인간의 췌장을위한 컬렉션 프로토콜

요약

이 비디오는 여러 스토리지 형식으로 인간의 췌장을 처리를위한 해부 절차를 보여줍니다. 해부 학적 방향이 지역의 섬 조성 및 밀도의 정의를 허용하도록 췌장 영역에 걸쳐 유지됩니다.

초록

이러한 해부 및 샘플링 절차는 시체 같은 장기 기증자에게서 채취한 췌장의 준비을 표준화하기 위해 당뇨병 (nPOD) 프로그램과 췌장 장기 기증자에 대한 네트워크를 위해 개발되었습니다. 췌장은 가로 축에 중간에 걸쳐 일련 가로 섹션에 다음 세 주요 영역 (머리, 몸, 꼬리)으로 나누어져 있습니다. 번갈아 섹션 고정 파라핀 및 신선한 냉동 블록 및 잔여 샘플에 사용되는가 DNA, RNA 또는 단백질 분리를 위해 함께 또는 RNAse 억제제없이도 스냅 냉동 시료 준비에 대한 다진있다. 췌장의 해부 절차의 전반적인 목표는 해부 학적 방향을 유지하면서 전체 췌장을 맛볼 것입니다.

섬 조성, 크기와 숫자의 관점에서 내분비 세포 이질은 쥐 islets ^1로 비교해 인간 islets에 대해보고됩니다. 췌장의 머리에서 인간 islets의 대부분은 몸과 꼬리 영역은 인슐린 containin으로 구성되어 있습니다g의 β-세포의 낮은 비율이어서 글루카곤 함유 α-세포 및 δ-세포를 somatostatin 함유합니다. 췌장 폴리펩티드 함유 PP 전지 및 ghrelin 함유 엡실론 세포도 존재하지만, 작은 숫자입니다. 반대로, uncinate 지역은 주로 췌장 폴리펩티드 함유 PP 전지 ^2로 구성되어있다 islets가 포함되어 있습니다. 이러한 지역 섬 변형은 발달의 차이에서 발생합니다. 췌장 foregut과 위장과 십이지장, 지느러미 ³ 복부 엽 이동 및 퓨즈의 회전 후 복부와 지느러미 췌장 꽃봉오리에서 개발하고 있습니다. 복부 기억 상실증이 지느러미 엽은 장기 나머지 상승을 제공하면서 uncinate 과정을 포함한 머리의 후부 부분을 형성하고 있습니다. 지역 췌장 편차도 꼬리 지역은 1 형 당뇨병에서 선택적 위축을받은 다른 지역과 지느러미 엽 - 파생 부품에 비해 더 높은 섬 밀도를 갖는으로보고됩니다 추가 장기와 조직은 종종 장기 기증자로부터 복구 및 췌장 림프절, 비장 및 비 췌장 림프절을 포함합니다. 이러한 샘플은 cryopreserved 세포 분리의 추가와 췌장에 대한 이와 유사한 형식으로 회복됩니다. 근위 십이지장은 췌장에 포함된 경우, 십이지장 점막은 파라핀 및 냉동 블록과 다진 스냅 냉동 준비를 위해 수집됩니다.

프로토콜

1. 설정

1. 연필로, 또는 자동으로 카세트 프린터 수동으로 파라핀 블록에 대한 라벨 카세트. 기증자 식별자 (CaseID), 샘플 종류, 나누어지는 번호 및 추가 고유 식별합니다 (사례 워크시트 등이 부록 1 ).
2. 영구 마커와 카세트뿐 아니라 라벨 10월 금형. 알루미늄 호일의 5~10센티미터의 직사각형을 잘라 버릴거야.
3. 영구 마커 모든 튜브와 튜브와 라벨을 인쇄하거나 수동으로. 신선한 배송의 RPMI 매체와 다진 스냅 냉동 샘플 튜브에 대한 충분한 튜브를 포함합니다. RNAlater과 스냅 냉동 튜브은 각 cryovial 1 ML의 RNAlater를 추가합니다.
4. 멸균 절개 악기 (포셉, scalpels, 블레이드, 거즈 패드 (4x4))뿐만 아니라 카세트와 10월 금형과 biosafety 후드 및 카운터 상판의 설정 해부 보드 사용의 순서로 배열.
5. 넣어 냉동 목욕 준비건조 적어도 3cm의 깊이로 중간 크기 스티로폼 상자 (10x10 ㎝)에 얼음과 드라이 아이스가 완전히 덮여 때까지 이소펜탄를 추가합니다.
6. 옵션 : 액체 질소로 작은 Dewar 컨테이너를 채웁니다.
7. 췌장은 전자 현미경 (EM)을 위해 필요한 경우, 1.25 ML 16 % paraformaldehyde, 1.25 ML 8 % 글루 타 알데히드, 그리고 7.5 ML 0.1M PBS를 추가하여 TAAB의 정착액을 준비합니다. 7.5 ML 0.1M PBS에 2.5 ML 16 % paraformaldehyde를 추가하여 Lowicryl 정착액을 준비합니다.
8. 세포를 분리에 사용되는 솔루션을 준비합니다. 다음 사항을 추가하는 동안 DMEF 500 ML 병 (글루타민과)에, 무균 기술을 따르십시오
   1. 태아 소 혈청 (FBS) : 추가 50mL, 최종 10 %.
   2. 페니실린 / 스트렙토 마이신 (펜 / Strep, 10,000 U / ML / 10,000 UG / ML 주식) - 100 U / ML / 100ug/mL의 최종 농도를 위해 RPMI에 5 ML 펜 / Strep 주식을 추가합니다. 또한 림프절이나 비장 샘플을 들고 사용 DPBS의 500 ML 병에 5 ML을 추가합니다.

2. 인원

1. 절차는 최적의 세 직원 그러나 절차가 하나의 잘 훈련 개별적으로 수행할 수로 수행됩니다. 두 개인은 일반적으로 90 분 이내에 절차를 완료할 수 있습니다. 실제 기간은받은 조직의 숫자에 의존하고 췌장 림프절을 찾는 용이성. 셀 isolations에 대한 샘플이 4 시에 개최됩니다 ° C까지 조직 해부 완료 혈청 샘플을 병렬로 처리하는 동안.
2. 병리학자, 병리 조교, 또는 이와 동등한-숙련된 직원들이 조직 취급을 선도하고 췌장의 머리 부문 (들)을 포함하고 췌장 림프절을 수확 주요 절개를 수행합니다. 초기 노력은 임파선에 대한 사망 시에 췌장의 지방 시험이어서 췌장쪽으로 이동합니다.
3. 실험실 기술자 또는 동급 - 직원 누구의 일차 책임 고정 및 냉동 블록과 스냅 냉동 V를위한 췌장과 지역 및 트림 조직의 무게를하는 것입니다 트리밍 조직 훈련ials. 병리학 조교에서 십이지장과 비장을 받고 병리의 비서가 췌장을 처리하는 동안 이러한 장기를 처리합니다.
4. 블록 및 유리병의 라벨, cryovials위한 닦지 샘플 및 혈청 처리를 포함하여 다른 사람을 도와 실험실 조교 - 직원.

3. 췌장의 해부

1. 십이지장과 비장을 제거하고 무딘와 날카로운 절개를 사용하는 관계없는 지방, 혈관, 그리고 신경의 췌장을 청소
2. 종이 수건으로 덮여 해부 보드 청소 췌장 놓으십시오. 췌장의 앞부분은 표면에 파란색 잉크 및 확산에 솜 스쳐지나 작은 주걱을 찍어. 초과를 가릴.
3. 옵션 : 췌장의 후부 표면에 검정 잉크와 확산에 새로운 작은 주걱을 찍어. 앞부분은 표면이 시체 해부자 직면와 함께 정상적인 방향으로 췌장을 반환합니다.
4. 머리, 몸 및 꼬리 (그림 1) : 3 지역으로 췌장을 잘라요. hea의 경계인를 잘라d와 신체 그러면 몸과 꼬리를위한 ~ 동등한 부분으로 남아있는 부분을 나눕니다.
5. 췌장 및 기록 중량 (케이스 검사 결과 시트 (각 지역 체중 부록 1 )).
6. 섹션 (~ 0.5 ㎝) 가로 "빵 고기 '방식 (그림 1)에서 췌장의 각 지역.
7. 다진 시료를위한 지역 간의 두 분기점에서 섹션을 사용합니다. 췌장의 크기에 따라 체형이 꼬리 접합 지역에서 샘플 파라핀 블록의 수를 얻을 수 췌장 머리 - 몸 지역에서 다진 시료 또는 유일한 샘플을 얻기 위해 감소시킬 수있는 경우에 얻기 어려울 수 있습니다. 머리 또는 교차점에서 근위 지역을 상징하는 신체로 따라 라벨 cryovials.
   1. 조각을 말하다 및 cryovials (유리병 당 ≥ 1g) 사이에 균등하게 나눕니다. 신속하게 액체 질소 또는 드라이 아이스의 RNALater없이 튜브를 고정 - 이소펜탄 슬러리 그러면 T를 전송OA -80 ° C의 냉동고.
   2. 평균 수 있도록 30 분간 실온에서 RNALater와 튜브를 계속 빠르게 리믹스하고 나서 -80 ° C의 냉동고로 전송 액체 질소 또는 드라이 아이스 이소펜탄 슬러리의 동결.
8. 파라핀과 파라핀 (그림 1)로 시작하는 10월 블록에 대한 교체 섹션을 제거합니다.
9. 오른쪽으로 가로 섹션을 기댈.
10. 장소 ~ 1.5 X 1.5 카세트에서 X 0.5 cm 섹션. 가로 부분이 너무 큰 경우, 반은 (그림 2B)로 잘라. "B"로 ""와 후부 반으로 푸른 앞부분 절반 라벨 카세트.
11. 조각 아직도 너무 큰 경우, 이전 컷 (그림 2C)로 각 섹션에 수직으로 잘라. 시계 방향 방식으로 라벨 카세트는 광고입니다. 이상과 같은 카세트 이내에 맞게 필요한 부분을 트림.
12. 대부분의 중간 섹션으로 시작하는 지역 내에서 순차적으로 번호 블록.
13. 파라핀 블록 위치에있다 c라벨이 너무 assettes는 방향을 유지, 카세트로 왼쪽과 장소 조직하는 것입니다. 닫기 카세트 뚜껑과 ~ 500 ML 10% 중립과 컨테이너로 전송 (NBF) 포르말린 버퍼. 마지막으로 카세트가 정착액에 배치되는 타이밍 고정을 시작합니다.
14. 10월 블록의 경우 prelabeled 금형에 10월 미디어의 얇은 레이어를 부어 후 오리 엔테이션을 유지하고 10월과 조직을 충당해야되는 금형의 조직을 바칩니다. ~ 1 분 이소펜탄 슬러리 - 급속 드라이 아이스에 10월 금형 젖어. 임시 저장을위한 드라이 아이스 또는 -80에서 슬러리 및 장소에서 제거 장기 저장을위한 ° C 냉동고.
15. 전자 현미경 (EM)의 헤드 바디 접합부에서 ~ 0.5 X 0.5 cm의 슬라이스를 구합니다. TAAB의 정착액 및 Lowicryl 정착액의 다른 슬라이스에서 개최 한 조각. 최소 48 시간 및 / 또는 무기한 EM에 대한 처리까지. 대해 4 ° C에서 샘플 고정력있는 두 가지 유형을 저장

4. 비장, 림프 노드 Dissections 및 십이지장 점막 절개

1. 지방에서 췌장 림프절 (PLN)를 격리하고 노드 캡슐에 대한 모든 결합 조직을 잘라. DMEF를 포함하는 무균 세포 배양 접시에있는 장소. 격리 총 숫자에 따라, 신선한 출하량, cryopreserved 세포 isolations, 파라핀 및 / 또는 10월 블록 및 튜브에 대한 aliquots으로 PLN을 나눕니다. 0.5 cm보다 큰 조각으로 큰 노드를 말하다.
2. 소형 (~ 0.5 ㎝) 큐브에 비 췌장 림프절과 비장을 말하다. 시작하는 재료의 양을에 따라 신선한 샘플 출하 또는 cryopreserved 셀 isolations위한 정착액, 10 월 미디어, 혹은 DMEM의 장소.
3. 십이지장을 열고 부드럽게 moistened 거즈 패드와 점액의 십이지장 점막 깨끗하게 닦아냅니다. 와 함께 RNAlater없이 파라핀 및 / 또는 유리병을위한 냉동 10월 블록과 다진 샘플 점막 부분을 잘라 버릴거야. 다른 샘플로 정지해.

5. 사전 분류 알루미늄 호일과 장소 10월 블록과에서 랩 10월 블록 -80에서 장기간 저장 상자에 튜브 ° C.

6. 파라핀 처리에 고정 샘플 제출

1. 자동 파라핀 프로세서를 사용하거나 수동으로 타이밍을 사용 16시간을위한 조직 (범위 : 20 ± 4 시간) 이후의 수정 프로그램입니다. 자동 프로세서 (사용하는 파라핀 블록을 처리 부록 2 ).
2. 왼쪽으로 카세트 레이블 시체 해부자에 의해 배치로 정확한 방향으로 섹션을 포함시킵니다. submucosa에 점막 직각의 심사를 허용하도록 절단 표면과 십이지장 점막을 포함시킵니다.

7. 해부 영역을 청소하고 소독. 절개 악기를 씻고 다시 소독. 생명 의학 폐기물 등의 저장을 위해 포르말린 정착액에 남은 인간의 조직을 놓습니다. 1 개월 이내 현지 규정에 따라 생물 의학 폐기물을 폐기하십시오.

8. 샘플 인벤토리 시스템 업데이트

ve_title "> 9. 대표 결과

이 절차는 3 대 즉 지역, 머리, 몸, 2 시간 이내에 꼬리 경계를 포함하여 장기에 걸쳐 대표적인 샘플링과 함께 그대로 인간의 췌장을 처리합니다. 후부 머리 지역에서 발견 uncinate 지역은, 머리를 절개에 포함되어 있습니다. 당뇨병없이 장기 기증자의 평균 췌장 무게는 82.4 g (- 139.0 g 52.7)였다. 췌장 지역 가중치는 (그림 3)은 약 있었 읍니다.

이 절차는 또한 순차적인 파라핀과 10월 블록에서 스테인드 슬라이드를 사용하여 전체 췌장의 재건을 위해 허용할 수 있습니다. 복합 형식은 현재와 미래 기술의 최대 활용을 위해 허용 가능한 있습니다. 현재 nPOD 사례 워크시트가 (제공되는 부록 1 회복 샘플 및 후속 PROC을 문서화하는 데 사용됩니다)나누어지는 종류와 수량에 의해 essing.

1 그림. 해부 학적 방향을 유지하면서 절차의 전반적인 계획은. 전체 췌장이 처리됩니다. 머리 지방은 uncinate 지역을 포함 후부 지역의 복부 췌장 엽의 존재로 인해 우수한-열등 축에 더 깁니다. 분기점에서 부화 면적은 cryovials에 다진 샘플에 사용되는 영역을 나타냅니다. P, 파라핀, O, 10월

그림 2. 췌장 섹션을위한 문자 체계. 가로 췌장의 조각은 더욱 반쪽 또는 분기로 나누어 시계 방향 방식으로 글자 수 있습니다.

그림 3. 당뇨병없이 장기 기증자의 췌장의 무게.성인 기증자 (> 17 세)에서 그대로 췌장을 얻어 지역 및 지역의 중량으로 나눈 후 무게되었다. 데이터는 의미가 ± SEM (N = 15).

토론

이 절차의 목적은 여러 컬렉션 사이트 전반에 걸쳐 조화가 될 수있는 표준 췌장 처리를 정의하고 있으므로 다른 그룹에 의해 얻은 결과의 비교를 허용하는 것입니다. 절개 방법은 내부 - 지역 제트 연료의 파이프 뒤에 주요 췌장 영역의 주석에 대한 추가 단계와 일반 외과 병리학 관행에 따라 달라집니다. biospecimen 처리 방법의 표준화와 같은 국립 암 연구소 ⁶ 등 국가 biobanking 기관 biospecime...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
시약의 이름	회사	카탈로그 번호	댓글
22 블레이드와 scalpels 포함한 절개 악기	여러	여러
원심 분리기 튜브 (15 및 50 ML)	피셔 과학	05-539-5, 430,828	불모의
Cryotubes (1.8 ml) 쇼핑	VWR 북미	89004-300	멸균, 바코드 선택
RNAlater	Ambion	AM7021
외과 병리학 잉크
카세트	메르세데스 의료	CAS ECO109
일중립 0 % 포르말린 버퍼	피셔 과학	23-245-685
10월 냉동 미디어	TissueTek	4583
금형	ThermoScientific	58,952	다양한 크기
이소펜탄	피셔 과학	O3551-4	10월 추워서 목욕
드라이 아이스			10월 추워서 목욕
Dewar 플라스크에 액체 질소			냉동 cryovials 낚아채
세포 배양 접시 (100mm)	코닝	430,167	불모의
Hyclone DMEF	ThermoScientific	SH30023.01	멸균 가게에 냉장, 글루타민 포함
태아 소 혈청	Cellgro	35-010 - 이력서	멸균, 냉동 저장 aliquots
페니실린 / 스트렙토 마이신 / Antifungal	GIBCO	15240-062	멸균, 냉동 저장 aliquots
9 파라핀을 입력	리차드 - 앨런 과학	8337
1X D-PBS	GIBCO	14190-144	불모의
16 % Paraformaldehyde	EM 과학	15,710	신선 저장소가 냉장하십시오
8 % 글루 타 알데히드	EM 과학	16,019	신선 저장소가 냉장하십시오
Biosafety 레벨 2 후드	여러
초저 냉동고	여러
사쿠라 카세트 프린터	사쿠라
사쿠라 VIP300	사쿠라		자동 파라핀 프로세서
파라핀의 임베딩 역	ThermoFisher