Разбор и Окрашивание Drosophila Личинок Яичники

Резюме

Как ниши и стволовые клетки образуются во время развития является важным вопросом практические последствия. В Drosophila Яичников, зародышевой линии стволовых клеток и их соматического ниши форме в течение личиночного развития. Это видео демонстрирует, как до расчленения, пятна и смонтировать женщин гонады с конца третьего возраста (LL3) Drosophila Личинок.

Аннотация

Многие органы зависят от стволовых клеток для их развития в период эмбриогенеза и для технического обслуживания или ремонта в течение взрослой жизни. Понимание того, как стволовые клетки образуются, и как они взаимодействуют с окружающей их средой Поэтому крайне важно для понимания развития, гомеостаза и болезни. Яичник плодовой мушки дрозофилы служил влиятельной моделью для взаимодействия зародышевой линии стволовых клеток (GSCs) с их соматических клетках поддержки (ниши) ^{1, 2.} Известно расположение нишу и GSCs, в сочетании со способностью к генетически манипулировать ими, позволило исследователям выяснить различных взаимодействий между стволовыми клетками и их ниши ^3-12.

Несмотря на огромное количество информации о механизмах управления GSC обслуживания и дифференциацию, относительно мало известно о том, как GSCs и их соматической форме ниши в процессе разработки. Около 18 соматических ниши, которых клеточные компоненты включают нити терминала и крышка клетки (рис. 1), форму в течение третьего личиночного возраста ^13-17. GSCs происходят из первичных половых клеток (PGCs). PGCs размножаться на ранних личиночных стадиях, но после образования нишу подгруппе PGCs становится GSCs ^{7, 16, 18, ​​19.} Вместе нишу соматических клеток и GSCs сделать функциональный блок, который производит яйца в течение всей жизни организма.

Многие вопросы, касающиеся образования GSC единицы остаются без ответа. Такие процессы, как координация между клеток-предшественников для ниш и прекурсоров стволовых клеток, или поколение асимметрии в PGCs, поскольку они становятся GSCs, наилучшим образом может быть изучен в личинку. Тем не менее, методические исследования личиночного развития яичников физически сложно. Во-первых, личиночной яичников малы. Даже в конце личиночной стадии они только 100 мкм в диаметре. Кроме того, яичники являются прозрачными и встроены в белый жир тела. Здесь мы опишем шаг за шагом протокол для выделения яичниками с конца третьего возраста (LL3) Drosophila личинки, после окрашивания с флуоресцентными антителами. Мы предлагаем некоторые технические решения проблем, таких как размещение яичников, окрашивания и стирки тканей, которые не тонут, и убедившись, что антитела проникают в ткани. Этот протокол может быть применен к ранее личиночной стадии и личиночной яички, а также.

протокол

1. Яйцо укладки

1. За пять дней до вскрытия: разрешить повязана самок откладывают яйца в течение 2-4 часов на свежие продукты питания дополнена с дрожжами. Чтобы получить синхронизированы и хорошо развитые личинки, важно не иметь переполненных культурный (около 30 яиц / 25mm флакон). Как правило, 7-16 женщин используются на флакон, в зависимости от того, насколько хорошо они лежали.

2. Выбор личинки

1. Подготовка 9-а стекло рассекает блюдо заполнено средой Рингера (128 мм NaCl, 2 мМ KCl, CaCl ₂ 1,8 мм, 4 мм MgCl _2, 35.5mM сахарозы, 5 мМ рН Hepes 6.9).
2. Подготовка ячейки сита в шесть-луночного планшета среде, содержащей Рингера и поместите его на лед. Кроме того, мы используем специально изготовленные формы оснащены нейлоновой сетки.
3. Выберите приурочен личинок из флакона стен с использованием тонких биологических пинцет (щипцы) и поместите их в сдерживании рассекает блюдо Рингера.
4. Передача женщин личинки к чистой хорошо. Мы различаем самок от самцов по их половых желез. Мужские яички легко идентифицируются как большие ясно овалы встроенный в задней трети жира в организме. Женские яичники, расположенный в той же части жира в организме, могут быть идентифицированы как гораздо меньше, ясные, круглые сферах.

3. Препарирование личинка

1. Держите личинки вниз только сзади мозга щипцами и удалить голову вторая пара щипцов.
2. Положите оставшиеся задней части на спинной стороне, с трахее вниз.
3. Держите личинки задних дыхальца с одной парой щипцов и толкать ее внутрь медленно, в то время как другая пара скользит кутикулу назад, пока примерно половина тела личинки жира всплывает.
4. Крепко держите заднему концу и использовать другую пару щипцов, чтобы свободно провести кутикулы. Аккуратно и медленно тронуться с места задним концом так, что кутикула и прилагается слайд кишечника через щель. В конце этого процесса, жира должно быть полностью отделено от кишечника и кутикулы. Отключите кишечник от передней части жира в организме. Для окрашивания и монтажа проще, важно, чтобы жир остался нетронутым.
5. Влажные пастбище пипеткой тщательно со средним Рингера, предпочтительно также содержащие расчлененный личинок. Это помогает пальто пипетки и предотвращает жира от прилипания к ним. Использование пастбищ пипетки для передачи жира в организме в среду Ringer ледяной в ячейки фильтра.

4. Фиксация и Окрашивание

Все действия выполняются при комнатной температуре, за исключением первой инкубации с антителом, при 4 ° C.

1. Инкубируйте жира в 5% формальдегида в среде Рингера. в течение 20 минут с нежным агитации.
2. Промыть в течение 5 минут с 1% PBT (1% Тритон Х-100 в PBS). Повторите это действие в течение 10 минут и третий раз в течение 45 минут. 1% Тритон Х-100 требуется для перфорации личиночной яичника и позволяют антител к проникнуть в нее.
3. Блок с 0,3% PBTB (0,3% Тритон Х-100 и 1% BSA в PBS) в течение 1 часа с нежным агитации
4. Инкубируйте с желаемым ^1-й антител разводят в 0,3% PBTB в течение ночи при 4 ° С с нежным агитации. Этот шаг обычно выполняется в 0,2 мл трубок на роликах.
5. Передача жира тело обратно в камеру фильтры.
6. Промыть 3 раза, 30 минут каждый, с 0,3% PBTB с нежным агитации.
7. Блок с 0,3% PBTB с добавлением 5% нормальных осла сыворотке в течение 1 часа с нежным агитации.
8. Инкубируйте с соответствующими вторичными антителами разводненная (в соответствии со спецификацией производителя) в блокирующий раствор (0,3% PBTB с добавлением 5% нормальной сыворотки осла в 0,3% PBT) в течение 2 часов с нежным агитации. Если антитела люминесцентные, инкубировать в темноте с этого момента. Этот шаг обычно выполняется в 0,2 мл трубок на роликах.
9. Промыть 3 раза по 30 минут каждая с 0,3% PBT с нежным агитации.

5. Монтаж

1. Передача жира в организме в чистую пробирку Эппендорф. Очень тщательно удалите все жидкости подальше и сразу же накрыть Vectashield монтажа средств массовой информации. Мы используем vectashield регулярно, поскольку он не затвердевает в то время как яичники, отделившись от жира в организме.
   Образцы могут храниться при монтаже средств массовой информации при 4 ° С не более недели.
2. Отрежьте конец кончиком пипетки и использовать его для передачи тщательно жира в организме с минимальным объемом монтажных средств массовой информации (около 30 мкл для 30мм покровное стекло) на предметное стекло.
3. Используйте две никелированные держателей контактный, держа 0,1 мм в диаметре контакты распространяться жира в организме. Яичники расположены в задней трети жира в организме. Жира в организме, что их окружает, как правило, форму 'цветок'. Это помогает определить расположение яичников. Рассеките из "цветы" от остального жира в организме и выбросить последнего.
4. Удаление жира surro телаunding гонады путем скрещивания два контакта тщательно вокруг него. Место изолированных гонады на слайде от жира остаток тела.
5. Накрыть крышкой и скольжения печать с лаком для ногтей.
6. Визуализируйте непосредственно с помощью конфокальной микроскопии. Образцы могут храниться при температуре 4 ° С на срок до трех недель.

6. Представитель Результаты

Мы использовали выше протокол последовать создание нескольких клеточных поколений в яичнике соматические, в том числе GSCs и их соматического ниши. Для этой цели мы используем специфические антитела и маркеры, чтобы различать различные типы клеток в развивающемся гонады. Здесь мы показываем пример двух LL3 яичников окрашивали различные комбинации антител. Рисунок 1А подчеркивает нити терминала и крышка клетки (зеленый), которые в совокупности образуют соматических клеток нишу. Рис 1B, показывает, приобщенных клеток (ИС, пурпурный), которые напрямую связаться половых клеток (синий).

Рисунок 1. LL3 яичников. (А) моноклональное антитело 1В1 (пурпурный) очертания соматических клеток и пятна fusome, внутриклеточных органелл внутри PGCs (стрелки). Ловушка усилитель чч-LacZ (анти β-галактозидазы, зеленый) выражается в терминале нитей. В основе нити соматических клеток колпачок (стрелки) можно наблюдать. (Б) 1В1 антитело (зеленый) очертания всех соматических клеток в яичнике. Анти-Васа (синий) этикетки всех PGCs. PGCs обратиться непосредственно приобщены клеток (ИС, анти-пробке, пурпурный). Бар (для А и В) составляет 20 мкм.

Обсуждение

Это видео демонстрирует изоляции и окраске протокол конце третьего возраста яичники личиночной. Для выполнения этого протокола в плановом порядке и надежно, следует обратить внимание на следующие моменты:

1. Для синхронизации и хорошо развитые личинки, за скученности следует изб...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
NaCl	JT Baker
Kcl	Merck & Co., Inc.
CaCl2	Sigma-Aldrich
MgCl2	Merck & Co., Inc.
Sucrose	JT Baker
Hepes	Sigma-Aldrich
PBS	Sigma-Aldrich
Triton X-100	Sigma-Aldrich
Albumin Bovine Fraction V	MP Biomedicals	160069
Dumont biology tweezers 5 dumstar polished	Fine Science Tools	11295-10
Nickel plated pin holder	Fine Science Tools	26018-17
s.s minutien pins 0.1mm diam, 10mm long	Fine Science Tools	26002-10
9 well plates 85X100 mm, 22mm o.d.x7mm deep	Corning	7220-85
Stereo Microscope MZ 16.5 with a standard transmitted light base TL ST	Leica Microsystems
6 well plates	Costar	3516
Slides	Menzel-Glaser	798
Cover slips	Corning	2940-223
Mounting media	Vectashield	H-1200
Cell strainer	Falcon BD	FAL352350
1B1 antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank
Anti-Traffic Jam	Laboratory of Dr. Dorothea Godt
Anti-Vasa	Laboratory of Dr. Ruth Lehmann
Anti β-Galactosidase	Cappel
Secondary Antibodies	Jackson ImmunoResearch