Оценка функции мышц-разгибателей мышц пальцев Longus<em&gt; EX VIVO</em&gt; И передней большеберцовой мышцы<em&gt; В месте</em&gt; У мышей

Резюме

Изменения в мышцах конечностей сократительной и пассивные механические свойства имеют важное значение биомаркеров заболевания мышц. Эта рукопись описывает физиологические тесты для измерения этих свойств в мышиной мышцы пальцев разгибателей и передней большеберцовой мышцы.

Аннотация

Body movements are mainly provided by mechanical function of skeletal muscle. Skeletal muscle is composed of numerous bundles of myofibers that are sheathed by intramuscular connective tissues. Each myofiber contains many myofibrils that run longitudinally along the length of the myofiber. Myofibrils are the contractile apparatus of muscle and they are composed of repeated contractile units known as sarcomeres. A sarcomere unit contains actin and myosin filaments that are spaced by the Z discs and titin protein. Mechanical function of skeletal muscle is defined by the contractile and passive properties of muscle. The contractile properties are used to characterize the amount of force generated during muscle contraction, time of force generation and time of muscle relaxation. Any factor that affects muscle contraction (such as interaction between actin and myosin filaments, homeostasis of calcium, ATP/ADP ratio, etc.) influences the contractile properties. The passive properties refer to the elastic and viscous properties (stiffness and viscosity) of the muscle in the absence of contraction. These properties are determined by the extracellular and the intracellular structural components (such as titin) and connective tissues (mainly collagen) ^1-2. The contractile and passive properties are two inseparable aspects of muscle function. For example, elbow flexion is accomplished by contraction of muscles in the anterior compartment of the upper arm and passive stretch of muscles in the posterior compartment of the upper arm. To truly understand muscle function, both contractile and passive properties should be studied.

The contractile and/or passive mechanical properties of muscle are often compromised in muscle diseases. A good example is Duchenne muscular dystrophy (DMD), a severe muscle wasting disease caused by dystrophin deficiency ³. Dystrophin is a cytoskeletal protein that stabilizes the muscle cell membrane (sarcolemma) during muscle contraction ⁴. In the absence of dystrophin, the sarcolemma is damaged by the shearing force generated during force transmission. This membrane tearing initiates a chain reaction which leads to muscle cell death and loss of contractile machinery. As a consequence, muscle force is reduced and dead myofibers are replaced by fibrotic tissues ⁵. This later change increases muscle stiffness ⁶. Accurate measurement of these changes provides important guide to evaluate disease progression and to determine therapeutic efficacy of novel gene/cell/pharmacological interventions. Here, we present two methods to evaluate both contractile and passive mechanical properties of the extensor digitorum longus (EDL) muscle and the contractile properties of the tibialis anterior (TA) muscle.

протокол

1. Оценка сократительной и пассивные свойства EDL естественных условиях Ex мышц

Сократительной и пассивных свойств EDL мышцы измеряется бывших естественных помощью Aurora Научно в пробирке тест-системы мышц. См. Таблицу 1 для материалов и оборудования.

1.1 Оборудование подготовки

1. Соберите ткань органа ванны, обеспечивая oxytube в воде ткань куртки ванны. Прикрепите собранную ванны в мышцах монтажного устройства. Подключите газовой линии, oxytube. Закрепить линии циркуляции воды в воде ткань куртки ванну и поставить игольчатый клапан в ванну дренаж.
2. Включите циркулирующей водой ванну и отрегулировать температуру до 30 ° С ^7. Разрешить 5 PSI (фунтов на квадратный дюйм) 95% O ₂ -5% CO ₂ течь через oxytube. Наполните ванну с буфером Рингера. Уравновешивают буфером, по крайней мере10 мин с постоянным потоком газа, регулируя oxytube клапана.
3. Включите инструментов (стимулятор, двухрежимный рычажной системы, и сигнал интерфейса). Загрузите динамического мышечного контроля (DMC) программного обеспечения в соответствии с инструкцией завода-изготовителя.

1,2 EDL рассечение мышц

Все исследования на животных должны быть одобрены Институциональные уходу и использованию животных комитета.

1. Anesthetize мыши с внутрибрюшинного введения 2,5 мкл / г веса тела коктейль анестетика (см. раздел материалов). На протяжении хирургической процедуры, глубины седации было проверено выполнение ноги шнура. Добавка в размере 10% начальной дозы анестетика управляется при необходимости держать животных под наркозом. Бритье задних конечностей. Поддержание температуры тела на 37 ° C до рассечения процедуру размещения мыши на грелку. Температура тела контролируется постоянно измерения ректальной температЮр использованием теплового зонда.
2. Поместите мышь на спине на вскрытие доски (рис. 1). Снимите кожу ног, чтобы открыть задние мышцы конечностей. Закрепите ноги на блоке Sylgard с помощью двух портниха контактами, один в ногу, а другой в мышцах гасШз. Место тепла лампы над корпусе мыши для поддержания температуры тела при температуре 37 ° C. Постоянно переливать все открытые мышцы с буфером Рингера. Слейте избыток буфера через вакуумную линию.
3. Expose дистального сухожилия TA и разгибателей связки под стереомикроскопом анализируя кожу на ноге. Аккуратно удалите фасцию покрытие TA мышцы. Вырезать разгибателей связки, чтобы освободить дистального сухожилия TA.
4. Вырезать дистального сухожилия TA и использовать его для шелушиться мышцы TA. Осторожно снимите TA мышцы на его проксимального крепления. Поместите тонкий кусок буфера Рингера пропитанной хлопковой рядом с EDL мышцы поглощают кровотечения, вызванные разрывом мышц сосудистой TA. Используйте вакуумную линию, чтобы удалить излишки буфера и крови.
5. Галстук двойных квадратных узлов следует цикл узел помощью шовного хлеб шелка на стыке сухожилий мышц (MTJ) дистального EDL мышцы (рис. 2). Сделайте разрез в дистальной части двуглавой мышцы бедра, чтобы разоблачить проксимального EDL мышцы. Повторите тот же набор узлов (рис. 2) на MTJ проксимального отдела EDL сухожилия. Прикрепите крючок рычага, либо проксимальных или дистальных узлы с двойным квадратный узел использованием той же линии шва. Отрежьте оставшиеся линии шва.
6. Вырезать проксимального EDL сухожилия выше проксимального узел шва. Поднимите EDL мышцы с крючка и сократить сосудистую под мышцу. Вырезать дистального сухожилия EDL уступает дистальных узел шва, чтобы удалить EDL мышцы задних конечностей. Изолируйте открытый задних конечностей с куском буфер Рингера пропитанной хлопка.
7. Прикрепите крючок рычага. Совместите мышцы вертикальномежду двумя электродами. Закрепить дистальной линии шва фиксированной пост. Поднимите ткани ванну, чтобы погрузить мышцы в буфер Рингера. Отрегулируйте покоя напряжение до 1,0 г с использованием двойного грубой / точной стадии перевода и позволит мышцы, чтобы уравновесить течение по крайней мере 10 мин.

1,3 Измерение сократительной и пассивных свойств EDL мышцы

Используйте таблицу 2 для настройки параметров в DMC программное обеспечение для каждого из следующих измерений. Анализ данных с помощью динамического анализа мышцы (DMA) программного обеспечения.

1.3.1 Измерение сократительные свойства мышц EDL

1. Стимулировать EDL мышцы в три раза при 150 Гц с 60 секунд друг от друга, чтобы стабилизировать мышц ^8.
2. Стимулировать EDL мышцы при различных покоя напряжение для определения оптимальной длины (Lo). Оптимальная длина длина, на которой мышца развивает максимальную напряженность дергаться. Разрешить мышцыотдохнуть в течение 2 мин.
3. Отрегулируйте отдыха напряженности Ло. Измерение мышечной силы в одном стимуляции дергаться. Определить абсолютную силу подергивания (Pt), время до пика напряжения (ТРТ) и половина времени релаксации (½ RT) из Pt. Разрешить мышц, чтобы расслабиться в течение 2 мин.
4. Отрегулируйте отдыха напряженности Ло. Измерьте тетаническое мышечной силы генерируются на разных частотах стимуляции (50, 80, 100, 120, 150 и 200 Гц). Определение абсолютных максимальных тетаническое силы мышц (Po), где мышечное усилие достигает максимальной. Измерьте TPT и ½ РТ Po ^9.
5. Разрешить мышц, чтобы расслабиться в течение 5 мин. Отрегулируйте отдыха напряженности Ло. Применить 10 циклов эксцентричного сжатия с 2 минуты отдыха между циклами. Рассчитать относительную потерю силы Po после каждого цикла эксцентричного сжатия.
6. Снимите EDL мышцы от аппарата и сократить сухожилия на шов сайта. Определите мышцы сырого веса и рассчитать мышцы площадь поперечного сечения (CSA)6,10.

1.3.2 Измерение пассивных свойств EDL мышцы

1. Проанализируйте контралатеральной EDL мышцы и приложите его к аппарату, как описано в разделе 1.2, шаг 2 до 7.
2. Тема EDL мышцы шестиступенчатой ​​растяжение протокол, в котором мышца напряжена до 160 Lo% с шагом 10% Ло. Анализ напряженно-деформированного профиля ^6.
3. Оцените вязкая собственности EDL мышцы, измеряя скорость релаксации напряжений (SRR) в следующие сроки после растяжения и проведение мышц на 10% Lo: от пика до 0,1 с после пика (размах), от 0,1 до 0,2 с ПП, от 0,2 до 0,5 п.п., от 0,5 до 1 с п.п. и от 1 до 1,5 с С.
4. В конце исследования, усыпить мышей путем смещения шейных позвонков и / или обезглавливания в то время как мыши все еще под наркозом. Снимите EDL мышцы от аппарата и сократить сухожилия на шов сайта. Определите мышцы сырого веса и рассчитать мышцы крест себеctional области (CSA) ^{6, 10.}

2. Оценка сократительные свойства мышц TA На месте

Сократительные свойства мышц TA измеряется с помощью Aurora Научно на месте тест-системы мышц. См. Таблицу 1 для материалов и оборудования.

2.1 Оборудование подготовки

1. Нагрейте термо-контролируемых животной стадии до 37 ° С с использованием циркулирующей водой ванну.
2. Включите инструментов (стимулятор, двухрежимный рычажной системы, и сигнал интерфейса). Загрузите DMC программного обеспечения в соответствии с инструкцией завода-изготовителя.

2.2 Подготовка мышц TA на месте для измерения силы

1. Anesthetize мыши, бритье задних конечностей и разоблачить TA мышцы, как описано в шагах с 1 по 3 в разделе 1.2.
2. Завяжите двойной квадратный узел вокруг коленной чашечки связки УЗИнг шва хлеб шелка. Завяжите двойной квадратный узел следуют петли узел на MTJ дистальных мышц TA (рис. 2), связать еще один двойной квадратный узел, оставляя ~ 10 мм петля из дистального сухожилия узел TA использованием той же линии шва. Поместите второй двойной квадратный узел на стороне петли.
3. Снимите штифты из задних конечностей и положение животного лежа. Expose двуглавой мышцы бедра. Сделайте надрез по средней линии, чтобы показать седалищного нерва. Завяжите двойной квадратный узел вокруг проксимального конца седалищного нерва. Обрезать одной стороны шва линии и сократить нерва выше узла. Аккуратно потяните седалищного нерва к коленного сустава с использованием шва и очистить окружающую соединительную ткань, чтобы бесплатно ~ 5 мм его длины. Не растягивайте нерва во время этой процедуры и постоянно переливать нерва с буфером звонка.
4. Подготовка противоположной мышцы TA, как описано в шагах с 1 по 3. Обложка одного из открытых задних конечностей с куском RiБуфер nger в пропитанной хлопка. Постоянно переливать обе задние конечности с подогретого (37 ° C) буфера Рингера. Удалите излишки буфера через вакуумную линию.
5. Поместите животных ничком на животных платформы. Установите держатель колена зажим для животных платформе и закрепить оба колена на металлический штифт с двойной квадрат узлов использованием коленную чашечку линии шва связки. Pin обеими ногами на блоке Sylgard использованием портниха контакты. Закрепить животных платформы на термо-контролируемом этапе. Установите тепла лампы для поддержания тела животного температура ядра при 37 ° C.
6. Закрепите держатель электрода для животных платформы и заложить седалищного нерва на электрод с помощью шва. Держите электрод от задних мышц конечностей. Вырезать дистального сухожилия TA непокрытого задних конечностей на месте шва MTJ. Прикрепить дистального сухожилия TA шов петля на крючок рычага. Изолируйте открытый мышцу задней конечности с буфером теплой Рингера пропитанной хлопка.

2,3 Измерение сократительные свойства мышц TA

1. Используйте таблицу 2 для установки параметров в DMC программного обеспечения. Следуйте тем же протоколом, описанным в разделе 1.3.1 для определения сократительные свойства мышц TA. Анализ данных с помощью программного обеспечения DMA.
2. После сократительной измерения собственность, отделить дистального сухожилия TA шов петля с крючка руку моста. Снимите TA мышцы. Определите мышцы сырого веса и рассчитать CSA ^10.
3. Измерьте сократительные свойства мышц контралатеральной ТА в соответствии с шаги с 1 по 3, описанные выше. Усыпить мыши в соответствии с руководящими принципами институциональной в конце исследования.

Результаты

Следующие результаты являются представления наших предыдущих докладах ^6,9. Данные представлены в виде среднего значения ± стандартная ошибка среднего. Таблица 3 показывает морфометрических свойств EDL мышцы в нормальном BL10 и дистрофин-дефицитных (MDX) мышей от 4 до 6 месяцев. Рисунке 4 показана представитель сократительной и пассивные свойства EDL мышцы BL10 и MDX мышей. Сократительные свойства мышц EDL описывается следующими условиями, включая конкретные (абсолютная сила, деленная на CSA) дергаться силы (рис. 4а), конкретные максимальной силы тетаническое (рисунок 4B), TPT и ½ RT абсолютных максимальных тетаническое силу (рис. 4С и D). TPT и ½ RT можно также вычислить с абсолютной силы дергаться. Напряженно-деформированного профиля (рис. 4E) и SRR (рис. 4F)повторно используемый для описания свойств пассивных EDL мышцы.

Отсутствие дистрофина оказывает значительное влияние на сократительную и пассивных свойств EDL мышцы ^6,9. Конкретные дергаться и тетаническое силы значительно сокращаются в мышцах MDX EDL. TPT значительно быстрее, в то время как ½ RT значительно медленнее в мышцы MDX EDL. Напряженно-деформированного профиля показывает, что жесткость значительно увеличивается в мышцах MDX EDL. Мышцы MDX EDL также дает значительно намного выше сила сопротивления (пассивный стресс) до достижения пика напряжения, в то время как после пика напряжения снижаться гораздо быстрее. Кроме того, SRR был значительно выше в мышцах MDX EDL по сравнению с BL10 EDL мышцы.

Статистический анализ

Статистическая значимость между двумя группами анализируется Стьюдента-тест. Для SТАТИСТИЧЕСКИЕ значение среди нескольких групп, в одну сторону или двусторонней ANOVA анализ следует Bonferroni анализ постфактум рекомендуется использование программного обеспечения SAS (SAS Institute Inc, Cary, NC). Разница считается значимым при р <0,05.

Таблица 1. Материалов и оборудования.

Эксперимент	Отдыхая напряжения (грамм)	Частота импульса (Гц)	Длительность импульса (мс)	Стимуляция продолжительность (мс)	Stretch длины	Stretch продолжительность (мс)	Stretch скорости	Комментарии
1. Оценка сократительной и пассивных свойств EDL естественных бывших мышц
1.3.1 Измерение сократительные свойства мышц EDL
1. Разминаться	1,0	150	0,2	300				Отдых мышцы в течение 60 секунд между каждым стимулом. Эти предварительные тетаническое сокращений стабилизации мышц для последующего измерения.
2. Оптимальная длина мышцы (Lo)	0,5, 1,0, 1,5 и 2,0	1	0,2	300				Разрешить мышц, чтобы расслабиться в течение 30 секунд между каждым стимулом. Измерьте мышцы оптимальной длины с помощью цифровой суппорта.
3. Одноместный TWITCH силы (Pt)	Отрегулируйте отдыха напряженности Lo	1	0,2	300
4. Тетаническое силу мышц	Отрегулируйте отдыха напряженности Lo	50, 80, 100, 120, 150 и 200	0,2	300				Разрешить мышц, чтобы расслабиться в течение 1 мин между каждым стимулом. Определить частоты, которые генерируют максимальную абсолютную тетаническое силы (Po).
5. Эксцентричный сокращения	Отрегулируйте отдыха напряженности Lo	Использование частот, что создает максимальную силу тетаническое (Po)	0,2	700	10% Lo	последние 200 мс стимуляции продолжительности	0,5 Lo / сек	Повторите эксцентричных сокращений в течение 10 циклов с 2 минуты отдыха между циклами.
6. CSA из EDL мышцы								CSA = (мышечная масса (г) / [1,06 г / см 3 х (Lo х 0,44)]. 1,06 г / см 3, плотность мышц и 0,44 является EDL длины мышечных волокон к Ло отношение.
1.3.2 Измерение пассивных свойств EDL мышцы
1. Шесть шагов растяжения протокола	Отрегулируйте отдыха напряженности Lo				10% Lo		2 см / сек	Повторите растяжку протокола с добавлением 10% Lo до 160% Lo будет достигнута. Младший байт регистра АХ общего назначения ЦП 1,5 сек между протяжении цикла.
2. SRR	Отрегулируйте отдыха напряженности Lo				10% Lo		2 см / сек	ССР, рассчитывается путем деления разницы в напряжении с тIME прошедшее между двумя временными точками в срок.
2,3 Измерение сократительные свойства мышц TA
1. Разминаться	4,0	150	0,2	300				Отдых мышцы в течение 60 секунд между каждым стимулом.
2. Оптимальная длина мышцы (Lo)	3,0, 4,0, 5,0, 6,0 и 7,0	1	0,2	300				Разрешить мышц, чтобы расслабиться в течение 30 секунд между каждым стимулом. Измерьте мышцы оптимальной длины с помощью цифровой суппорта.
3. CSA мышц TA								CSA = (мышечная масса (г) / [1,06 г / см 3 х (Lo х 0,6)]. 0.6 будет TA длины волокна мышц Lo РАТио.

Таблица 2. Параметры для оценки механических свойств EDL и TA мышц.

Напрягаться	Возраст (месяцев)	Масса тела (г)	EDL веса (мг)	EDL Lo (мм)	EDL CSA (мм 2)
BL10	6	32,03 ± 0,57	13,90 ± 0,77	14,09 ± 0,04	2,12 ± 0,12
MDX	6	35,44 ± 0,42 *	16,73 ± 0,42 *	13,93 ± 0,05 *	2,57 ± 0,07 *

Таблица 3. Морфометрические свойства EDL мышцы. *, Значение в MDх мышей значительно отличается от соответствующего возраста BL10 мышей.

Рисунок 1. Схема заказные платы рассечение мышь. Рассечение доска изготовлена ​​из ½ дюйма толщиной оргстекла и был изготовлен на институциональном магазин. Нажмите, чтобы увеличить показатель .

/>
Рисунок 2. Серия цифровых фотографий, иллюстрирующая этапы связывания двойной квадратный узел следуют петли узел на MTJ. Asterisk,EDL мышцы; Arrow, дистального сухожилия EDL мышцы.

/>
Рисунок 3. Схема заказные платформы для анализа на месте мышечной функции TA. Платформы оргстекла животных и держатель из нержавеющей стали колена были разработаны для установки на 809B на месте аппаратов мыши. *, Нержавеющей стальной стержень (Cat # MPR-2.0 , Siskiyou, Grants Pass, Орегон); # Универсальный держатель электрода (Cat # MXB, Siskiyou, Grants Pass, Орегон); §, стержень электрода вложения (Cat # MPR-3.0, Siskiyou, Grants Pass, Орегон); ** Sylgard блок. Нажмите, чтобы увеличить показатель .

/>
Рисунок 4. Представитель результаты для сократительной и пассивных свойств EDL мышцы. Сократительные свойства мышц EDL характеризуются удельной силы подергивания (A), удельная сила тетаническое (B), время до пика напряжения (C) и половину времени релаксации (D). Пассивного свойства EDL мышцы оценивали по профилю напряжения деформации (E) и ССР. * MDX мышей значительно отличается от соответствующего возраста BL10 мышей.

Обсуждение

В этом протоколе, мы проиллюстрировали физиологические тесты для измерения сократительной и пассивных свойств EDL мышцы и сократительные свойства мышц TA. Одной из основных проблем в мышцах исследования физиологии оксигенации целевой мышцы. Для больших мышц (например, мышцы TA), в местах подхода является предпочтительным, поскольку диффузия кислорода из буфера Рингера не может добраться до центра мышцы в анализе пробирке. На месте подход не нарушает нормального кровоснабжения и гипоксии связанного искусственных эффектов можно избежать. EDL мышцы является одним из наиболее часто используемых мышц в исследовании физиологии. Адекватной оксигенации всей мышцы может быть достигнуто в пробирке в системе из-за малого размера мышц. Кроме того, в системе пробирке обеспечивает закрытую среду для управления концентрацией ионов (Ca ^{2 +,} Na ⁺ и K ⁺⁾ и химическойКлиентские лицензии (АТФ и глюкозы), которые необходимы для оптимальной генерации силы мышц. Это дает прекрасную возможность для изучения влияния этих переменных на производстве силы.

Точное измерение сократительной и пассивные свойства мышц конечностей имеет решающее значение для изучения функции скелетных мышц. Характерные изменения этих свойств часто рассматриваются как признаки различных заболеваний мышц. Изменения в этих параметрах являются также важными показателями для определения экспериментальная терапия является эффективной или нет.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Материал	Производитель		Технические характеристики и комментарии
Tissue-ванночку	Radnoti LLC, Калифорния, США		Вода куртка ткань ванны (Cat # 158351-LL), кислород диспергатор трубки (Cat # 160192), Luer клапана (Cat # 120722)
Циркуляционный водяной бане	Fisher Scientific, Waltham, MA, USA
Газовой смеси	Airgas национального, Шарлотт, Северная Каролина, США		95% O 2 и 5% CO 2
В пробирке мышечного аппарата анализа функций	Aurora научных, Aurora, ON, Канада		Система состоит из стимулятора (Model # 701A), двухрежимные рычажной системы (Model # 300C и 305C), сигнал интерфейсом (модель № 604b) и тест APрат (модель № 800A) для вертикально установить ванну ткани органа
В пробирке мышцы программное обеспечение анализа функций			Динамические мышечного контроля (DMC) программного обеспечения и динамического мышечного контроля, анализа данных (DMA) программного обеспечения
Мышь анестезией коктейль, приготовленный в 0,9% NaCl	Обратитесь к институциональные рекомендации		Кетамин (25 мг / мл), ксилазина (2,5 мг / мл) и Ацепромазин (0,5 мг / мл). На протяжении хирургической процедуры, добавка 10% от начальной дозы может быть необходимо для поддержания животных под наркозом.
Sylgard	Инструмент Всемирного Precision	Cat # SYLG184
Заказные оргстекла рассечение платы	В доме предназначены		См. Рисунок 1
Отопление лампы	Тензорное Lighting Company,Бостон, Массачусетс, США		15 Вт лампы держать мышь теплым в течение диссекции
Рингер буфера	Химические вещества закупаются у Fisher Scientific, Waltham, MA, USA		Состав, мм: 1,2 NaH 2 PO 4 (Cat # S369), 1 MgSO 4 (Cat # M63), 4,83 KCl (Cat # P217), 137 NaCl (Cat # 217), 24 NaHCO 3 (Cat # S233), 2 CaCl 2 (Cat # C79) и 10 глюкозы (Cat # D16). Растворите химических веществ в отдельности и смешать в указанном выше порядке. Хранить при температуре 4 ° C.
Stereo рассекает микроскопом	Nikon, Мелвилл, Нью-Йорк, США
Dissection инструменты	Средства изобразительных наук, Foster City, CA, USA		Грубо щипцы, ножницы грубые, тонкие щипцы (прямые и под углом 45 °)
Плетеные шелковые шов # 4-0	SofSilk USSC сувания, Norwalk, CT, США	Cat # SP116
На заказ из нержавеющей стали крюк	Мелкие детали, Inc		2'' долго S / S 304V (0,18'' диаметре) для силовых преобразователей 305C или 2,5'' долго S / S 304V (0,012'' диаметре) для преобразователей 300C (Cat # ASTM A313)
На месте функции системы анализа мышц	Aurora научных, Aurora, ON, Канада		Система (809B, на месте аппаратов мыши) состоит из стимулятора (Model # 701B), двухрежимные рычажной системы (Model # 305C), сигнал интерфейсом (модель № 604A) и термо контролируемого аппарата подножку (модель № 809A )
В пробирке мышцы программное обеспечение анализа функций	Aurora научных, Aurora, ON, Канада		Динамические мышечного контроля (DMC) программного обеспечения и динамического мышечного контроля, анализа данных (DMA) программного обеспечения
Заказные TA анализ животного платформы	В доме предназначены		См. Рисунок 2
На заказ из нержавеющей стали крюк	Мелкие детали, Inc	Cat # ASTM A313	0.5'' долго S / S 304V (0,18'' диаметре)
Заказные 25G платиновыми электродами	Chalgren предприятий, Гилрой, Калифорния		Припой два 0,016'' толстые провода платины на два 24G электрических проводов