Коллекция протокол для поджелудочной железы человека

Резюме

В этом видеоролике показано вскрытие процедуры для обработки поджелудочной железы человека в различных форматах хранения. Анатомические ориентация сохраняется в течение поджелудочной регионов позволяют определить состав региональных островок и плотности.

Аннотация

Это рассечение и процедуры отбора образцов, был разработан для сети поджелудочной доноров органов с диабетом (nPOD) в рамках программы стандартизации подготовки поджелудочной железы оправился от трупных доноров органов. Поджелудочная железа состоит из 3 основных регионов (голова, тело, хвост), а затем серийных поперечных срезов всей медиальной к поперечной оси. Переменный разделы предназначены для фиксированного парафина и свежезамороженной блоков и остатков образцов фарш для оснастки замороженных препаратов образца, с или без РНКазы ингибиторов ДНК, РНК или белка изоляции. Основная цель процедуры вскрытия поджелудочной железы, чтобы попробовать все поджелудочной железы при сохранении анатомической ориентации.

Эндокринные клетки неоднородность с точки зрения островок состав, размер, и количество сообщается на человека островков по сравнению с грызунами островки ^1. Большинство человеческих островков из поджелудочной железы головы, тела и хвоста регионов состоят из инсулина containinг β-клеток, затем нижние пропорции глюкагон содержащие α-клеток и соматостатин-содержащие δ-клетками. Панкреатический полипептид содержащих ПП клетки и грелина содержащих клетки эпсилон также присутствуют, но в небольших количествах. В отличие от крючковатыми область содержит островков, которые в основном состоят из панкреатический полипептид, содержащий клетки PP ^2. Эти региональные различия островок возникают развития различий. Поджелудочная железа развивается из брюшной и спинной поджелудочной почки в кишки и после поворота желудка и двенадцатиперстной кишки, брюшной движется доли и сливается с спинной ^3. Вентральной доли является задняя часть головы, включая крючковатыми процесса, а спинной доли приводит к остальной части органа. Региональные изменения поджелудочной железы также сообщил, с хвостом области, имеющие высшее островок плотность по сравнению с другими регионами и спинной доли производные компоненты проходят выборочный атрофии сахарным диабетом 1 типа Дополнительная органов и тканей часто оправился от доноров органов и включать поджелудочной железы лимфатических узлов, селезенки и поджелудочной железы, не лимфатических узлов. Эти образцы будут восстановлены с подобными форматами, как и для поджелудочной железы с добавлением изоляции криоконсервированных клеток. При проксимальной части двенадцатиперстной кишки входит поджелудочной железы, слизистой оболочки двенадцатиперстной кишки могут быть собраны для парафиновых и замороженных блоков и оснастки фарш замороженные препараты.

протокол

1. Настройка

1. Этикетка кассеты для парафиновых блоков вручную с помощью карандаша или автоматически с помощью кассеты принтера. Включите доноров идентификатор (CaseID), образец типа, аликвоту количество, и любой дополнительный уникальный идентификатор (на примере листа, Приложение 1 ).
2. Этикетка октября формы, как и для кассет с перманентным маркером. Вырежьте 5-10 см прямоугольники из алюминиевой фольги.
3. Печать этикетки или вручную с перманентным маркером все флаконы и труб. Включите достаточно флаконы для фарша оснастки замороженных образцов и труб со средствами массовой информации RPMI свежих поставок. Для оснастки замороженных флаконов с RNAlater, добавляют 1 мл RNAlater каждого cryovial.
4. Настройка платы рассечение в области биобезопасности капот и столешницей с стерилизовать рассечение инструментов (пинцеты, скальпели, ножи, марлевые прокладки (4x4)), а также кассет и восьмеричные формы расположены в порядке использования.
5. Подготовить замораживание ванной, положивсухой лед в средних холодильных боксах из пенопласта (10х10 см) на глубину не менее 3 см и добавить изопентан до сухого льда полностью покрыта.
6. Дополнительно: Заполните небольшой контейнер Дьюара с жидким азотом.
7. Если поджелудочная железа необходимы для электронной микроскопии (ЭМ), подготовить TAAB фиксирующий добавлением 1,25 мл 16% параформальдегида, 1,25 мл 8% глутарового альдегида и 7,5 мл 0,1 М PBS. Подготовить Lowicryl фиксатором, добавляя 2,5 мл 16% параформальдегида в 7,5 мл 0,1 М PBS.
8. Подготовка решения, используемые для изоляции клеток. В 500 мл бутылку DMEF (с глютамином), выполните асептики при добавлении следующего:
   1. Эмбриональной телячьей сыворотки (FBS): добавить 50 мл, оставшиеся 10%.
   2. Пенициллина / стрептомицина (Pen / Strep, 10000 ЕД / мл / 10000 мкг / мл акций) - добавить 5 мл Pen / Strep акции RPMI для конечной концентрации 100 МЕ / мл / 100ug/mL. Кроме того, добавить 5 мл на 500 мл бутылку DPBS, когда используется для проведения лимфатических узлов или селезенки образцов.

2. Персонал

Процедуру оптимально осуществляется с тремя сотрудниками Однако эта процедура может проводиться с одним хорошо обучены человека. Два человека может вообще завершить процедуру за 90 минут. Фактическая продолжительность зависит от количества ткани получили и легкость нахождения узлов поджелудочной железы лимфатических узлов. Образцы для сотовых изоляции проводятся при температуре 4 ° C до завершения диссекции тканей в то время как образцы сыворотки обрабатываются параллельно.

Патологоанатом, патологии помощник, или эквивалент-опытный сотрудник ведет обработку ткани и выполняет основные вскрытия в том числе разделение (ы) головки поджелудочной железы и уборки узлах поджелудочной железы лимфатических узлов. Первоначальные усилия направлены на поджелудочной железе следует изучение пригородных поджелудочной жира лимфатических узлов.

Технолог лаборатории или эквивалентных сотрудников обучение в ткань отделки, основной обязанности взвесить поджелудочной железы и регионов и отделки тканей для фиксированных и замороженных блоков и оснастки для замороженных Vриалы. Получает двенадцатиперстной кишки и селезенки с помощником патологии и обрабатывает эти органы в то время как помощник патологии обработке поджелудочной железы.

Лаборант-сотрудник, который помогает другим в том числе блок и флакон маркировка, образец для измельчения криопробирки и сыворотки обработки.

3. Поджелудочная железа Dissection

1. Удалить двенадцатиперстной кишки и селезенки и поджелудочной железы очистить от посторонних жиров, сосуды и нервы тупыми и острыми вскрытия
2. Положите вымытую поджелудочной железы на вскрытии покрытая бумажным полотенцем. Смочите ватные аппликатор в синие чернила и распространения на передней поверхности поджелудочной железы. Пятно от избытка.
3. Дополнительно: Опустите новый аппликатор черными чернилами и распространения на задней поверхности поджелудочной железы. Вернуться поджелудочной железы нормальной ориентации с передней поверхности, обращенной прозектор.
4. Вырезать поджелудочной железы в 3 регионах: голова, тело и хвост (рис. 1). Вырезать стыке HEAг и тела затем разделить оставшуюся часть в ~ равными частями тела и хвоста.
5. Взвешивание каждого региона поджелудочной железы и запись веса (на примере проработки листе ( Приложение 1 )).
6. Раздел (~ 0,5 см) каждого региона поджелудочной железы в поперечной "хлеба буханка" образом (рис. 1).
7. Используйте разделы как из соединения между регионами для фарша образца. В зависимости от размеров поджелудочной железы, образец из организма хвост области перехода может быть трудно получить в этом случае число парафиновых блоков может быть уменьшен для получения фарша образцы или только образцы головки поджелудочной железы тела регионе могут быть получены. Этикетка криопробирки зависимости от того, головы и тела, чтобы обозначить проксимальной области на стыке.
   1. Фарш части и разделить поровну между криопробирки (≥ 1 г в одном флаконе). Быстрое замораживание флаконов без RNALater в жидкий азот или сухой лед - изопентан суспензия затем передать тО.А. -80 ° C морозильник.
   2. Хранить флаконы с RNALater при комнатной температуре в течение 30 минут, чтобы обеспечить равновесие, ремиксов и быстро заморозить в жидком азоте или в сухой лед, изопентан суспензия затем передать в морозильной камере -80 ° C.
8. Удалить переменный разделы парафин и восьмеричные блоков, начиная с парафином (рис. 1).
9. Наклонитесь всем поперечном сечении с правой стороны.
10. Место ~ 1,5 х 1,5 х 0,5 см. разделы в кассеты. Если поперечные срезы слишком велики, разрезать пополам (рис. 2б). Этикетка для кассеты синий передняя половина "А" и задняя половина "B".
11. Если куски все еще ​​слишком большой, вырезать каждую секцию перпендикулярно к предыдущему разреза (рис. 2). Этикетка кассет AD по часовой стрелке. Обрезка части дальнейшей необходимости укладываться в кассеты.
12. Количество блоков последовательно в регионе, начиная с самой медиальной разделе.
13. Для парафиновых блоков, положение сassettes так метка слева и место ткани в кассету, сохраняя ориентацию. Закройте крышку кассеты и передаче в контейнер с ~ 500 мл 10% нейтральном буферном растворе формалина (НБФ). Начать времени фиксации, когда последняя кассета находится в фиксатор.
14. Для блоков Office, залить тонким слоем ОКТ средств массовой информации в форме prelabeled затем заложить ткань в форме будучи уверенным, что для поддержания ориентации и покрывать ткани с октября Быстро погрузите центра развертывания форм в сухой лед - изопентан суспензии в течение ~ 1 минуты. Удалить из раствора и помещают на сухой лед для временного хранения или в -80 ° C морозильник для длительного хранения.
15. Получить ~ 0,5 х 0,5 см кусочки из головы тело соединение для электронной микроскопии (ЭМ). Место один ломтик в фиксирующий TAAB и другой срез в Lowicryl фиксатором. Хранить обоих типов фиксатор с образцами при температуре 4 ° C в течение 48 часов и / или на неопределенный срок до дальнейшей обработки для EM.

4. Селезенки, лимфатических узлов DissecTIONS и слизистой оболочки двенадцатиперстной кишки вскрытия

1. Изолировать поджелудочной железы лимфатических узлов (PLN) за счет жиров и отделка всех соединительных тканей к узлу капсулы. Место в стерильную чашку культуры ячейку, содержащую DMEF. В зависимости от общего числа изолирован, разделить на порции PLN свежих поставок, криоконсервированных выделения ячейки, парафин и / или октябре блоки, и флаконы. Фарш большие узлы на кусочки размером не более 0,5 см.
2. Фарш без поджелудочной железы лимфатических узлах и селезенке в небольшом (~ 0,5 см) кубиками. Место в фиксатор, OCT СМИ, или DMEM свежие поставки образца или криоконсервированных выделения ячейки в зависимости от количества исходных материалов.
3. Откройте в двенадцатиперстную кишку и осторожно протрите чистой слизистой оболочки двенадцатиперстной кишки в слизистой смоченным марлевым тампоном. Сокращение участков слизистой парафина и / или замороженных блоков ОКТ и фарш образцов для флаконов, с и без RNAlater. Мораторий, как и для других образцов.

5. Wrap октября блоков в предварительно помечены алюминиевой фольги и место октября блоков и флаконов в ящики для длительного хранения при температуре -80 ° C.

6. Отправить фиксированной Образцы для обработки парафин

1. Исправить тканей в течение 16 часов (в пределах 20 ± 4 часа) с помощью автоматического процессор парафин или с помощью ручного времени. Процесс в парафиновых блоков с использованием автоматического процессор ( Приложение 2 ).
2. Вставить разделы в точной ориентации в качестве размещенных прозектор с кассетной этикетке слева. Вставить в слизистой оболочке двенадцатиперстной кишки с поверхности разреза вниз, чтобы рассмотрение перпендикулярно слизистой оболочки подслизистой.

7. Очистите рассечение области и дезинфекции. Вымойте рассечение инструментов и повторно стерилизовать. Поместите остатки человеческих тканей в формалине фиксатором для хранения, биомедицинских отходов. Отменить биомедицинских отходов в соответствии с местным законодательством в течение одного месяца.

8. Обновление системы Пример инвентаризации

ve_title "> 9. Результаты представитель

Эта процедура будет обрабатывать нетронутыми человеческой поджелудочной железы с репрезентативной выборкой по всему органу, включая разграничение трех основных регионах, в частности, головы, тела и хвоста в течение 2 часов. Крючковатыми области, обнаружили в задней области головы, входит в голове рассечение. Средний вес поджелудочной железы в донорских органов, не страдающих диабетом составил 82,4 грамма (52,7 - 139,0 грамма). Поджелудочная железа региональных веса были примерно равны (рис. 3).

Эта процедура также может позволить реконструкцию всей поджелудочной железы использованием окрашенных слайды из последовательных парафин и восьмеричные блоков. Различные форматы возможны позволяет максимально использовать для нынешних и будущих технологий. В настоящее время nPOD лист случае при условии ( Приложение 1 ), который используется для документирования восстановленных образцов и последующий процессэссинг по аликвоту типах и количествах.

Рисунок 1. Общая схема процедуры. Всей поджелудочной железы обрабатываются при сохранении анатомической ориентации. Глава региона больше в верхней-нижней оси в связи с наличием вентральной доли поджелудочной железы в задней области, которая включает крючковатыми региона. Появившиеся области на перекрестках обозначают регионы для фарша образцов криопробирки. P, парафин, O, октябрь

Рисунок 2. Надписи схема поджелудочной железы разделов. Поперечных срезов поджелудочной железы можно разделить на половинки или четвертинки и буквами по часовой стрелке.

Рисунок 3. Поджелудочная железа весом от доноров органов без сахарного диабета.нетронутым поджелудочной железы взрослых доноров (> 17 лет) был взвешен, то делится на регионы и региональные веса получены. Данные средства ± SEM (n = 15).

Обсуждение

Целью этой процедуры является определение стандартной обработки поджелудочной железы, которые могут быть согласованы на нескольких сайтах сбор и таким образом позволяет сравнение результатов, полученных разными группами. Вскрытие метод основан на стандартной хирургической патолог...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер по каталогу	Комментарии
Вскрытие инструментов, включая скальпели с 22 лезвиями	Различный	Различный
Пробирки центрифужные (15 и 50 мл)	Fisher Scientific	05-539-5, 430828	Стерильный
Cryotubes (1,8 мл)	VWR Северной Америке	89004-300	Стерильные, штрих-коды дополнительно
RNAlater	Ambion	AM7021
Хирургические патологии Ink
Кассеты	Mercedes медицинской	CAS ECO109
10% нейтральный буферный формалин	Fisher Scientific	23-245-685
СМИ октября замораживания	TissueTek	4583
Пресс-формы	ThermoScientific	58952	Различные размеры
Изопентан	Fisher Scientific	O3551-4	Октябрь охлаждения ванны
Сухой лед			Октябрь охлаждения ванны
Жидкий азот в сосуд Дьюара			Привязать замораживание криопробирки
Клеточные культуры блюдо (100 мм)	Гранулирование	430167	Стерильный
Hyclone DMEF	ThermoScientific	SH30023.01	Стерильные, хранения охлажденного, глютамин включен
фетальной телячьей сыворотки	CellGro	35-010-CV	Стерильные, хранения замороженных аликвоты
Пенициллина / стрептомицина / Противогрибковые	GIBCO	15240-062	Стерильные, хранения замороженных аликвоты
Тип 9 парафиновые	Ричард Аллан научно-	8337
1X D-PBS	GIBCO	14190-144	Стерильный
16% параформальдегид	EM наук	15710	Сделайте свежие, охлажденные магазин
8% глутаральдегида	EM наук	16019	Сделайте свежие, охлажденные магазин
2-го уровня биобезопасности капот	Различный
Ультра-низкие морозильник	Различный
Сакура принтер кассеты	Сакура
Сакура VIP300	Сакура		Автоматический процессор парафин
Внедрение станции Парафин	ThermoFisher