Генерация подкожного и Внутрипеченочный гепатоцеллюлярной карциномы человека ксенотрансплантатов в иммунодефицитных мышей

Резюме

Ксенотрансплантаты человека опухоли в иммунодефицитных мышей являются ценными инструментами для изучения биологии рака. Конкретные протоколы для генерации подкожные и внутрипеченочных ксенотрансплантаты из клеток гепатоцеллюлярной карциномы человека или фрагментов опухоли описаны. Регенерации печени при частичной резекции печени у мышей-реципиентов представлен в качестве стратегии содействия внутрипеченочный приживление.

Аннотация

В естественных условиях экспериментальные модели гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК), что воспроизводят человеческую болезнь обеспечивают ценную платформу для исследований в области патофизиологии заболеваний и для доклинической оценки новых методов лечения. Мы представляем различные методы для генерации подкожное или Ортотопическая человеком HCC ксенотрансплантаты в иммунодефицитных мышей, которые могли бы быть использованы в различных научно-исследовательских приложений. С акцентом на использовании первичной опухолевой ткани от пациентов, перенесших хирургическую резекцию в качестве отправной точки, мы описывают получение суспензии клеток или фрагментов опухоли для ксенотрансплантации. Мы опишем специфические методы, чтобы ксенотрансплантата эти ткани I) подкожно, или II) внутрипеченочно, либо путем непосредственного имплантации опухолевых клеток или фрагментов в печень, либо косвенно путем инъекции клеток в селезенке мыши. Мы также описывают применение частичной резекции родного печени мыши в момент ксенотрансплантации в качестве стратегиивызвать состояние активной регенерации печени у мышей получателя, которые могут облегчить внутрипеченочный приживление первичных опухолевых клеток человека. Ожидаемые результаты этих методов проиллюстрированы. Эти протоколы, описанные были проверены с использованием HCC образцы первичного человека и ксенотрансплантаты, которые обычно выполняют менее энергично, чем устоявшихся клеточных линий человеческого ГЦК, которые широко используются и часто цитируемых в литературе. По сравнению с клеточными линиями, мы обсудим факторы, которые могут способствовать относительно низкой случайно первичного приживления HCC в моделях ксенотрансплантации и комментировать по техническим вопросам, которые могут повлиять кинетики роста ксенотрансплантата. Мы также предлагаем методы, которые должны применяться для того, чтобы ксенотрансплантаты полученные точно напоминают родительские HCC тканей.

Введение

Гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК) является пятым наиболее распространенной формой рака в мире и наиболее быстро растет причиной смерти от рака в Северной Америке. Наиболее распространенным фактором риска для HCC является цирроз печени, наиболее часто встречающееся в связи с хроническими вирусными гепатитами, злоупотребления алкоголем, аутоиммунного заболевания, или наследственных метаболических нарушений ^1.

Несмотря на тяжелый бремени болезней, введенного ГЦК на популяции во всем мире, патофизиология ГЦК относительно мало изучены по сравнению с другими распространенных видов рака, таких как толстой кишки, молочной железы, или рак предстательной железы. Например, конкретные молекулярные и клеточные события вождения туморогенез остаются быть четко определены ^2. Как и большинство других твердых эпителиальных раков, геномные подходы выявили неоднородность в аберраций, связанных с ГЦК ^3. Ряд исследований показали, беспорядочную активность различных сигнальных путей, участвующих в пролиферации клеток, сюрВивал, дифференциация, и ангиогенез ^4. Кроме того, роль стволовых клеток рака в HCC патобиологии Остается выяснить ^5.

С ограниченным пониманием HCC патофизиологии, арсенал эффективных методов лечения ГЦК также остается относительно ограниченным. На ранних стадиях пациентов с опухолями, приуроченных к печени являются кандидатами на лечебной терапии с использованием абляции опухоли или хирургической резекции, хотя рецидивы является распространенным явлением. Для пациентов с более поздних стадиях заболевания, химиотерапия и радиация имеют ограниченную эффективность и используются в основном для борьбы с болезнями с паллиативной целью ^6.

Высокое качество в естественных экспериментальных моделях человеческого ГЦК таким образом обеспечить ценную платформу для очень необходимого фундаментальных исследований в патофизиологии человека ГЦК, а также для оценки новых терапевтических подходов. По сравнению с использованием клеточных линий или высоко определенных мышиных моделях, ксенотрансплантатов PRIMary опухоли человека в иммунодефицитных мышей появились в качестве ценных инструментов для таких исследований, так как они способны Резюмируя болезни человека с высокой точностью в то же время захвата гетерогенность, которая присутствует внутри и между разными пациентами ^7,8. С этой целью мы разработали различные методы, чтобы создать HCC ксенотрансплантаты человека в иммунодефицитных мышей. В то время как большинство опубликованных исследований с участием HCC ксенотрансплантаты описывают использование устоявшихся линий человеческого ГЦК клеток для этой цели, мы сосредоточились на оптимизации наших анализов для генерации ксенотрансплантаты из первичных образцов ГЦК, полученные сразу после хирургической резекции от пациентов.

Различные методы ксенотрансплантации могут потребоваться для различных исследовательских целей. Например, подкожные ксенотрансплантаты, полученные от фрагментов опухоли быстро генерируются, легко контролируются, и может быть более подходящим для местной администрации новой терапии с удобныммониторинг ответа опухоли. Внутрипеченочные ксенотрансплантаты могут быть более подходящими для исследований, касающихся роли печени микросреды в HCC биологии. Ксенотрансплантаты, полученные от суспензий опухолевых клеток необходимы для идентификации и характеризации опухолевых инициирующий подмножеств клеток или для экспериментов, требующих в манипуляциях пробирке опухолевых клеток до ксенотрансплантации. Таким образом, мы разработаны и утверждены следующие протоколы установить подкожное или внутрипеченочных ксенотрансплантаты из клеточных суспензий или фрагментов опухоли, полученных из первичных образцов человеческого ГЦК.

протокол

Схематическое обзор протокола представлена ​​на рисунке 1.

1. Обработка человека HCC образцов

Получить первичные образцы человеческой HCC с письменного согласия пациента и с одобрения институциональной этике научных исследований борту. Эти протоколы были проведены в нашем институте с одобрения Совета по Сети Здоровья Университета этике исследований с соблюдением всех институциональных, национальных и международных руководящих принципов для благосостояния человека.

Соберите свежие HCC образцы как можно скорее после хирургической процедуры, как только соответствующие образцы были приняты для клинических целей. В идеале это должно происходить в течение 30 минут после удаления ткани от пациента. Как показано на фиг.2, образец по крайней мере 1 см ^3, полученного из периферии опухоли является оптимальным, так как центральная часть опухоли может быть некротический.Опухоли, которые не получили никакого лечения до резекции таких как радиация, химиотерапия, или абляции являются предпочтительными для того, чтобы максимально увеличить вероятность того, что опухолевые клетки жизнеспособны. Ручка первичных тканей человека в соответствии со стандартными индивидуальной защиты протоколов для биологически опасными материалами. Выполните все лабораторные манипуляции опухолевых тканей и клеточных препаратов в области биобезопасности кабинета класс II с использованием асептических методов.

1. Поместите свежий образец HCC в 10-25 мл бессывороточную изменения F12 Дульбекко среду Игла / Хэм "с при 4 ° С и передать на льду в лабораторию для немедленной обработки и подготовки фрагменты и / или клеток ткани для ксенотрансплантации мышам.
2. Использование стерильного пинцета, поместить образец опухоли в 100 мм х 20 мм чашки Петри или другой подходящей стерильной рабочей поверхности. Разделите образец опухоли на фрагменты примерно 2-3 мм ³ с использованием No.10 хирургическое лезвие скальпеля. В этот момент, рассмотрим оснастки замораживания или формалином фиксации секоторые фрагменты опухоли для других экспериментов или анализ по мере необходимости.
3. Для ксенотрансплантации фрагментов опухоли, место некоторые фрагменты HCC в один или более микроцентрифужных пробирках, содержащих достаточно, чтобы позволить Матригель фрагменты оставаться под водой. Храните эти пробирки на лед.
4. Для приготовления суспензии опухолевых клеток, используют хирургическим скальпелем лезвие, чтобы фарш остающуюся HCC ткани в максимально возможной степени и смешать с 5-10 мл DMEM-F12 в 50 мл коническую пробирку в зависимости от объема фарша ткани.
5. Добавить коллагеназы типа IV и диспазу II в конечной концентрации 200 единиц / мл и 0,8 ед / мл соответственно. Пипетки смесь вверх и вниз с помощью хорошо 25 мл пипетки.
6. Уплотнение трубки и инкубировать смеси с шагом 1,6 при 37 ° С в инкубаторе с 5% углекислого газа в течение 30-60 мин в зависимости от мягкости опухолевой ткани. Внесите смесь вверх и вниз несколько раз каждые 10 мин, чтобы оценить ход ферментативного расщепления.
7. После диGestion завершена, проходят решение опухоли через 100 мкм клеток фильтра. Осторожно пюре оставшиеся ткани на клеточный фильтр с помощью пипетки на 25 мл, с тем чтобы максимальное количество опухолевых клеток, чтобы пройти. Соберите натянутые клеточной суспензии в 15 мл коническую трубку.
8. Центрифуга опухолевых клеток суспензии при 1200 оборотах в минуту в течение 5 минут при 4 ° С
9. Аккуратно слейте супернатант. В зависимости от размера гранул, добавляют 2-5 мл ледяной 1x эритроцита (RBC) буфера для лизиса и осторожно пипеткой вверх и вниз в ресуспендируют осадок. Держать на льду в течение 5 мин.
10. Добавить DMEM-F12 до общего объема 15 мл и центрифуге при 1000 оборотов в минуту в течение 5 мин при 4 ° С, чтобы смыть буфер для лизиса РБК.
11. Аккуратно слейте супернатант и ресуспендируют РБК-бесплатный осадок опухолевых клеток в DMEM-F12.
12. Подсчет жизнеспособных клеток с использованием трипанового синего либо вручную, либо с автоматизированной счетчика клеток.
13. Центрифуга клеток опухоли аликвоты, содержащие желаемый NumbeR клеток для инъекций, как описано выше, ресуспендируют в результате осадок клеток в 30 мкл охлажденного льдом Матригель, и хранить на льду.

Дополнительно: После этапа 1,11, мы обычно истощать CD45 +-клеток человека (лейкоцитов) из суспензии объемной опухолевых клеток и / или очистки подмножества опухолевых клеток с помощью проточной цитометрии или иммуномагнитные шарики. Подробные протоколы для этих методов хорошо описываются производителей соответствующих антител, бусы, и цитометров.

Примечание: протокол, описанный выше, также могут быть использованы для обработки ксенотрансплантатов опухоли человека у мышей, собранные для выполнения серийной трансплантацией, подставляя ксенотрансплантата ткани для первичного человеческого HCC ткани в стадии 1.1. В этой ситуации, после шага 1,11, мы обычно истощать проникновения мышиных клеток из клеточной суспензии с использованием антитела против мышиного антигена гистосовместимости H2k.

2.Ксенотрансплантации

Провести все процедуры животных в соответствии с протоколами, утвержденными институционального ухода за животными комитета. Процедуры, описанные здесь, были завершены в рамках конкретного использования животных протокола утвержденной Комитетом по университетской сети здравоохранения животных по в соответствии и с соблюдением всех соответствующих регулирующих и институциональных органов, иных нормативных документах.

Оборудование для доставки ингаляционных летучих анестетиков на мелких животных должны быть использованы в соответствии со стандартными операционными процедурами объекта животного и научно-исследовательского института. Выполняйте все хирургические процедуры с использованием асептических условиях и стерильные инструменты в шкафу биобезопасности класс II. Использование нетучных диабетической тяжелым комбинированным иммунодефицитом (NOD / SCID) или NOD / SCID / интерлейкин 2 рецепторов гамма-цепи нулевые (ГЯП) штаммы мышей обоего пола в возрасте 6-8 недель (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) ^9,10. Этимыши, должны быть размещены и поддерживаются в учреждении, способного обеспечить свободный патогенов условиях, подходящих для животных с иммунодефицитом.

Подготовка к операции мышей в камере подачи 5% (объем / объем) вдыхании изофлуран в 1 л / мин кислорода. Поддержание анестезии, пока не будет потеря роговицы и ног рефлекса у животного (ов). Для подкожного ксенотрансплантации, бриться один или несколько небольших участков на тыльной поверхности животным (и) и очистить кожу с 70% этанола. Для внутрипеченочного ксенотрансплантации, брить вентральной грудную клетку и живот животного (ы) от подмышечных впадин вниз к паховой области и очищения кожи с 70% этанола.

2.1 подкожной имплантации опухолевых фрагментов

1. Поместите наркозом мыши лежа, поддерживая ингаляционного изофлуран анестезии (2% (об / об) в 1 л / мин O ₂₎ с мундштуком. Применить слезоточивый гель для защиты глаз животного от травматического повреждения.
2. Стерилизовать бритая область (и) спинной бетадиномхирургическое скраб с последующим 70% этанола и, наконец, с повидон-йода.
3. Сделайте 5 мм разрез кожи с использованием стерильных острые ножницы.
4. Вставьте закрыт тупой ножницами аккуратно в подкожное пространство и распространять мягко разработать карман достаточно большой, чтобы вместить фрагмент опухоли.
5. Вставьте фрагмент опухоли, полученного на стадии 1.3 в подкожный карман с использованием стерильных тонкий пинцет.
6. Закрыть разрез кожи с помощью швов или клипы.
7. Обеспечить послеоперационный уход на мышь, как описано ниже.

2,2 Подкожное введение опухолевых клеток

1. Подготовка животных, как описано в шагах 2.1.1 и 2.1.2.
2. Загрузите подвеска опухолевых клеток в Матригель подготовленных на этапе 1.13 в инсулиновый шприц с 29 G 1/2 в иглу.
3. Вставьте иглу в подкожное пространство и выпуска содержимого шприца. Продвижение иглы на несколько миллиметров вдоль подкожной плоскости вдали птом к месту прокола кожи предотвращает утечку опухолевых клеток суспензии из места прокола при выводе иглы.
4. Обеспечить послеоперационный уход на мышь, как описано ниже.

2.3 Внутрипеченочный имплантации опухоли Фрагменты

1. Использование 27 G 1/2 в иглу на шприц емкостью 1 мл, управлять 350 мкл стерильного физиологического подкожно физиологический раствор в тыльной части шеи под наркозом животного, чтобы компенсировать интраоперационных потерь жидкости. Для обезболивания, администрирование 350 мкл стерильного физиологического солевого раствора, содержащего бупренорфина (0,1 мг / кг) подкожно в бок животного, используя 1/2-in иглу 27 G на 1 мл шприца.
2. Поместите на спине мыши на предварительно нагретой площадку с носа и рта, расположенного внутри мундштука, чтобы доставить Техническое обслуживание ингаляционного изофлураном анестезию (2% (объем / объем) в 1 Л / мин O _2).
3. Продлить конечности и закрепите их с лентой на рабочей поверхности для оптимизации экспозициибрюшной живота и грудной клетки.
4. Выполните процедуру под увеличительным лампы для оптимизации визуализации.
5. Стерилизовать бритая кожу на брюшной живота и грудной клетки с Betadine хирургической скраб с последующим 70% этанола и, наконец, с повидон-йода.
6. Использование стерильных острые ножницы, сделать поперечную двустороннего подреберье кожный разрез и разделить мышечные слои, чтобы войти в брюшную полость, чтобы позволить адекватную экспозицию всего печень.
7. Поставьте стежок в приведенном выше мечевидного отростка кожи и закрепить ее на мундштук с лентой для того, чтобы позволить лучше воздействия на печень и окружающих структур.
8. Используйте два хлопка наконечником аппликаторы смежные и кзади от печени, чтобы стабилизировать его.
9. Сделайте надрез 3 мм в длину и глубину на поверхности печени с помощью стерильного № 10 лезвие скальпеля.
10. Сразу обратиться Surgicel и мягкое давление на месте разреза для достижения гемостаза; удалить после 60-90 секи приступить только в случае полного гемостаза была достигнута.
11. Поставьте шаг фрагмент опухоли 1,3 в разрез печени с стерильных тонким пинцетом или с 18 G иглы.
12. Нанесите небольшое кусок Surgicel над разрез печени, чтобы предотвратить смещение фрагмента опухоли и обеспечить длительный срок гемостаза.
13. Закрыть разрез с швов или клипов.
14. Обеспечить послеоперационный уход, как описано ниже

2.4 Внутрипеченочный Имплантация опухолевых клеток с помощью Direct Injection в печень

1. Подготовьте мышь как описано в шагах 2.3.1 для 2.3.7 выше.
2. Загрузите опухолевых клеток суспензии (полученного на стадии 1,13) в инсулиновый шприц с помощью 29 G 1/2 в иглу.
3. С печень стабилизировалась использованием хлопка-аппликатор, вставьте инсулина иглу шприца в печень и продвигать кончик несколько миллиметров за пределами места прокола вдоль субкапсулярной плоскости.
4. Осторожно выпуска содержимого шприца и ткурица извлечь иглу из печени.
5. Место Surgicel над местом прокола и нежный давление ватным наконечником аппликатором, чтобы предотвратить утечку опухоли клеточной суспензии и для достижения полного гемостаза.
6. Закрыть разрез со швами или клипов и обеспечить послеоперационный уход, как описано ниже.

2.5 Внутрипеченочный ксенотрансплантации опухолевых клеток с помощью инъекций в селезенку

1. Подготовьте мышь как описано в шагах 2.3.1 для 2.3.5 выше.
2. Использование стерильных острые ножницы, сделать 1 см влево подреберье разрез ввести в брюшную полость.
3. Используйте ватный-наконечником аппликатором, чтобы отразить желудок краниально и правой стороны животного, чтобы разоблачить селезенку.
4. Обрабатывая окружающие жировые ткани стерильными мелких атравматических щипцов, доставить селезенку в разрез и поместить ватный-наконечником аппликатором за селезенки ее стабилизации.
5. Использование 5-0 шелковой нити, местосвободная предварительно связали узел вокруг выше нижнего полюса селезенки.
6. Загрузите опухолевых клеток суспензии (полученного на стадии 1,13) в инсулиновый шприц с помощью 29 G 1/2 в иглу.
7. Вставьте инсулина иглу шприца в нижнем полюсе селезенки и продвигать его мимо уровне рыхлой предварительно связали узел.
8. Медленно выпуска содержимого шприца, извлечь иглу из селезенки, и затянуть узел, чтобы предотвратить любую утечку введенного опухоли клеточной суспензии.
9. Заменить селезенки в брюшную полость.
10. Закрыть разрез со швами или клипов и обеспечить послеоперационный уход, как описано ниже.

2.6 частичной гепатэктомии об облегчении внутрипеченочных приживления человека опухолевой ткани

1. Подготовьте мышь как описано в шагах 2.3.1 для 2.3.7.
2. С стерильных острыми ножницами, разделите серповидной связки, прикрепленный к средней доли печени.
3. Использование хлопка наконечником аппликатором, мобилизоватьлевая доля печени и положение свободной предварительно связали узел 5-0 шелковой нити вокруг левой доли. Авансовые свободный узел как можно ближе к bilio-сосудистой ножки левой доли и затянуть узел.
4. Акцизный левой доли дистальнее лигатуры с использованием стерильных ножниц оставляя небольшой пенек, чтобы предотвратить проскальзывание узла и последующего кровотечения.
5. Использование подобную технику, перевязывать и резекцию большинство средней доли печени, избегая желчный пузырь.
6. Использование Surgicel и мягкое давление с ватным аппликатором вдоль разреза поверхности паренхимы печени для достижения полного гемостаза.
7. Для внутрипеченочного ксенотрансплантации фрагмента опухоли или опухолевых клеток, выполните шаги 2.3.8 для 2.3.11 или 2.4.2 в 2.4.5, как описано выше.
8. Для внутрипеченочного ксенотрансплантации опухолевых клеток через селезенки инъекций, используют ватные наконечником аппликаторы мягко отражают желудок краниально и правой стороны животного, изложениюнг селезенку. Продолжайте шагов 2.5.4 для 2.5.9, как описано выше.
9. Закрыть разрез со швами или клипов и обеспечить послеоперационный уход, как описано ниже.

2.7 Послеоперационный уход

1. Отключив мышь от ингаляционного наркоза мундштук.
2. Место мыши в клетке под инфракрасной лампой в течение примерно 20 минут, пока не оправилась от наркоза и мобилизации полностью.
3. Повторить дозу бупренорфина каждый на 8-12 часов работы в течение первых 2-3 дней после операции.

Результаты

Рисунок 3 демонстрирует типичный вид подкожного ксенотрансплантата человеческой HCC и соответствующего гистологического появления опухоли. Развитие и рост подкожных ксенотрансплантатов можно легко контролируется ежедневно экспертизы мышей-реципиентов. Временной интервал ...

Обсуждение

Мы описали различные методы, чтобы установить подкожное и внутрипеченочных человеческий HCC ксенотрансплантатов в иммунодефицитных мышей которые могут быть применены в самых разнообразных экспериментальных вопросов и анализов. В то время как подкожные ксенотрансплантаты были широк?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco’s Mod. Eagle Medium/Ham’s F12 50/50 Mix x1(DMEM-F12)	WISENT Bioproducts	319-075-CL
Collagenase TypeIV	Sigma-Aldrich	C5138
Dispase II	Stemcell Technologies	7923
Matrigel Matrix	Becton-Dickinson Biosciences	354234
10 % Buffered Formalin solution	Sigma-Aldrich	HT501128
0.9 % Saline Solution (NaCl), sterile	House Brand	1011-L8001
Betadine surgical scrub	Purdue Pharma	NPN 00158313
Buprenorphine (Temegesic) NR 0.3 mg/ml	Reckitt Benckiser
Isoflurane USP, 99.9 %, inhalation anesthetic	Pharmaceutical Partners of Canada Inc.	M60302
Tear-Gel	Novartis Pharmaceuticals
Frozen section compound	VWR	95057-838
Cryomold, Tissue -Tek	Sakura Finetek	4566
Precision Glide Needle 18G 1 ½	Becton-Dickinson Biosciences	305196
Precision Glide Needle 27G ½	Becton-Dickinson Biosciences	305109
Insulin syringe, 3/10 cc U-100, 29G½	Becton-Dickinson Biosciences	309301
Surgical blade No.10	Feather Safety Razor Co.	08-916-5A
#5-0 Soft silk surgical suture, 3/8" taper point needle	Syneture	VS-880
Transpore surgical tape	3M Health care	1577-1
Cotton applicator	Medpro	018-425
Surgicel, oxidized regenerated cellulose	Ethicon	1951
Cell strainer 100 μm nylon	Becton-Dickinson Biosciences	352360
Magnification lighting with mobile base	Benson medical Industries Inc.	model: RLM-CLT-120V
Petridish sterile 100x20 mm	Sarstedt	821474
Tissue forcep, 1x2 teeth, 4-1/2"	Almedic	A10-302
Adson dressing forcep 4-3/4"	Almedic	A10-220
Eye dressing forcep, serrated, straight, 4"	Almedic	A19-560
Hartman Hemostatic Forceps, curved, 3-1/2"	Almedic	A12-142
Iris scissor, curved, 4-1/4"	Almedic	A8-690
Iris scissor, straight, 4-1/2"	Almedic	A8-684
Olsen-Hegan needle driver, 5-1/2"	Almedic	A17-228