С памятью формы полимеров для активного культуры клеток

Резюме

Метод для разработки субстраты клеточных культур с возможностью изменения рельефа в культуре описывается. Метод позволяет использовать смарт-материалов, известных как полимеры с памятью формы, которые имеют способность запоминать постоянных форму. Эта концепция может адаптироваться к широкому спектру материалов и приложений.

Аннотация

С памятью формы полимеров (SMP) представляют собой класс «умных» материалов, которые имеют возможность перейти от фиксированной, временную форму заранее определенных постоянных форме о применении стимулов, таких как тепло ^1-5. В Типичный цикл памяти формы, SMP сначала деформируется при повышенной температуре, которая выше его температура перехода, Т _транс [либо температуры плавления (Т _м) или температуры стеклования (Т _г)]. Упругой деформации в природе и в основном приводит к сокращению конформационной энтропии цепи учредительных сети (по теории упругости резины). Деформированного SMP затем охлаждают до температуры ниже Т _транс при сохранении внешнего напряжения или стресса постоянно. При охлаждении материал переходит в более жесткое состояние (частично кристаллический или стеклянный), которые кинетически ловушки или "зависает" материала в этой низкой энтропией, ведущих к фиксации макроскопические формы. Форма восстановления запускается путем постоянного нагрева материала через Т _транс под свободной от стрессов (неограниченный) состоянии. Позволяя сети цепей (с восстановил подвижность), чтобы расслабить их термодинамически, максимальная-энтропии, существенные изменения из временной формы в постоянную форму.

Клетки способны съемки механические свойства окружающей их среды ^6. Механизмы, посредством которых механических взаимодействий между клетками и окружающей их физической средой контроля поведение клеток являются областями активного исследования. Подложки определенных топографии появились как мощный инструмент для исследования этих механизмов. Мезомасштабные, микромасштабной и наноразмерные структуры субстрата топографии, как было показано прямое выравнивание ячеек, адгезии клеток и клеточных тяговых усилий ^7-14. Эти данные подчеркивают потенциал подложки топографии для контроля и анализа механических взаимодействий между клетками и окружающей их физической средой в культуре клеток, но подложек на сегодняшний день, как правило, пассивны и не могут быть запрограммированы ли существенно изменится в культуре. Этот физический застой имеет ограниченный потенциал топографических субстратов для контрольных клеток в культуре.

Здесь активную ячейку культуры (АКК) SMP субстратов вводятся, которые используют формы поверхности память, чтобы обеспечить программным управлением рельефа подложки и деформации. Эти субстраты продемонстрировать способность перехода от временного к рифленый рельеф во-вторых, почти плоский рельеф запомнил. Это изменение рельефа местности могут быть использованы для контроля поведения клеток при стандартных условиях культуры клеток.

протокол

1. Изотермические УФ-отверждения из NOA63

1. Пользовательские камеры лечения был разработан с использованием стекло (75 мм х 25 мм х 1 мм), толщина 1 мм Spacer тефлон, и алюминиевая пластина (75 мм х 25 мм х 3 мм), как показано на рисунке 1. Камере скрепляется с помощью небольших клипов связующего.
2. Inject NOA63 в камеру через отверстие в распорку тефлоновым использованием 18 иглы. NOA63 может быть слегка нагревают, чтобы облегчить инъекции.
3. Место камеру на горячей плите установлена ​​на уровне 125 ° С и дать тепло к равномерной температуре в течение 5 мин.
4. Предварительное лечение NOA63 в УФ-камеры лампы (λ _макс = 365 нм, см. таблицу) в течение 20 мин с лампой 6,5 см от поверхности стекла.
5. Удалить NOA63 из камеры в то время как теплый использованием лезвия бритвы.
6. После лечения NOA63 под ультрафиолетовым светом в течение 3 ч 40 м на плитке при 125 ° C.
7. Магазин NOA63 высушенный при температуре -20 ° C.

2. С памятью формы Характеристика NOA63

1. Подготовка образца гантели горячим прессованием вылечить NOA63 пленку с индивидуальных удар (см. таблицу), размеры которого показаны на рисунке 2.
2. Нагрузка образца в динамический механический анализатор (DMA; см. таблицу) с пределом прибора. Установите прибор на «силу контролируемой" режиме, то программа тестирования процедуру следующим образом:
   1. Уравновешивания при 95,00 ° С
   2. Изотермический на 10.00 мин
   3. Рампа сила 0,300 N / мин до 2,500 N
   4. Изотермические для 5,00 мин
   5. Рампа 2,00 ° C / мин до 20,00 ° C
   6. Изотермический на 10.00 мин
   7. Рампа сила 0,300 N / мин до 0,015 N
   8. Изотермические для 5,00 мин
   9. Рампа 2,00 ° C / мин до 95,00 ° C
   10. Повторите шаги 2-9 еще два раза

3. Подготовка активных субстратов культуры клеток

1. Отдельные образцы могут быть получены из изотермически Высохшая пленка SMP. Cut фильм SMP с бритвой, чтобы желаемый размер выборки. Место SMP на горячей плите на температуру, которая выше, чем Т _г сократить модуля и легкость резки.
2. Временная форма может быть зафиксирован в ряде различных способов. Здесь мы используем настольный гидравлический пресс с подогревом / охлаждением валики для тиснения временного топографии. Установите температуру валики при температуре выше T _г.
3. Эмбоссер было сделано эпоксидной смолы на виниловые пластинки. Это создаст временную форму параллельных канавок. Здесь, эмбоссер был треугольный пики от 35 до 40 мкм, высокая и 60 мкм, шириной, расположенными 80 мкм друг от друга. Эмбоссер может быть сделана из других материалов и с разной топологией, но должны быть жестче, чем на NOA63 тиснения температуры. Место SMP образцы лицом вниз на эмбоссер и месте образцы и тиснения в прессе.
4. Применить ~ 100 кПа преднагрузки установить контакт между отопления валики и образцы и удерживать в течение ~ 5 минут, чтобы дать образцы для достижения одинаковой температуры.
5. Применять 1-6 МПа до образцов и удерживать в течение 1 минуты. Напряжение 4,7 МПа приводит к неполному репликации рельефа тиснения. Временное топографии производится с закругленными пики от 25 до 35 мкм высотой и 150 мкм в ширину. SMP будет перелом, если больше напряжения. Применение меньших напряжениях ввести топологий с меньшими амплитудами.
6. Уменьшить температуру ниже T _г. Здесь мы используем возможность водяного охлаждения пресс валики.
7. При температуре ниже Т _г, удалить приложенной силы.
8. Образцы можно хранить сухое при температуре -20 ° C. При хранении в этих условиях мы наблюдали менее 1 мкм, уменьшение амплитуды восстановления после двух месяцев для образцов с тиснением эмбоссер записи винила.

4. Активный эксперимент культуры клеток

1. УФ-свете биологических кабинета безопасности (BSC) используется для стерилизации образцов. Упорядочить образцы лицом вниз в стерильные чашки без крышки и включаем свет УФ BSC в течение 6 ч.
2. Флип образцы новых стерильные чашки лицевой стороной вверх. Включите свет УФ BSC в течение 6 ч.
3. Образцы теперь должны быть доведены до относительно стабильного состояния перед покрытием с ячейками. Место образцов в 96 ячейках и добавить 150 мкл полной среды роста.
4. Положите пластинку в 30 ° C инкубаторе с 5% CO ₂ до достижения желаемого частичного восстановления. Здесь мы используем 30 часов для получения образцов с достаточно большой амплитудой, чтобы выровнять клеток.
5. Образцы теперь могут быть покрыты клетками. Место образцы новых 96-луночный планшет.
6. Добавить 150 мкл клеточной решение образцов. Здесь мы используем C3H/10T1/2 мышиных эмбриональных фибробластов на 20 000 клеток / мл для достижения изолированных клеток (как правило, не вступает в контакт с другими клетками).
7. Для того чтобы клетки, собираются и распространяются на временные топография, места в 30 ° С инкубатор на 9,5 ч.
8. Для анализа морфологии ячейкигии до начала переходного периода, извлеките образцы и проводить окрашивание и флуоресценции образцов. Этот материал экспонатов аутофлюоресценция на протяжении большей части ультрафиолетового и видимого диапазона. Флуорофоров в дальнем красном конце спектра, такие как Alexa Fluor 647 рекомендуется снизить фон.
9. Чтобы запустить образцы для восстановления, перемещение пластины 37 ° C инкубатора и продолжать культуры в течение 19 ч, чтобы материал для восстановления и позволяют клеткам адаптироваться к их морфологии новой топографии.
10. Удалить образцов и применять соответствующие пятна (фаллоидином для нитчатых актина изображений) и визуализации процедур.

5. Представитель Результаты:

Обработанная NOA63 представляет собой прозрачный, стекловидный твердый продукт, который обладает отличной памятью формы, свойства, как показано на рисунке 3. В этом случае материал был вылечен, как в протоколе 1 выше, и показывает равномерное Т _г 51,1 ° С (определяется от начала падения Е '). Это наблюдается с той памятью формы циклов (отопление, деформирующий, охлаждения, восстановления, рисунок 3), что большой процент штамм был зафиксирован после разгрузки при 20 ° С, что соответствует фиксации соотношение ¹⁵ (R _F) из 89,3 % (в среднем за три цикла, то же ниже R _г). Фиксированная деформация восстановленных на восстановление отношение (R _г) 84,4% в относительно небольшом диапазоне температур при нагреве. Кроме того, производительность памяти формы, не показали ухудшение до трех циклов, в том, что все кривые следуют почти точно друг с другом.

NOA63 была использована в данном протоколе, поскольку он легко доступен от производителя и поставляется в виде легко вылечить без растворителя форполимера с фотоинициатора. Тем не менее, ее состав не разглашается поставщика. Оказалось, чтобы высокие вложения клеток и жизнеспособности. Наконец, температура перехода может быть настроен, чтобы значимые величины восстановления между двумя ячейка совместима температурах. Ряд других полимерных систем также могут быть использованы с этим протоколом, если температура перехода совместим с культурой клеток и, если они способствуют адгезии клеток и жизнеспособность.

Амплитуда временного топографии (канавки) со временем уменьшается при температуре 30 ° C. К 30 ч при 30 ° С, амплитуда была уменьшена на ~ 50% (рис. 4, время 0) ^16. Это снижает еще на 10% в течение ближайших 9,5 ч. При восстановлении срабатывает при повышении температуры до 37 ° С, амплитуда уменьшается до 0,5% от начальной амплитуды в течение 9,5 ч. Для тиснения используются и тиснения напряжение 4,9 МПа, что соответствует функциональные изменения от 13 мкм пазы для почти плоской поверхности.

Пример поведения клеток контролируется с помощью использования активных субстратов клеточной культуры является изменение цитоскелета организации. О временном рифленой поверхности перед восстановления срабатывает, актина микрофиламентов выровнять в направлении канавками (рис. 5а) ^16. После восстановления, повышение температуры, микрофиламентов реорганизовали и ориентированы случайным образом. Контрольные образцы, которые имеют статические борозды или статической плоской поверхности не реорганизовать после повышения температуры (рис. 5, б, в).

Рисунок 1: Схема для лечения NOA63 камеры. Кросс-разрез (слева) и сверху вниз без стеклянной крышкой (справа).

Рисунок 2: геометрия гантели использовались для массового характеристика памяти формы W:. Ширина узком участке, L: длина узком участке, G: датчик длины, WO: ширина общая, Л. О.: длина наибольшая, D: Расстояние между захватами, R: Радиус филе, и РО: внешний радиус.

Рисунок 3: масса односторонним эффектом памяти формы одного NOA63 лечения, повторяется 3 раза (звездочка означает экспериментальных начала заболевания). В точке обозначены звездочкой, полимер был нагрет и затем деформированы, применяя стресс определить его временные формы. Этот штамм является постоянным, а при понижении температуры исправить временную форму ниже T _г полимера. Затем температура увеличивается, и материал возвращается в постоянной формы, как временное напряжение снижается.

Рисунок 4: SMP восстановление может быть вызвано в клеточной культуры совместимы температурах. Амплитуда 25,6 ± 0,8 мкм представить следующие тиснения RECovered до 12,6 ± 1,5 мкм после 30 ч равновесия при 30 ° С (время 0, черные кружки). После образцы были перенесены на 37 ° С инкубатор (9,5 ч), амплитуда восстановилась до 1,1 ± 0,2 мкм в течение 3,5 ч. Амплитуда восстановился до ~ 0,3 ± 0,1 мкм в течение 9,5 ч и не обнаружено снижение по сравнению с окончательным 9,5 ч наблюдалось (красные треугольники). Планки погрешностей представляют одно стандартное отклонение (п = 4-6). Следы являются контактными профилометрии сканирует репрезентативных выборок.

Рисунок 5: цитоскелета сотовый актина перестраивает следующие топографические переход, конфокальной изображения клеток, окрашенных фаллоидином на тисненой субстратов показать микрофиламентов в соответствие с паз направлении (белая стрелка) до перехода и повышение температуры.. После перехода, микрофиламенты перегруппировались ориентированы случайным образом. Б, клетки на плоских подложках контроля показывают, случайно ориентированных микрофиламентов до и после повышения температуры. С, Ячейки рифленые подложки контроль показать микрофиламентов в соответствие с паз направлении до и после повышения температуры. Шкала бар составляет 100 мкм. Следы являются как показано на рисунке 4.

Обсуждение

Т _г NOA63 можно легко управлять через температура отверждения. Мы использовали его для создания SMP субстраты, которые могут быть вызваны в ячейке совместимых устройств. NOA63 пластифицируется водой, которая снижает сухой Т _г, поэтому мы увеличили сухую Т _{г в} отверждения при...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента или инструмента	Компания	Номер в каталоге	Комментарии (необязательно)
NOA63	Норланд продактс инк	NOA63	Лот номер 111
Догбон Панч	TestResource, Inc Shakopee, MN		Уменьшенную Тип IV Догбон (ASTM D638-03)
Настольный гидравлический пресс	Резчик	3851
C3H10T1 / 2 мышиных эмбриональных фибробластов	АТСС	CCL-226
Биологические Кабинет безопасности	Thermo Fisher	1357
УФ-лампы	Spectroline	SB-100PC
Динамический механический анализатор (DMA)	TA Instruments, Inc	Q800
Перевернутый флуоресцентного микроскопа	Leica	Leica DMI 4000B
Конфокальной микроскопии лазерного сканирования	Zeiss	LSM 710	20x/0.8 Н. воздуха или 40x/1.30 Н. А. нефти цель