Создание и распространение опухолей человека Ретинобластома в иммунодефицитных мышей

Резюме

Метод описан для распространения опухолей человека ретинобластомы у мышей. Опухолевые клетки напрямую вводили в глазах иммунодефицитных мышей. Вторичные опухоли были успешно созданы с использованием как клетки непосредственно найденным опухолей человека и культурной tumorspheres.

Аннотация

Культивирование ретинобластома опухолевых клеток в определенных СМИ стволовых клеток приводит к первичному tumorspheres которые могут быть выращены и поддерживается только в течение ограниченного времени. Эти культурные tumorspheres могут проявлять заметно различных клеточных фенотипов, когда по сравнению с первоначальной опухоли. Демонстрация того, что культивируемые клетки имеют возможности формирования новых опухолей, важно обеспечить, чтобы культурная модель клетки биологии опухоли.

Здесь мы приводим протокол за распространение опухолей человека ретинобластомы в естественных условиях использования RAG2 ^{- / -} иммунодефицитных мышей. Искусственный человеческий tumorspheres ретинобластома низкого прохода или клеток, полученных из свежесобранных опухолей человека ретинобластома вводится непосредственно в полость стекловидного тела мышиных глаз форма опухоли в течение 2-4 недель. Эти опухоли могут быть собраны и либо дальнейших пассировать в мышиных глаз в естественных условиях или выращивают как tumorspheres в пробирке. Распространение была успешно проведена, по крайней мере тремя проходами что позволит установить постоянный источник человеческих тканей ретинобластома для дальнейших экспериментов.

Уэсли С. Бонд и Лалита Вадхва являются со-первых авторов.

протокол

1. Подготовка ретинобластома tumorspheres

1. Получить образец ретинобластома опухоли под IRB, утвержденных протоколом.
2. Подготовка свежих определены СМИ стволовых клеток (Neurobasal-медиа, 1X B-27 дополнения минус витамина, 1X несущественные аминокислоты кислоты, 1X L-глутамина, 20 нг / мл ЭФР, 10 нг / мл bFGF).
3. Механически дезагрегировать опухолевой ткани с помощью скальпеля использованием сквозной технику в стерильной, культуры тканей обработанных 6-луночный планшет. Сразу же добавить 100 мкл определены СМИ стволовых клеток в ткани и мягко распространению фарш ткани с помощью скальпеля. Добавьте 5 мл определены СМИ стволовых клеток к колодцу.
4. Инкубировать при 37 ° C, 5% СО ₂ во влажной инкубатор и проверить ежедневно. Некоторые tumorspheres должны вытекать из опухолевой ткани нарушается почти сразу, и все больше в течение 2-4 дней.
5. Еженедельно, центрифуги tumorspheres на 300xg в течение 5 минут, ресуспендируют в свежеприготовленный определены СМИ стволовых клеток, и пипетки вверх-вниз 10 раз, чтобы сорвать больше, централизованно некротических сферах, а также позволяет новым, здоровым сфер форме.

2. Подготовка опухолевых клеток для инъекций

1. Если инъекционных культурный tumorspheres, мягко пипетки сферы в 15-мл коническую трубку. Аккуратно пипетки вверх и вниз с серологические пипетки 10-15 раз сорвать сферах.
2. Граф клетки для инъекций использованием hemacytometer, и аликвоту не менее 50000 клеток на введение в новую трубу. Подготовка к инъекции, как многие, как возможно на основе числа клеток имеется.
3. Центрифуга на 300xg течение 5 минут. Тщательно аспирата супернатант и ресуспендируют в 5 мл PBS. Повторите центрифугирования и стремление, и ресуспендируют в 10 мкл PBS на инъекцию.

3. Подготовка животных

1. Использование инсулиновый шприц, администрирования при введении препарата в грызун коктейль анестезии (кетамин 37,6 мг / мл, ксилазина 1,92 мг / мл, acepromazine 0,38 мг / мл) на 1 мкл на грамм массы тела (GBW). Подождите 5 минут, чтобы животное могло стать седации. Проверьте пульс и место животного на нагретой панели. Поддерживать животных на нагревают площадку в любое время до выздоровления.
2. После седации, администрирования 1 каплю раствора для proparacaine правого глаза. Замените животные на подогреваемых блокнот и подождите 1 минуту.
3. Администрирование 1 каплю раствора для фенилэфрин правого глаза. Замените животные на площадке подогревом и подождать 5 минут. Если расширение зрачка не произошло, повторно управлять 1 капли и подождать еще 5 минут.
4. Монитор животных на наличие признаков движения или подергивания, которые могут возникнуть на> 30 минут после успокоения. При первых признаках движения, управление 1 мкл / GBW кетамина HCl (разбавляют до 10 мг / мл в PBS) и подождите 5 минут.

4. Инъекции клеток опухоли

1. Место под наркозом животных под микроскопом на боку, с правого глаза вверх и с голову на марлю и в центре, чтобы получить красный рефлекс глазного дна правого глаза (ученик должен быть расширенными в это время), когда наблюдается через микроскоп .
2. Подоприте право мира, осторожно надавив одновременно с двумя пальцами на веки и держать эту позицию уверенно на оставшуюся часть процедуры.
3. Использование стерильных 30-игла прилагается к Луер-Лок шприц, проколоть миру сбоку через конъюнктивы и склеры, прилегающих к роговице лимба в районе Парс-Плана (рис. 1) и только через сосудистую оболочку в полость стекловидного тела. Удалите иглу из отверстия.
4. Стерилизуйте иглу Гамильтона с тампоном, смоченным спиртом. Нарисуйте клеточной суспензии в шприц Гамильтон и вставить иглу в отверстие до иглы визуализируется через микроскоп за линзы в стекловидное возле сетчатки. С помощью второго человека, держа иглу постоянно в этом положении, нажмите поршень медленно. Удалите иглу. Если необходимо, используйте ватный тампон, чтобы поглощать жидкости из отверстия.
5. Аккуратно релиз давлением веки, чтобы закрыть мыши веки.
6. Администрирование 1 каплю гипромеллоза для каждого глаза и вернуть животное подогревом площадкой для восстановления.

5. Мониторинг вводили мышам и уборки опухолей

1. Ежедневно, изучить вводят око за leukocoria (белые папиллярные рефлекс) и / или periocular вздутие, которое обычно проявляется через 2-4 недели после инъекции.
2. Как только рост опухолей обнаружен, эвтаназии животных в соответствии с ведомственным руководящим принципам.
3. Если глаза и опухоль распространяется век, использовать скальпель, чтобы сделать два разреза ортогональной глазной щели и поднимите кожных лоскутов.
4. Под визуализации с помощью стереоскопического микроскопа, делают разрез в окружной лимба, удаление роговицы и хрусталика, и тщательно анализировать основную часть опухоли из других тканей с использованием TweeЦерс. Место опухоли в стерильной среде RPMI-1640 средств массовой информации.
5. Используйте пинцет, чтобы медленно потяните открытым миру из розетки. Для обеспечения прилагается зрительного нерва так опухолевой инвазии могут быть визуализированы, тянуть шар до нерва подвергается и использовать ножницы, чтобы вырезать нерва как можно дольше. Место в 10% формалине для регулярной обработки для гистологического исследования.

6. Представитель Результаты:

Ретинобластома tumorspheres начнут появляться с разбивкой ткань практически сразу же, как они будут освобождены от опухоли. В течение 2-4 дней, более tumorspheres начнет формировать и будет увеличиваться в размерах. Сферах, как правило, регулярные и имеют четко определенного, среднего мембраны, окружающей агрегат (рис. 2).

Животного обычно проявляется leukocoria в течение 4 недель после инъекции (рис. 3б), а затем расширение земной шар и растяжения окружающих тканей через 5-8 недель после инъекции, как опухоль растет (рис. 3в).

Рисунок 1. Поперечного сечения диаграммы мыши глаз подсветка функции, указанные в протоколе.

Рисунок 2. Культуры человеческих клеток в пробирке ретинобластома отображаеются) 4x, и б) 10-кратным увеличением цели. Ретинобластома первичные опухолевые клетки производят tumorspheres с регулярной сфероида форму и четкие наружной мембраны. Шкала бары представляют) 500 мкм, и б) 200 мкм.

Рисунок 3 Глаз RAG2 -. / - Мыши показывает) нормальные функции, б) leukocoria свидетельствует о опухолевой массы в полость стекловидного тела, и в) большая масса опухоли заполнения миру с соответствующими растяжение periocular, внутриглазное кровотечение.

Обсуждение

Методике, описанной здесь способствует распространению опухоли ретинобластомы в их внутриглазное, интравитреальные среде. Внутриглазного технику инъекции был использован в прошлое, чтобы создать опухоли от ретинобластомы полученных клеточных линий ^1, а также для доставки вирусных векторов для генной терапии внутриглазным ^2,3. Эта методика была успешно использована для получения человеческих опухолей ретинобластома по прямым впрыском клеток из первичной опухоли и введение tumorspheres, а также серийные распространения ксенотрансплантата опухолей. Видимые свидетельства образование опухолей (обычно leukocoria), как правило, впервые отмечено в течение 4 недель, после чего внутриглазное кровотечение и вздутие земного шара и / или тканей, окружающих орбиту развиваются в течение 5-8 недель. Меньшинство вводили мышам вводили травмировать глаз, что привело к окончательному закрытию век. В этих случаях, вздутие является единственным признаком образования опухоли.

Создание мышиных опухолей ксенотрансплантата не была успешной со всеми человеческими опухолями ретинобластома, хотя и распространении раковых опухолей ксенотрансплантата является весьма успешным. Это наблюдение позволяет предположить, что некоторые характеристики первичной опухоли, такие, как инвазивность и уровень дифференциации или другой неизвестный фактор, может быть, влияющих на способность этих опухолей упорствовать в мышиной среды окуляра.

Количество ткани, которые могут быть приобретены у человека опухоли ретинобластома весьма мала, и Есть существенные ограничения на способность к культуре человеческих клеток ретинобластомы в пробирке, такие как ограниченный срок службы, потеря твердого гистология опухоли и изменения в клеточной фенотипа. Этот протокол обеспечивает относительно простой способ для распространения опухоли человека и создания мышиной модели заболевания человека. Это позволяет в дальнейшем в пробирке и в естественных экспериментов по биологии ретинобластомы и дольше поддержания опухоли за пределы пациента.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Имя	Компания	Каталог #	Комментарии
Фенилэфрин HCl 2,5%	Bausch & Lomb	053-11	Офтальмология решение
30-га иглы	BD	305128	Регулярные конические
10-мл Луер-Лок Шприц	BD	309604
3/10-cc инсулиновый шприц	BD	328431
Тампоны спиртовые	BD	326895
6-луночный планшет, культуры тканей обработанных	BD	353046
Proparacaine HCl 0,5%	Батлер AHS	017239	Офтальмология решение
Кетамин HCl 100мг/мл	Форт Додж	4402A
10-мкл Hamilton Шприц	Компания Hamilton	7648-01
32-га Гамильтон иглы	Компания Hamilton	7803-04	Custom длина - 0,5 "
Neurobasal-Медиа	Invitrogen	10888-022
B-27 Дополнение Минус витамин А, 50X	Invitrogen	12587-010
RPMI-1640 СМИ	Mediatech	10-040-CV
Номера для незаменимых аминокислот кислоты, 100X	Mediatech	25-025-CI
L-глютамин, 100X	Mediatech	25-005-ДИ
Одноразовые № 11 скальпеля	Miltex	4-411
Combo грызунов Анестезия	н /	н /	Внутренний аптеке формулировке (кетамин 37,6 мг / мл, ксилазина 1,92 мг / мл, acepromazine 0,38 мг / мл)
Рекомбинантного человеческого эпидермального фактора роста (EGF)	STEMCELL Технологии	02633	Развести в 10 мкг / мл раствора акции
Рекомбинантного человеческого основной фактор роста фибробластов (bFGF)	STEMCELL Технологии	02634	Развести в 10 мкг / мл раствора акции
OMS-75 Операционный микроскоп	Topcon Medical Systems	OMS-75	Эта модель была прекращена
10% формалине	VWR	95042-908