Гидрофобные Солт-модифицированный Nafion для иммобилизации ферментов и стабилизации

Резюме

В этой статье описывается порядок синтеза гидрофобно модифицированные мембраны Nafion иммобилизации ферментов и как для иммобилизации белков и / или ферментов в мембране и проверить их конкретной деятельности.

Аннотация

За последние десять лет, произошло множество приложений для иммобилизации ферментов и стабилизировалась в том числе биокатализа, биосенсоров, и биотопливо клеток. ^1-3 В большинстве биоэлектрохимические приложений, ферментов или органеллы иммобилизованных на поверхности электрода с использованием определенного типа полимерной матрицы. Этот полимер леса должны иметь стабильную и ферменты позволяют поверхностным диффузии молекул и ионов в и из матрицы. Большинство полимеров, используемых для данного типа иммобилизации на основе полиаминов или многоатомные спирты - полимеры, которые имитируют природную среду ферменты, которые они воплощают и стабилизации ферментов через водород или ионной. Другой метод для стабилизации ферментов связано с использованием мицелл, содержащих гидрофобные области, которые могут инкапсулировать и стабилизации ферментов. ^4,5 В частности, группа Minteer разработала мицеллярных полимер на основе коммерчески доступных Nafion. ^6,7 NafionСам мицеллярных полимера, что позволяет каналу помощью диффузии протонов и другие мелкие катионы, но мицеллы и каналов крайне малы и полимер является очень кислым из-за сульфокислоты боковых цепей, что неблагоприятно для иммобилизации ферментов. Однако, когда Nafion смешивается с более гидрофобные алкильные соли аммония, такие как тетрабутиламмония бромид (TBAB), четвертичного аммония катионов замене протонов и стать счетчик ионов сульфонатных групп на стороне полимерные цепи (рис. 1). Это приводит к большим мицелл и каналов в полимер, который позволяет для распространения больших подложках и ионов, которые необходимы для ферментативной функции, такие как никотинамидадениндинуклеотида (NAD). Это изменение Nafion полимера был использован для иммобилизации различных типов ферментов, а также митохондрий для использования в биосенсоров и биотопливных элементов. ^8-12 Эта статья описывает новую процедуру принятия этого микрофонаellar полимер иммобилизации ферментов мембраны, которая может стабилизировать ферментов. Синтез мицеллярной мембранной иммобилизации фермента, процедура для иммобилизации ферментов в мембране, а анализы для изучения ферментативных удельной активности иммобилизованного фермента приведены ниже.

протокол

1. Модификация с Nafion соли четвертичного аммония

1. Встряхните бутылку 5% вес / объем Nafion подвески энергично в течение ок. 30 секунд, чтобы Nafion приостановлена ​​равномерно в растворе.
2. Пипетировать из 2 мл в настоящее время повторно приостановил Nafion в стеклянный флакон (флакон объемом может содержать от 2,5 мл до 10 мл).
3. Измерьте 3-кратном молярном избытке (по отношению к сульфокислоты групп на Nafion полимер) алкильных соли бромида (соответствующей массы приведены в таблице 1), и добавить к этому флакон, содержащий 2 мл Nafion.
4. Vortex флакон на 1500 оборотов в минуту в течение 10-15 минут.
5. Вылейте вязкий раствор в полиэтиленовый весом лоток, который измеряет ок. 3 х 3 дюйма, а также использование пипетки для передачи остаточного раствора из флакона с весом лоток.
6. Позвольте растворители испаряются из весить лодку, оставляя желтый / коричневый, прозрачная пленка на нижней весом лоток (Fiрисунке 2). Скорость испарения растворителя должна быть такой, что она занимает более 6 часов для всех растворитель испаряется. Если растворитель испаряется слишком быстро, белый, твердый материал образует вместо прозрачной пленке о том, что мицеллярной структуры полимера был разрушен, и необходимо повторно запустить процедуру. Если испарение растворителя слишком медленно, де-увлажнитель может быть необходимым, потому что слишком медленное испарение обычно приводит к липким, оранжевый гель, и вы должны возобновить процедуры. Типичный диапазон температуры для испарения растворителя на 20 - 37 ° C. Реальные условия для сушки зависят от относительной влажности и температуры в помещении, но важно, что сушка медленная поддерживать мицеллы структуры, но не слишком медленно, чтобы обеспечить образование геля.
7. Заполните вес лодки с 18M Ωcm деионизированной водой (10-20 мл воды), накрыть крышкой и дать впитаться в течение 12-24 часов, чтобы удалить излишки алкил аммония бромид соли и HBr.
залить (или пипетки) из воды и промыть 3 раза с достаточным количеством воды DI, чтобы заполнить лоток каждый раз. Будьте осторожны, чтобы не потерять любую из полимерной пленки на этом этапе.
8. Позвольте весом лоток сидеть обнаружены пока полимер полностью высохнет На данный момент, полимер должен быть четким и несколько хрупкие пленки. Опять же, если воздух очень влажный, де-увлажнитель может быть необходимо для завершения испарения в установленные сроки.
9. С помощью шпателя тщательно удалить сухой пленки с весом лоток и передать его в чистый флакон стекло.
10. Добавить 2 мл этанола и 3 керамических смешивания бисером, и вихрь в течение 4 часов или до полимерная пленка полностью повторно приостановлены.

2. Иммобилизации ферментов в TBAB-Modified Nafion на активность Анализы

1. Для сухой фермент, отвешивать 1-10 мг фермента в 1,5 мл микроцентрифужную пробирку и добавьте 1 мл 100 мМ рН 7 фосфатный буфер, чтобы создать 1-10 мг / мл раствора фермента. ФоГ фермент, который находится в растворе, используйте bicinchoninic кислоты (BCA) анализ ¹³ до определения количества белка и добавить соответствующую сумму в 100 мМ фосфатного буфера довести концентрацию белка до 1-10 мг / мл. 1-10 мг / мл обычно соответствует 1-50 нмоль / мл.
2. До 120 мкл 1 мг / мл раствора фермента, добавить 60 мкл алкил аммония модифицированный Nafion решение, и вихрь в течение 10 секунд. (Эта смесь может быть расширен для большого количества дубликатов. Держите фермента к раствор полимера соотношение 2:1).
3. Внесите 60 мкл фермента / полимерный раствор в нижней части 3 отдельных 1 см ² кювет, и дать высохнуть в течение ночи.

3. Анализ иммобилизованных НАД-зависимые дегидрогеназы ферментов

1. В кювете, добавить 1,3 мл 50 мМ пирофосфат натрия (рН 8,8), 1,5 мл 15 мМ НАД (свежеприготовленный) и 0,1 мл воды.
2. Поместите кювету в UV / Vis спектрофотометр (т.е. ThermoScientific Evolutион 260 Био и Thermo Spectronic Genesys 20) установлен в длине волны 340 нм.
3. Обнулить спектрометр, а затем добавьте 0,1 мл этанола. Смешайте реагенты, осторожно пипеткой решение вверх и вниз в 5 раз. Для пустой, использовать 0,1 мл дополнительной воды вместо 0,1 мл этанола.
4. Измерить абсорбцию при 340 нм в течение 5 минут после реактивы были добавлены в кювет и через 20 минут после. Сюжет в двух точках данных, чтобы получить наклон, который может быть использован для деятельности расчетов.

4. Анализ иммобилизованных PQQ-зависимых дегидрогеназ

1. В кювете, добавить 1,5 мл фосфат натрия (рН 7,3) и 200 мкл 600 мкМ ПМС.
2. Поместите кювету в UV / Vis спектрофотометр настроен на длину волны 600 нм, а затем нулю спектрометра.
3. Добавить 100 мкл 700 мкл DCIP и 200 мкл субстрата интерес (этанола, ацетальдегида, глицерин, глюкоза, или глицеральдегид), а также смешивать реактивы, осторожно пипеткой Solutионных вверх и вниз в 5 раз. Для пустой, используйте 200 мкл воды вместо подложки интерес.
4. Измерить абсорбцию при 600 нм в течение 5 минут после реактивы были добавлены в кювет и через 20 минут после.

5. Анализ иммобилизованных глюкозооксидазы

1. В кювете, добавить 2,0 мл раствора, содержащего 0,2 М р-гидроксибензойной кислоты, 0,02% (вес / объем) азида натрия, 128 U пероксидаза, 0,3 мм 4-аминоантипирином, 1 М фосфата калия и 50 ммоль глюкозы. Смешайте раствор пипеткой вверх и вниз в 5 раз.
2. Поместите кювету в UV / Vis спектрофотометр набор для длины волны 510 нм.
3. Измерить абсорбцию при 510 нм в течение 5 минут после реактивы были добавлены в кювет и снова на 20 минут позже.

6. Представитель Результаты

Мицеллярной структуры модифицированного полимера Nafion может быть нарушена путем высушивания исходной соли / полимер со-литая пленка слишком ФАСтонн. На рисунке 2 показана соли / полимерной смеси, которая была правильно сушат в результате чего прозрачная, тонкая пленка коричневого цвета. Фильм, который высыхает слишком быстро, может привести к непрозрачные, белые хлопья полимеров в связи с тем, что процесс сушки можно уничтожить мицеллярной структуры.

После того, изменение Nafion полимеров и ферментов были смешаны и совместно бросили на дно кюветы, ферментативная активность анализов могут быть использованы для оценки стабильности ферментов в полимерную пленку. Таблицы 2-4 шоу анализ результатов двух ферментов дегидрогеназ и глюкозооксидазы иммобилизованных в различных фильмах изменение Nafion, соответственно. Обратите внимание, что высокая активность ферментов, иммобилизованных ферментов по сравнению с в буферном растворе, показали, что модифицированные полимеры Nafion действительно может повышать активность некоторых ферментов (называемых повышенная активность). Другие ферменты имеют транспортных ограничений, которые снижают их удельная активность при иммобилизации их в полимере (т.е. целлюлозы и амилазы, которые субстратов достаточно больших макромолекул).

40,89 мг / мл

Четвертичные соли аммония, используемый	3 раза превышение
T3A (тетрапропиламмония бромид)	32,37 мг / мл
TBAB (тетрабутиламмония бромид)	39,19 мг / мл
TPAB (tetrapentylammonium бромид)	46,01 мг / мл
TEHA (triethylhexylammonium бромид)	32,37 мг / мл
TMHA (trimethylhexylammonium бромид)	27,25 мг / мл
TMOA (trimethyloctylammonium бромид)	30,66 мг / мл
TMDA (trimethyldecylammonium бромид)	34,07 мг / мл
TMDDA (trimethyldodecylammonium бромид)	37,48 мг / мл
TMTDA (trimethyltetradecylammonium бромид)
TMHDA (trimethylhexadecylammonium бромид)	44,31 мг / мл
TMODA (trimethyloctadecylammonium бромид)	47,71 мг / мл

Таблица 1. Суммы, тетра-алкил соли аммония, используемый для Nafion модификации полимеров.

Тип Nafion	Активность ферментов (U / г)
Буфер (без полимера)	16,63 ± 8,11
Nafion (un-mod.)	9,25 ± 2,21
TMTDA	3,23 ± 2,92
TBAB	3,93 ± 3,33
TMDDA	4,19 ± 1,04
TMOA	3,51 ± 1,11
TMDA	8,00 ± 4,53
TMHA	1,68 ± 1,39
TMHDA	4,83 ± 0,99
TMODA	10,45 ± 3,20

Таблица 2 NAD-зависимых дегидрогеназ глюкозы активность иммобилизованных в отдельных изменение Nafion полимеров (примечание: иммобилизованные деятельности является функцией начальной удельной активности фермента)..

Тип Nafion	Активность ферментов (мЕд / г)
Буфер (без полимера)	7,18 ± 0,51
Nafion (un-mod.)	70,1 ± 0,5
TMTDA	133 ± 6
TBAB	244 ± 4
TMDDA	221 ± 6
TMOA	1,78 ± 0,63
TMDA	206 ±5
TEHA	40,1 ± 50,6
TMHDA	0
TMODA	1,45 ± 0,06

Таблица 3 PQQ-зависимых дегидрогеназ глюкозы активность иммобилизованных в отдельных изменение Nafion полимеров (примечание: иммобилизованные деятельности является функцией начальной удельной активности фермента)..

Тип Nafion	Активность ферментов (U / г)
Буфер (без полимера)	103,61 ± 3,15
Nafion (un-mod.)	19,93 ± 10,10
TMTDA	247,25 ± 12,49
TBAB	152,27 ± 5,29
TMDDA	262,05 ± 6,26
TMOA	129,18 ± 2,31
TMDA	141,23 ± 1,97
TMHA	131,75 ± 2,89
TMHDA	132,50 ± 1,18
TMODA	136,50 ± 0,96

. Таблица 4 представителя глюкозооксидазы удельной активности иммобилизованных в отдельных изменение Nafion полимеров (примечание: иммобилизованные деятельности является функцией начальной удельной активности фермента).

Рисунок 1. Схема включения TBAB в Nafion полимера и последующего использования в иммобилизации ферментов.

Рисунок 2. Оптическая фотография начального со-литой пленки Nafion и TBAB. Медленная сушка дает прозрачный, светло-коричневая пленка охватывающих боttom из весом лоток.

Обсуждение

В описанной процедуре, тетра-алкил соли аммония используются для изменения коммерческой Nafion создать мицеллярных полимеров, которые могут быть использованы для иммобилизации и стабилизации ферментов. Анализы описанных в порядке, показывают, что полимер может быть использован для имм?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер в каталоге
Nafion	Sigma-Aldrich	70160
Tetra соли алкиламмония бромид	Sigma-Aldrich	н / д
Алкогольдегидрогеназы	Sigma-Aldrich	A3263
Никотинамидадениндинуклеотида (NAD)	Simga-Aldrich	N7004
Натрий пирофосфат	Sigma-Aldrich	P8010
Феназинметасульфат (PMS)	Sigma-Aldrich	P9625
2,6-Dichloroindophenol (DCIP)	Сигналма-Aldrich	D1878
Глюкозооксидаза	Sigma-Aldrich	G7141
4-гидроксибензойной кислоты	Sigma-Aldrich	240141
Азид натрия	Sigma-Aldrich	S8032
Пероксидаза	Sigma-Aldrich	P8375
4-аминоантипирином	Sigma-Aldrich	06800
UV / Vis Спектрофотометр	Thermo	Эволюция 260 Bio или Spectronic Genesys 20
Vortex Genie
Аналитические весы