РНК Выделение Синегнойной палочки Колонизация мышей Желудочно-кишечный тракт

Резюме

Надежный метод для выделения РНК Синегнойной палочки Оправился от мышиной cecums описано. РНК найдены, в достаточном количестве и надлежащего качества для последующего КПЦР, транскрипция профилирования и РНК Seq экспериментов. Эта техника может быть адаптирована для РНК изоляции других кишечных микробов.

Аннотация

Синегнойной палочки (PA) инфекции приводят к значительной заболеваемости и смертности у хозяев с ослабленной иммунной системой, например, больных лейкозом, тяжелых ожоговых ран, или трансплантации органов ^1. У пациентов с высоким риском развития инфекций ПА крови, желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) является основным резервуаром для колонизации ^2, но механизмы, посредством которых ПА переходы от бессимптомной колонизации микроба к инвазивным, и часто смертельно, возбудитель не ясны. Ранее мы провели в естественных условиях эксперименты профилирования транскрипции путем восстановления ПА мРНК из клеток бактерий, проживающих в cecums колонизированных мышей ³ с целью выявления изменений в бактериальной экспрессии генов в процессе изменений в иммунном статусе хозяина.

Как и в любом эксперименте профилирования транскрипции, ограничение скорости шаг в изоляции достаточного количества мРНК высоким качеством. Учитывая обилие ферментов, мусора, остатков пищи, а также твердых частиц в желудочно-кишечном тракте, задача выделения РНК, устрашает. Здесь мы представляем метод надежных и воспроизводимых изоляции бактериальных РНК оправился от мышиной желудочно-кишечного тракта. Этот метод использует устоявшихся мышиной модели РА Г. И. колонизации и нейтропения вызванной распространением ^4. Как только Г. И. колонизации с П. А. подтвердится, мышей эвтаназии и слепой кишки содержимое выздоровел и глубокой заморозки. РНК затем извлекали с помощью комбинации механического разрушения, кипения, фенол / хлороформ удаление зубов, ДНКазы лечения и аффинной хроматографии. Количество и чистота подтверждаются спектрофотометрии (Nanodrop технологий) и bioanalyzer (Agilent Technologies) (рис. 1). Этот метод Г. И. изоляции микробной РНК могут быть легко адаптированы для других бактерий и грибов, а также.

протокол

1. Мышиной модели П. Колонизация палочки Г. И. и распространение

1. C3H/HeN мышей (6-8 недель старые, женщины, Харлан) рассматриваются с пероральные антибиотики, разрушают синантропных флоры, а затем моно-колонизировали с ПА, как описано выше ^4.

2. Сбор мышей слепой кишки люминал Содержание

1. Погрузите очищается раствором нержавеющей стали в жидкой ванне азота.
2. Усыпить мышей углерода удушения газом.
3. Безопасный каркас мыши на борту пенополистирола и душ с 95% этанола. Сделать средней линии продольного разреза через кожу от грудины до промежности. Отражение кожи и брюшины подвергать брюшной полости.
4. Резекцию всей слепой кишки. Держите слепой кишки щипцами за нержавеющей стали раствора. Snip оба конца слепой кишки с рассечением ножницами.
5. Вставьте P1000 кончика пипетки заполнены с 1 мл буфера flushate слепой кишки (10 мМ TrisHCl, 1 мМ ЭДТА и 200 мМ NaCl) ⁵ в проксимальный конец слепой кишки. Флеш слепой кишки буфера flushate и слепой кишки просвета содержимое в раствор из нержавеющей стали. 1 мл буфера слепой кишки flushate будет достаточно для промывки всех слепой кишки содержимое. Слепой кишки содержимое flushate замерзнет сразу же после вступления в контакт с раствором.
6. Grind слепой кишки содержимое flushate стерильным пестиком.
7. Место землю замороженных слепой кишки просвета содержимое в 50 мл полипропиленовые конические трубки погружен в сухой лед / этанол ванну.
8. Повторите шаги 2.2 до 2.7 для каждого дополнительного мыши.
9. Хранить при температуре -80 ° C.

3. Бактериальная изоляция РНК

1. Теплый 1 объема (на основе конечного объема два просвета слепой кишки содержание, примерно 3 мл) кислоты фенол / хлороформ (5:1, об / об), содержащихся в 50 мл Дуб трубки центрифуги Ридж с крышкой закреплен в парафильмом в 65 ° С водяной бане.
2. Варить 0,5 Объем буфера лизис (2% SDS, 16 мМ ЭДТА и 200 мМ NaCl) ^6, содержащихся в 50 мл полипропилен конической трубе в течение 5 минут.
3. Добавить кипящий буфера для лизиса к слепой кишки просвета содержание. Однородный. Кипятить в течение 5 минут с периодическими вортексе.
4. Добавить 100 ° C слепой кишки содержимое / лизис образца до 65 ° С кислота фенол / хлороформ в центрифуге трубки Ок-Ридж. Уплотнение крышки с парафильмом.
5. Инкубировать при 65 ° С в течение 10 минут с периодическими вортексе (каждые 2 минуты).
6. Центрифуга образца в 2500 г на 4 ° в течение 15 минут.
7. Тщательно передачи водной фазы (избегая любого из белого интерфейс) для 50 мл свежего центрифуги Ок-Ридж. Объем водной фазы составит около 50% от общего объема слепой кишки содержимое, лизис буфера, и кислота фенол / хлороформ. Добавить равный объем кислоты фенол / хлороформ.
8. Уплотнение крышки с парафильмом и хорошо перемешать на вортексе на высокой скорости.
9. Центрифуга образца в 2500 г на 4 ° в течение 15 минут.
10. Повторите шаги с 3,7 до 3,9, пока нет видимых белых интерфейс между водной и органической фаз.
11. Тщательно передачи водной фазы 50 мл свежего центрифуги Ок-Ридж. Добавить равным объемом хлороформа / изоамиловый спирт (24:1, об / об).
12. Уплотнение крышки и хорошо перемешать на вортексе.
13. Центрифуга образца в 2500 г на 4 ° в течение 15 минут. Удалить водной фазы (объем будет примерно 50% от общего объема реакции) до 15 мл полипропилен коническую трубку и добавьте равный объем изопропанола.
14. Инкубируйте при -20 ° в течение по крайней мере 2 часа или на ночь.
15. Центрифуга образца в 2500 г на 4 ° С в течение 45 минут. Гелеобразную гранулы образуют в нижней части трубы. Удалить супернатант.
16. Вымойте гранул с 1 мл ледяной 70% этанола. Vortex. Центрифуга образца на 10 000 г при 4 ° С в течение 5 минут.
17. Удалить супернатант и инвертировать трубку, чтобы гранулы высушивают при комнатной температуре в течение 10 минут.
18. Ресуспендируют РНК осадок в 200 мкл РНКазы без воды.

4. ДНКазы Лечение (Turbo ДНК-Free, Applied Biosystems)

1. Добавьте 20 мкл 10х буфера ДНКазы Turbo и Turbo 2 мкл ДНКазы и аккуратно перемешать.
2. Инкубировать при 37 ° в течение 20 минут.
3. Добавьте 20 мкл реагента ресуспендируют инактивации ДНКазы и хорошо перемешать.
4. Инкубировать 5 минут при комнатной температуре, время от времени перемешивания.
5. Центрифуга в 10000 г при комнатной температуре в течение 1,5 минут и передача супернатант в новую пробирку и отцентрифугировать.
6. Добавить один объем холодного (4 °) кислота фенол / хлороформ и тщательно перемешать вортексе в течение 1 минуты.
7. Центрифуга при 12500 г при комнатной температуре в течение 2 минут.
8. Передача водной фазы в новую пробирку и добавляют 1 объем хлороформ / изоамиловый спирт (49:1 об / об), вихрь.
9. Центрифуга при 12500 г при комнатной температуре в течение 2 минут.
10. Передача водной фазы (примерно 50% от общего объема реакции) в новую пробирку.
11. Добавить 0,1 объема 3М ацетата натрия, рН 5,5 и2,5 объемов ледяной 100% этанола. Vortex.
12. Инкубируйте при -20 ° в течение 2 часов или при температуре -80 ° в течение 30 минут.
13. Центрифуга при 12000 г в течение 30 минут при 4 °
14. Удалить супернатант.
15. Вымойте гранул с 1 мл ледяной 70% этанола путем центрифугирования в течение 5 минут при 10000 г на 4 °.
16. Удалить супернатант и сухой воздух в течение 10 минут.
17. Ресуспендируют осадок в 100 мкл РНКазы без воды. Может потребоваться место в водяной бане 65 ° до ресуспендирования и растворить гранулы.
18. Для проверки эффективности лечения ДНКазы, стандартная ПЦР-реакции амплификации рибосомных белков (или других генов ссылка) может быть выполнена для обработанных и необработанных образцов, используя не RT управления.

5. РНК Очистка Step (Qiagen, RNeasy Kit)

1. См. на стр. 56-57 от Qiagen RNeasy Мини Справочник ^(4-е издание, апрель 2006 г.). Следуйте, как указано.

6. Представитель Результаты

Количество бактериальных общей РНК восстановлены с помощью этого протокола является примерно 2-3 мкг от двух cecums. РНК найдены, в достаточном количестве и надлежащего качества для последующего КПЦР, транскрипция профилирования и РНК Seq экспериментов. РНК чистоты обычно оценивается путем измерения 260nm/280nm соотношении ⁷ образца, но этот метод не дает никакой информации о целостности РНК. Agilent Bioanalyzer является микрофлюидики-платформы для размеров, количественной оценки и контроля качества ДНК, РНК, белков и клеток, а использует метрики РНК целостности известный как РНК целостности номер (РИН) ^8. РНК экстрагировали этот протокол производит 260/280 отношений, начиная от 1,7 до 2,0 и РИН значения ≥ 7,0. Пример анализа Agilent Bioanalyzer бактериальной РНК извлечены с помощью этого протокола показано на рисунке 1.

Рисунок 1. Agilent Bioanalyzer electropherogram и гелеобразной образ синегнойной палочки общей выборки РНК, выделенной и оправился от мышиной слепой кишки содержимое. РИН 8.0.

Обсуждение

Метод выделения РНК, описанные здесь допускает восстановление достаточного количества высококачественных синегнойной палочки общей РНК найденным на мышиных желудочно-кишечного тракта. Этот метод не ограничивается П. палочки и потенциально могут быть применены к другим бактериям. Восстановление достаточного организмов микробной из кишечника будет значительно отличаться от организма к организму. В нашей мышиной модели, П. палочки обычно колонизирует мышиной желудочно-кишечного тракта на уровне от 5 х 10 ⁷ до 5 х 10 ⁸ КОЕ / г кала ^4. После восстановления содержимого слепой кишки примерно 0,5 грамма, оценочное число P. палочки восстановленные из двух cecums составляет от 5 х 10 ⁷ до 5 х 10 ⁸ КОЕ. Если других микроорганизмов используются, было бы благоразумно проверить И. уровня колонизации, а затем подсчитать количество cecums необходимые для восстановления целевых число КОЕ. Важно также отметить, что при использовании этой мышиной модели частности, антибиотиков мышей, не инфицированных ПА не имеют значительных количествах из РНК, выделенной из слепой кишки их содержание.

Наши мышиной модели синегнойной палочки желудочно-кишечного колонизации и распространению попытки подражать патогенезе П. палочки бактериемии у онкологических пациентов и стволовых клетка трансплантации. В этой популяции пациентов, синантропных флоры часто обедненного вторичной по отношению к антибиотикам или химиотерапевтического лечения (например, антибиотиков истощение И. синантропных флоры), в результате чрезмерно быстрый рост патогенных микробов (например, моно-ассоциации с P. палочки), а затем последующее распространение после иммуносупрессии. Преимущества и недостатки этой мышиной модели уже были рассмотрены ранее ^4. Цель этого текущего исследования является предоставление методологии выделения микробной общей РНК из желудочно-кишечного тракта. Этот протокол может быть легко адаптированы для других мышиных моделях, что изучение других аспектов микробного патогенеза в желудочно-кишечном тракте (т.е. синантропных флоры взаимодействий, бактериальные воздействие на воспалительные заболевания кишечника и др.).

Одним из преимуществ этого метода является включение нескольких шагов лизиса в том числе замораживания / оттаивания, механическое разрушение (распыление с раствором / пестиком, гомогенизации), кипячение и химическая лизиса (например, SDS). Несмотря на множество лизис шаги, некоторые микроорганизмы (в частности, грам-положительных бактерий и грибов / дрожжи) может потребоваться дополнительное механическое разрушение. После горячей лизиса / кислота фенол-хлороформ инкубации (шаг 3.5), помимо бус (0,1 мм для бактерий и / или 0,5-0,7 мм для дрожжей) и последующее бусинка избиение шаг должен быть достаточным, чтобы лизировать эти организмы ^{9, 10.}

Учитывая сложный характер материалы, извлеченные из мышиных слепой кишки, повторяется холодной экстракции acid-phenol/chloroform (шаг 3,7 до 3,9) совершенно необходимы для достижения приемлемого качества РНК и целостность далее вниз по течению реакции. В период 3-5 холодной экстракции acid-phenol/chloroform может потребоваться до белого интерфейс между водной и органической фаз исключается. Наконец, сочетание лечения ДНКазы (Шаг 4) и RNeasy протокол Cleanup (шаг 5) необходимы для удаления загрязнения ДНК и малых не-мРНК (5с и тРНК). Как указывалось ранее, РНК восстановленные с использованием этого протокола в достаточном количестве и надлежащего качества для последующего профилирования транскрипции ^3, КПЦР (не опубликовано), и РНК Seq (не опубликовано) экспериментов.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер в каталоге
Ступки и пестика	Рыболов	12-947-1
Гомогенизатор	Omni	ТМ-125
Ок-Ридж центрифужные пробирки (50 мл)	Nalgene	3119-0050
Кислота фенол / хлороформ	Амбион	AM9720
Хлороформ	Sigma-Aldrich	C2432
Изоамилового спирта	Sigma-Aldrich	W205702
Изопропанол	Sigma-Aldrich	190764
Диэтиловый pyrocarbonate (DEPC)	Sigma-Aldrich	40718
ДНКазы	Амбион	AM2238
RNeasy Kit	Qiagen	74104
3М ацетата натрия	Амбион	AM9740
100% этанола	Sigma-Aldrich	E7023