Быстрое восстановление менее 10% в образце, содержащем хлорид натрия связано с флуоресцентно меченных липидов совместно с очищенным белком.

Рисунок 3. Первоначальные хитов кристалла β ₂ AR-T4L/carazolol получен грубый отбор сетку вокруг наиболее перспективные условия, определенные LCP-FRAP, содержащих Na сульфат (панели) и Na Формиат (группа В). Белок помечены Cy3 эфир NHS и флуоресцентные изображения, сделанные с использованием возбуждения при 543 нм и эмиссии при 605 нм.

Рисунок 4. Оптимизированная кристаллы β ₂ AR-T4L/carazolol. Изображения кристаллов, выращенных в присутствии сульфата натрия (панели и В) и К Формиат (панели C и D) берутся в режиме светлого (панели и С) и с помощью кросс-поляризаторов (панелей B и D).

Обсуждение

Протоколы обеспечивают основные визуальные руководства для основных этапов выполнения в экспериментах мезо кристаллизации. Более углубленное детали, связанные с этими протоколами, подчеркнув, возможных подводных камнях, недостатки или альтернативные маршруты имеются в других местах ^1,2. Дополнительный LCP-FRAP анализы могут помочь на более ранних стадиях, чтобы выбрать наиболее перспективные белка построить, LCP липидного хоста и липидного добавок, а также ограничить диапазон возможных осадителей и буферных условиях ^3. Как только первоначальный удар кристаллизации найден, он должен быть оптимизирован для получения лучшего качества кристаллов. Оптимизация в условиях мезо кристаллизации по сути похожа на оптимизацию условий для растворимых белков с добавлением дополнительных параметров, связанных с составом КСУ ^1. Мембранные белки кристаллов, выращенных в липидных мезофазы, как правило, меньше по размеру, чем кристаллы, полученные в растворе моющего средства, но более упорядоченной, таким образом, извлечение преимуществ от использования сильно микрофокусной beamlines доступны в современных источниках синхротронного ^6.

Многие из процедур, связанных с в мезо кристаллизации, в том числе создание кристаллизации или анализа пластины, проведении LCP-FRAP анализов и выявления кристаллов, были полу-или полностью автоматизированной ^1,2,8,9, позволяя скрининга большого диапазона условий но при этом потребляет небольшое количество белков и липидов. С другой стороны, белок reconstitutions в КСУ и кристально уборки остаются ручные и более утомительным операций и, таким образом, есть потребность в улучшении.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 μL gas-tight syringe	Hamilton Co	7656-01	2 syringes are required
10 μL gas-tight syringe	Hamilton Co	7653-01
Syringe coupler	Hamilton Co	7770-02 30902	The coupler can be made using available parts as described in refs. 10
Repetitive syringe dispenser	Hamilton Co	83700	The repetitive syringe dispenser can be modified to reduce dispensing volume by ~3 times11
Short (0.375”) flat-tipped removable needle (point style 3, gauge 26)	Hamilton Co	7804-03
96-well glass sandwich plate	Marienfeld	08 900 03	For manual operations it is more convenient to assemble the glass sandwich plate using a standard microscope glass slides and a double sticky tape with punched holes1,2,12.
Glass cover slip	Electron Microscopy Sciences	63787-01
monoolein	Sigma-Aldrich	M7765
Crystallization screens	Hampton Research, Molecular Dimensions, Emerald Biosystems, Jena Bioscience		Most of available commercial screens can be used for initial screening. Conditions that consistently disrupt LCP can be diluted 2x for better compatibility13.
Capillary cutting stone	Hampton Research	HR4-334
Fine point tweezers	Ted Pella, Inc.	510
Angled sharp probe	Ted Pella, Inc.	13650
MicroMounts	MiTeGen	M1-Lxx-xx	Select MicroMount diameter to match the crystal size