Быстрое и эффективное создание рекомбинантного человеческого плюрипотентных стволовых клеток с помощью рекомбинантному-опосредованной кассетные бирже в<em&gt; AAVS1</em&gt; Locus

Резюме

Мы сообщаем быстрый и эффективный способ редактирования гена , основанный на RMCE в AAVS1 локуса плюрипотентных стволовых клеток человека (hPSCs) , который усовершенствует ранее описанных системах. С помощью этого метода, изогенных линий могут быть быстро и надежно генерироваться для собственных сравнительных исследований, содействие Трансгенез-опосредованного исследования с hPSCs.

Аннотация

Даже с революцией генных таргетирования технологий во главе с CRISPR-cas9, генетической модификации человека плюрипотентных стволовых клеток (hPSCs) по - прежнему занимает много времени. Сравнительные исследования, которые используют рекомбинантные линии с трансгенов интегрированы в безопасной гавани локусов может извлечь выгоду из подходов, которые используют сайт-специфических целевых рекомбиназ, как Cre или FLPe, которые являются более быстрым и менее склонны к вне целевых эффектов. Такие способы были описаны, хотя они этого не делают значительно опережать ген таргетирования в большинстве аспектов. Использование нуклеазы цинка пальцами, ранее мы создали линию мастер - клеток в AAVS1 локус hPSCs , который содержит GFP-гигромицину тк , выражающую кассету, по бокам гетеротипичной последовательностей FRT. Здесь мы описываем процедуры для выполнения FLPe рекомбиназа-опосредованного обмена кассета (RMCE), используя эту строку. Мастер сELL линия трансфицируют вектором донора RMCE, который содержит пуромицин сопротивление без промотора, и с FLPe рекомбиназы. Применение как программы селекции положительный (Пуромицин) и отрицательные (ФИАУ) приводит к выбору RMCE без случайных интеграций. RMCE генерирует полностью охарактеризован плюрипотентных поликлональные трансгенные линии в 15 г с 100% эффективностью. Несмотря на недавно описал ограничения AAVS1 локуса, легкость системы прокладывает путь к HPSC трансгеноза в изогенных настройках, необходимо для проведения сравнительных исследований, а также позволяет полу-высокой пропускной способности генетические экраны для усиления / потери функционального анализа , который бы в противном случае отнимает много очень много времени.

Введение

Целенаправленное генома рекомбинации способствовало быстрое развитие во многих областях исследований. У мышей, синергия между редактирования генома и исследования стволовых клеток позволило добиться более глубокого понимания сложного механизма функции генов и регуляции генов. Такой прогресс, как ожидается, в человеческих плюрипотентных стволовых клеток (hPSCs), а также, хотя и в течение многих лет с момента первого выделения эмбриональных стволовых клеток человека (ЭСК), а затем и человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSCs), редактирование ген представляет собой технический барьер , Последние достижения в области генной инженерии с использованием целевых нуклеазы-цинковый палец нуклеаз (ZFNs), активатора транскрипции, как эффекторные нуклеазы (Talen) или кластерной регулярно interspaced короткий палиндромные повторы / CRISPR-ассоциированный белок 9 (CRISPR / cas9) позволили нам преодолеть эти трудности, делая целевой рекомбинации эффективный процесс ^{1 - 3.}

Удельная локусы в мУз генома , которые позволяют стабильную, надежную и повсеместное экспрессию трансгена в отсутствие побочных эффектов , таких как Rosa26, Hprt1 или COL1A1, стали важными инструментами в выполнении генетических исследований. Safe Harbor локусы позволяют сравнительный анализ между различными линиями мышей в изогенных контекстах. Это не может быть достигнуто с использованием стандартных методов случайной интеграции, которые связаны с известными ограничениями, как инсерционного мутагенеза, дозозависимое эффектов или пестрой экспрессии трансгена. Джин редактирования легкость и гибкость в безопасной гавани локусов увеличивается за счет использования конкретных участков целевых рекомбиназ как Cre или флиппазы (FLPe), которые специфически распознают последовательности-мишени (LoxP или FRT, соответственно) и катализируют эффективной рекомбинации между идентичными целям. Благодаря этим характеристикам, рекомбиназа-опосредованной редактирование гена с использованием LoxP или FRT последовательности в предварительно интегрированных безопасной гавани локусов является обычным инструментом, используемым в транс мышигенеза. В дополнение к вставке кассеты или иссечения опосредованного между идентичными последовательностями - мишенями, использование несовместимых LoxP или FRT сайтов позволяет рекомбинантному-опосредованный обмен кассеты (RMCE) ^4.

У человека, пытается определить безопасные локусы гавань проводились. Мышь ортологичными HPRT, несмотря на ассоциацию с Леша-Nyhan синдром с потерей функции и ROSA26 были направлены в hPSCs. HPRT сообщалось быстро заглушить экспрессию трансгена в ESC и, как ROSA26, его способность поддерживать экспрессию трансгена в терминально дифференцированных клеток не было исследовано ^{5 - 7.} Поскольку гомозиготные нулевая мутация гена CCR5 , как представляется, хорошо переносится в организме человека, его ценность в качестве безопасной гавани была оценена. CCR5 была направлена и сообщил , чтобы поддерживать стабильную экспрессию трансгенов в различных клеточных линиях человека, в том числе ESCs ^8,9. Однако,последняя не была доказана на клоновых уровне в течение долгосрочного культуры, и экспрессия вездесущи трансген не была продемонстрирована в дифференцированном потомстве трех зародышевых слоев. AAVS1, сайт естественная интеграция Адено связанного типа Вирус 2 (AAV), был протестирован в ЭСК , а также, из - за о резистентности к воздействию трансгенов глушителей ^10. Позже, многие группы использовали локус AAVS1 и описал стабильную экспрессию трансгенов в недифференцированных hPSCs, а также в их дифференцированное потомство всех трех зародышевых листков, как в пробирке и в естественных условиях ^2,8,11,12. Недавние результаты , тем не менее Nuance эти выводы, как было обнаружено , что локус AAVS1 оказывать переменное ингибирование трансгенов в пробирке в недифференцированных ЭСК и гепатоцитов потомстве ^13.

Дополнительные исследования скрининга с использованием случайных подходов и методов интеграции, чтобы определить единую интеграцию копирования с целью поиска Геномикрофонные сайтов интеграции , устойчивые к трансгенов глушителей в процессе расширения и дифференциации ^14,15 hPSCs. В целом, до сих пор ни один геномный сайт не был полностью подтверждено в качестве безопасной гавани в hPSCs и их потомству; идентификация соответствующего сайта для повсеместного стабильной экспрессии трансгенов, не только в hPSCs , но и в их потомстве дифференцированных в пробирке и в естественных условиях, еще предстоит решить. Среди всех изученных локусов и , несмотря на свою ограниченность, AAVS1 остается самым охарактеризован и наиболее часто используемых в исследованиях стволовых клеток.

RMCE была успешно проведена в hPSCs в некоторых из этих локусов ^6,7,14,16, используя в основном Cre рекомбиназу, даже если есть признаки того, что FLPe более эффективен , чем Cre ^17. Во всех этих случаях, один положительный кассета устойчивости к лекарственному средству была использована для отбора рекомбинантных колоний. Несмотря на успех, эти процедуры не представляют собой технический прогресс по сравнению со стандартными генноредактирования процедуры с использованием ZFNs, Таленс или CRISPR / cas9, как единый антибиотик процедура отбора не исключает случайных интеграций и требует скрининга колонии, чтобы правильно идентифицировать целевых клонов.

В этой процедуре, мы опишем методы для выполнения RMCE в hPSCs в на AAVS1 локуса с использованием комбинации положительных ( в пределах входящего кассеты) и отрицательный ( в пределах предварительно интегрированные кассеты) выборы , которые позволяют для генерации поликлональных трансгенных линий в ± 15 дней с КПД 100% и свободным от случайных событий интеграции. Таким образом, этот метод представляет собой прогресс за пределами описанных в настоящее время RMCE технологий в hPSCs.

протокол

1. Приготовление FRT-содержащих HPSC Мастер клеточной линии трансфекцию

1. Культура чЭСК / IPSC линии мастер - клеток при стандартных процедур или выключить инактивированных эмбриональных фибробластов мыши (КПКО) , с использованием чЭСК или отходящей среде без IPSC, соответственно (таблица 1). Подготовьте 2 (на фидерах) или 1 (фидерных свободных) скважин hPSCs в 6-луночный планшет для каждого экспериментального состояния.
2. Обратите внимание на культуру, и когда клетки достигают 60 - 70% слитности, плиты лекарственной устойчивостью КПКО (iDR4). В кратком изложении, пальто необходимые лунки 12-луночного планшета с 0,5 мл 0,1% раствора желатина и инкубируют в течение 5 мин при комнатной температуре. Тарелка 125000 iDR4s на лунку и инкубировать O / N с КПКО среды (таблица 1).

2. HPSC Трансфекция по Nucleofection

1. На следующий день, предварительно инкубировать чЭСК / IPSC культуры свежей средой, в том числе 10 мкМ Rho-ассоциированной протеинкиназа (ROCK) ингибитор (Y-27632), в течение 1 ч при 37 ° С. Nвнутр, принять решение чЭСК трансфекцию из холодильника предварительно нагреться до комнатной температуры.
2. Подготовка 1 мл nucleofection металлизации среды (таблица 1) на каждое условие nucleofection. Возьмите КПКО среду от лунки, промывают 1 мл PBS при комнатной температуре, и добавьте 500 мкл nucleofection металлизированный среды. Перенесите другие 500 мкл в стерильные 1,5 мл пробирки и хранить их при температуре 37 ° С до посева. Примечание: Типичный RMCE эксперимент состоит из трех различных условий с молекулярными соотношениями донора RMCE: pFLPe векторов 2: 0, 2: 1 и 0: 1.
3. Отделить чЭСК / IPSC в суспензии отдельных клеток.
   1. Взлет СМИ, промойте его 2 мл RT PBS и прибавляют 1 мл 0,05% трипсина или Accutase на фидерных или фидерных свободных HPSC культур, соответственно. Выдержите в течение 7 (трипсин), или и 2 - 5 (Accutase) мин при 37 ° С. Для лечения Accutase - клетки должны оставаться свободным, но прилагается.
   2. Осторожно снимите пластину из инкубатора и безllowing клетки для отсоединения, удалите диссоциации агента путем аспирации. Добавить 1 мл ЭСК СМИ и диссоциируются свободные клетки, осторожно промывке носитель на поверхности пластины, избегая пенообразования. Убедитесь в том, что клетки находятся в одной клеточной суспензии.
   3. Собирают клетки в чистой и стерильной 15 или 50 мл трубки. Промыть лунки 1 мл чЭСК сред и сбора клеток в том же 15 или 50 мл трубки. Возьмем 50 мкл аликвоты для подсчета (на следующем этапе) с помощью устройства подсчета клеток. Запишите объем сбора и подсчета общего количества клеток. Спин вниз клетки при 300 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре.
4. Ресуспендируют осадок клеток к суспензии 10 ⁶ клеток / мл с помощью PBS , используя 5 мл серологической пипеткой и осторожно пипеткой. Избегать образования пены. Передача 2 мл на условия эксперимента (примерно 2 х 10 ⁶ клеток) для очистки, стерильные 15 мл пробирок.
5. В то время как центрифугирование, предварительностричь в RMCE донорно pFLPe плазмид смешивает в максимальном объеме 10 мкл.
   1. Передача 2,5 мкг pFLPe (6,5 Кб) на чистую, стерильную 1,5 мл трубки. Добавление 2: молекулярное соотношение 1 вектора донора RMCE ¹³ к вектору pFLPe. Например, приблизительно 10 мкг вектора донора 12 Kb RMCE.
6. Продолжайте nucleofection, избегая пенообразования на всех этапах.
   Примечание: Некоторые протоколы трансфекции HPSC применить дополнительный КПКО шаг истощения перед шагом 2.4. Тем не менее, на практике, является КПКО незначительная часть клеток в суспензии отдельных, что существенно не меняет эффективность трансфекции, и не будет создавать контаминирующие рекомбинантные клетки, так как они не являются пролиферативная. Кроме того, очень важно, чтобы быстро переходить в процессе трансфекции для повышения жизнеспособности. По этим причинам, КПКО истощение не применяется.
   1. Снимите пластину iDR4 и 1,5 мл пробирки с металлизированный средойиз инкубатора. Одна трубка в то время, пипеткой от ФБС осторожно, не нарушая клеточный осадок. Удалить как можно больше. Ресуспендируют осадок 100 мкл раствора для трансфекции, осторожно пипеткой. Передача суспензии клеток в 1,5 мл пробирку, содержащую плазмидных смеси и осторожно перемешать.
   2. Перенести смесь клеток ДНК к transfector кювете, обращая внимание, чтобы не вводить пузырьков. Введем кювету в Nucleofector устройства и применять программу А13 (клетки, культивируемые на фидерах) или F16 (фидерных бесплатно).
      Примечание: Другие методы трансфекции или Nucleofector устройства могут потребовать оптимизации этих программ или условий трансфекции.
   3. Пересдача кювету и, используя одноразовые пипетки передачи имеющихся в наборе nucleofection, собирать его содержимое, применяя 0,5 мл гальванического среды и аспирационного весь объем. Провести этот шаг быстро, но мягко и в одно движение.
   4. Тарелка по каплям в 12-шELL пластину, содержащую iDR4 и 500 мкл среды металлизированный. Повторите шаги 2.6.1 - 2.6.4 для следующего условия эксперимента.
7. Место культуры блюдо на полку в инкубаторе и переместить его медленно взад и вперед и из стороны в сторону для равномерного распределения суспензии клеток. Инкубируйте в течение 24 ч до начала следующего изменения средств массовой информации, чтобы позволить клеткам восстанавливаться в присутствии 10 мкМ ингибитора ROCK (Y-27632).

3. Положительный и отрицательный отбор клеток Проходят RMCE

1. Изменение культуры средств массовой информации в день (1 мл / лунку) и 2 - 3 d после трансфекции, начните выделение с помощью 100 нг / мл пуромицин.
   Примечание: Оптимальные концентрации положительных и отрицательных реагентов отбора должны быть определены экспериментально для каждого вновь изготовленный мастер клеточной линии HPSC. Выполните ¹³ убийств кривую, используя линию клеток мастер , чтобы определить низкие дозы (концентрации , при которой минимальная визуальная токсичность проявляется после того, как 7d отбора, но культура не зарастает), оптимальная доза (самая низкая концентрация, при которой все клетки мертвы через 7 суток отбора), а также высокая доза (концентрация, которая вызвала явную токсичность, убивая всех клеток после 2 - 3 г) для обоих пуромицин и Fialuridine (ФИАУ).
   1. Аспирируйте среду чЭСК. Промыть 1 мл PBS. Добавить чЭСК среды с 100 нг / мл пуромицин.
2. Обратите внимание на рост клеток, так что смерть и рост сбалансированы. Изменение среды с пуромицин ежедневно, после шага 3.1.1. Когда скорость роста обгоняет гибель клеток, повышение концентрации пуромицин в блоках 25 - 50 нг / мл до максимум 250 нг / мл. Продолжить выбор пуромицин в течение 5 - 7 суток.
3. 3 - 4 d после начала выбора пуромицин, около 6 день после трансфекции, начните выделение с помощью 0,5 мкМ ФИАУ. Изменение средств массовой информации ежедневно и поддерживать ГАФИ не более 7 дней подряд.

4. Расширение и характеристика RMCE линий

После завершения выбора, вокруг D14 - 15, устойчивые к RMCE колонии присутствуют и составляют новую RMCE линию. Сплит навалом в соотношении 1: 2 в соответствии со стандартными процедурами (проход 1, P1).

Пластина 2 лунки 12-луночного планшета (включен или выключен фидеров, в зависимости от обычных условий культивирования исходной клеточной линии Master). Используйте одну скважину для дальнейшего расширения, хранения или экспериментальной установки (нет дополнительного описания этих процедур не делается в этом протоколе), а другой для определения характеристик.

Когда клетки из P1 готовы разделить, диссоциируют скважины для определения характеристик в суспензии отдельных клеток, как это описано в разделе 2.4 и сбора клеток в трубке 15 мл. Примечание: Используйте клетки из HPSC WT (без генетической модификации) и линии мастер-клеток в качестве отрицательного и положительного контроля, соответственно, для определения характеристик.

Спин вниз со скоростью 300 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре. Ресуспендируют в 1 мл PBS и разделить образец в двух для проточной цитометриии анализ ДНК ^13.

Анализ проточной цитометрией ¹³ (300 мкл):

1. Добавьте фетальной телячьей сыворотки к клеткам в PBS до конечной концентрации 5%. Передача клетки в чистую пробирку с FACS ячейки фильтра и держать их на льду.
   Примечание: Жизнеспособность клеток высока в этих условиях, так что это возможно, но не обязательно, использовать флуоресцентный краситель для нежизнеспособных клеток (например, 7-AAD или PI).
2. Немедленно приступить к анализу в проточном цитометре анализатор клеток и записывать 20000 - 30000 событий. Для анализа, установить ворота выше или GFP ТДТ фоне цветении с использованием образца отрицательного контроля WT.

Анализ ДНК ¹³ (700 мкл):

1. Перенести клетки в чистую 1,5 мл трубки. Спин вниз со скоростью 300 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре и аспирата супернатант. Перейдите к экстракции ДНК с использованием коммерческого набора и следовать инструкциям производителя. Хранить сухой осадок при -20 ° С в течение LatАнализ эр.

Измерение концентрации ДНК.

1. Подготовка стандартных ПЦР - реакций , в соответствии с условиями , на рисунке 3 и в таблице 2 ¹³ образцы подвергали электрофорезу PCR на агарозном геле 2% , содержащий 1x гель - ДНК пятна при 150 V в течение 15 - 25 мин.. Анализ проход анализатора геля.

Результаты

Использование AAVS1 ZNFs - специфических, полностью охарактеризованные линии клеток мастер чЭСК / IPSC , содержащие гетеротипические последовательности - мишени FRT были получены и описаны ^13. В FRT-содержащие линии мастер - клеток поддерживали плюрипотентности и целостность генома после лечения ZFN и стабильно выражается GFP в пробирке и в естественных условиях. RMCE осуществляется котрансфекции мастер клеточных линий с FLPe рекомбиназой и векторов доноров RMCE (Рис . 1А) RMCE векторы содержат идентичные последовательности FRT с теми , в клеточной линии мастер AAVS1 фланговых трансген Рисунок 1B контролирует RMCE с помощью конститутивно , выражающую ТДТ PZ:.. F3-P CAGGS tdTPH-F После трансфекции HPSC образуют небольшие группы клеток , равномерно распределенных по слой iDR4 MEF, и трансфицировали HPSC выражают как GFP, а также переходных ТДТ (рис 1B, D 2). Клетки могут восстановиться в течение 2 - 3d после трансфекции перед началом выбора. Положительный отбор впервые начал использовать низкую дозу пуромицин, чтобы способствовать введение доноров RMCE. Пуромицин применяется осторожно в начале, потому что начальная массивная гибель клеток может привести к одиночных клеток, подвергающихся рекомбинации, что делает их не в состоянии пережить процесс. В последующие дни концентрация пуромицин необходимо повысить ступенчато до оптимальной дозы, с тем чтобы рекомбинантные клетки расти в небольших колоний в то время как nonrecombined клетки постепенно умирают.

3 - 4 d после начала позитивной селекции (около 6 D после трансфекции), негативный отбор начинается для того, чтобы выбрать только для FRT-опосредованной рекомбинации. RMCE приводит к потере тимидинкиназы (ТК), ген самоубийства и, следовательно, чувствительность к Fialuridine (ФИАУ). Отрицательный отбор применяется в этой точке, в которой небольшие кластеры 2 - 4 GFP ^- / TDT ⁺ (RMCE) клеткиспособны выдерживать оптимальные концентрации ФИАУ (рис 1B, D 6), предотвращает случайное интеграцию, потому что в таких событиях, ген Тк в локус AAVS1 остается неизменным. Встречаемость одновременного FRT-опосредованной и случайной интеграции весьма маловероятно, о чем свидетельствует отсутствие случайных событий интеграции позже во время определения характеристик (Фигура 2В).

Приготовленный RMCE GFP ^- / ТДТ ⁺ колонии продолжают расти, в то время становится все более однородным, так что D 9 - 10 после трансфекции, некоторые не полностью выбранные смешанные RMCE колонии можно найти (рис 1B). GFP ^- / TDT ⁺ RMCE колонии присутствуют только тогда , когда оба RMCE донора и FLPe (2: 1) используются, в то время как RMCE не происходит при отсутствии FLPe (2: 0). Полный выбор с ФИАУ до 13 дня - 15 после трансфекции приводит к однородной GFP ^- / ⁺ ТДТ КУЛЬТУРАе. RMCE дает в среднем 12,8 ± 6,8 (n = 6) колоний Puro ^R / ГАФИ ^R в течение 15 дней ^13. Проточная цитометрия характеристики вновь сгенерированном RMCE линии (RMCE колонии Пуро ^R / ГАФИ ^R объединенные в неклональную популяции клеток) , подтверждает , что 100% клеток представляют RMCE GFP ^- / TDT ⁺ фенотип (фиг.2А). Когда RMCE доноры без конститутивной экспрессии флуоресцентного репортера используются, в результате Puro ^R / ГАФИ ^R RMCE HPSC линия однородно GFP ^-.

ПЦР характеристика неклональную RMCE линии демонстрирует полный кассетный обмен (отсутствие следов кассеты ведущей клеточной линии могут быть обнаружены) и что программа выбора используется для генерации случайных интеграции свободных линий (как донора RMCE и FLPe-выражения вектор) (Фигура 2В). Эти результаты были дополнительно подтверждена сouthern - блот и, кроме того, мы показали , что RMCE линии остаются плюрипотентные ^13. Это делает его больше нет необходимости не проводить либо геному оценку случайной интеграции или испытание плюрипотентности во время рутинных экспериментов RMCE. Таким образом, с использованием этого протокола, HPSC трансгенные клеточные линии в AAVS1 локуса , свободного от случайной интеграции может быть легко генерируется в 15 г с 100% -ной эффективностью и без необходимости экстенсивной характеристики.

Рисунок 1: Схема RMCE (A) Хронология программы селекции RMCE.. Слева: мастер-клеточная линия (MCL), укрывательство FRT-фланкирован кассету (треугольники), которые выражают GFP и гигромицину тк (связаны 2А саморасщепляющиеся пептидов), трансфицируют с помощью nucleofection (NF) с FLPe-выражающей вектора и вектор донор RMCE, ВГIch содержит ген пуромицин промотора сопротивления (сплайсинг акцептор - SA- Puro ^R) и переменную экспериментальную кассету (X). Справа: новая RMCE линия (RMCEL), полученный после завершения отбора с пуромицин (красный треугольник) и ФИАУ (синяя линия). (B) RMCE использованием конститутивный ТДТ-выражающую доноров и различные соотношения ДНК донора и FLPe ДНК (0: 1, 2: 1, 2: 0) отслеживается с помощью флуоресцентной микроскопии (GFP - зеленая флуоресценция, ТДТ - красная флуоресценция) при различных моменты времени. D 2 и 6: масштабные линейки представляют 100 мкм. D 10: масштабные линейки представляют 200 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рис . 2: Характеристика RMCE линий (А) Определение RMCE попроточной цитометрии. GFP и экспрессия ТДТ показан для WT линии, мастер - клеточная линия (MCL), и вновь генерироваться RMCE линия D 15 пост-nucleofection с использованием конститутивный ТДТ-экспрессионного вектора (CAGGS ТДТ), или доноры с GFP обусловлен GOOSECOID промотора (GSCP GFP, окончательное энтодермы маркер) или AAT промотор (APOeAATp GFP, гепатоцитов маркер). (B) Подтверждение RMCE (5 '/ 3' JA RMCEL), отсутствие мастер - клеточной линии в (MCL) кассета (5 '/ 3' JA MCL), а также отсутствие случайной интеграции (5 '/ 3' / FLPe RI ) с помощью ПЦР с использованием пары праймеров, изображенных. ДНК из WT, MCL, RMCE линии (1 - 5) были использованы, донор RMCE вектор (+ RI), FLPe вектор экспрессии, и никакого контроля шаблонов (NTC). Рисунок редактировался (Ordovas и др., 2015) ^13. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

в-странице = "1">
Рисунок 3. Генерация RMCE-подходит Мастер клеточной линии и сравнение Gene Targeting с RMCE в AAVS1 . Слева: Ген нацеливание использует неизмененные клетки WT, которые трансфицировали с донором (кассета , описанной на рисунке 1А для генерации мастер - клеточной линии , MCL) и специфические оптимизированные ZFNs. Процесс завершения полной характеристики занимает до 3-х месяцев. Справа: RMCE осуществляется котрансфекции донора с векторами FLPe, и полностью охарактеризован линия генерируется в 15 г. Эффективность ориентации генов в AAVS1 от предыдущих исследований , ^1,2. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

AYS "> СМИ Компоненты Конечная концентрация чЭСК среда DMEM-F12, HEPES 80% Сыворотка замена среднего 20% L-Глютамин 146 мг / мл MEM Non-незаменимых аминокислот Solution (100x) 1x 2-меркаптоэтанол 0,1 мМ Пенициллин / стрептомицин 0,1% Человек основного ФРФ 4 нг / мл питательная среда КПКО DMEM высокого уровня глюкозы Фетальной бычьей сыворотки (FBS), 15% Пенициллин-стрептомицина 0,1% L-глутамин 200 мМ 4 мМ MEM несущественных AminoКислоты Solution (100x) 2x 2-меркаптоэтанол 0,1 мМ Покрытие средней чЭСК среда 100% ингибитор ROCK (Y-27632) 10 мкМ

Таблица 1. Медиа состав.

анализ	Вперед		Задний ход		Amplicon	ПЦР цикл
5'JA MCL	CACTTTGAGCTCTACTGGCTTC		CGTTACTATGGGAACATACGTCA		1.1 Kb	95 ºC, 5 '- [95 ºC, 30' '- 68 ° С (-0,5 ° С / цикл), 1' 30 ''] X15 - [95 ° С, 30 '' - 58 ° С, 30 '' - 72 ° С, 1 '30' '] X25 - 72 ° С, 5'
3'JA MCL	TAACTGAAACACGGAAGGAG		AAGGCAGCCTGGTAGACA		1.4 Kb	95 ° С, 5 '- [95 ° С, 30' '- 68 ° С (-0,5 ° С / цикл), 1' 30 ''] X15 - [95 ° С, 30 '' - 58 ° С, 30 '' - 72 ° С, 1 '30' '] X25 - 72 ° С, 5'
5'JA RMCEL	CACTTTGAGCTCTACTGGCTTC		CATGTTAGAAGACTTCCTCTGC		1.1 Kb	95 ° С, 5 '- [95 ° С, 30' '- 68 ° С (-0,5 ° С / цикл), 1' 30 ''] X15 - [95 ° С, 30 '' - 58 ° С, 30 '' -72 ° С, 1 '30' '] X25 - 72 ° С, 5'
3'JA RMCEL	TTCACTGCATTCTAGTTGTGG		AAGGCAGCCTGGTAGACA		1,5 Кб	95 ° С, 5 '- [95 ° С, 30' '- 68 ° С (-0,5 ° С / цикл), 1' 30 ''] X15 - [95 ° С, 30 '' - 58 ° С, 30 '' - 72 ° С, 1 '30' '] X25 - 72 ° С, 5'
5'RI ДОНОРСКАЯ	GTACTTTGGGGTTGTCCAG		TTGTAAAACGACGGCCAG		0,5 Kb	95 ° С, 5 '- [95 ° С, 30' '- 60 ° С, 30' '- 72 ° С, 30' '] X25 - 72 ° С, 5'
3'RI ДОНОРСКАЯ	CCTGAGTTCTAACTTTGGCTC		ACACAGGAAACAGCTATGAC		0,5 Kb	95 ° С, 5 '- [95 ° С, 30' '- 60 ° С, 30' '- 72 ° С, 30' '] X25 - 72 ° С, 5'
RI FLPe	CCTAGCTACTTTCATCAATTGTG		GTATGCTTCCTTCAGCACTAC		0,65 Kb	95 ° С, 5 '- [95 ° С, 30' '- 60 ° С, 30' '- 72 ° С, 30' '] X25 - 72 ° С, 5'

Таблица 2. Наборы праймеров , используемые для ПЦР Генотипирование. Редактировался Ordovas и др., 2015 ^13.

Обсуждение

методы редактирования генов в безопасные гавани локусам остаются важным инструментом для разработки трансгенеза в hPSCs. Хотя безопасная гавань характер AAVS1 недавно была поставлена под сомнение в некоторых приложениях ^13,18, этот локус в настоящее время остается лучшим в характеризуется человеческих клеточных линий , полученных. Осознание своих ограничений в hPSCs может помочь получить достоверные данные. Поэтому AAVS1 по - прежнему ожидается, будет полезный сайт, например, для амплитудно и с потерей функции исследований или индуцируемого / конститутивной экспрессии факторов , которые требуют изогенных контекст внутри и между определенными генетическими фонов.

AAVS1 локус был мишенью многих групп с использованием ZFNs, Talen или CRISPR / cas9 ^1,2,19. Эти нуклеазы значительно повысить эффективность гомологической рекомбинации в определенном локусе. Тем не менее, процесс проверки и полностью характеризуют правильно ориентированные клоны, свободные от случайного INTEGрацион и для поддержания плюрипотентности и геном целостности может занять до 3 -х месяцев ( с использованием оптимизированных инструментов редактирования генов) (рисунок 3). Последние два могут быть вызваны возможных мутаций, порожденных нуклеазы активности за пределами целевой. Система RMCE используется здесь, однако, предлагает быстрый, эффективный и элегантный способ для достижения этой цели всего за две недели после того , как рекомбинантному конкретные целевые последовательности предварительно интегрированные в AAVS1 локуса. Использование положительного / отрицательного отбора и соответствующей программы отбора являются основными факторами , способствующими упрощения редактирования генов в локусе AAVS1 по RMCE.

Генотипическая характеристика новых трансгенных линий значительно снижается (не клоновая скрининг не требуется), а также характеристики, связанные с грязно-мишени нуклеазная активность оказывается необязательной из-за специфики FLPe для FRTS. Характеристика также может быть снижена в обычных экспериментах RMCE, демонстрируяполная потеря экспрессии GFP из мастер - клеточной линии (рис 2А), так как полная замена кассеты и отсутствие случайной интеграции уже достаточно продемонстрирована с помощью ПЦР (фиг.2В) и Саузерн - блот - ^13. Использование положительного / отрицательного отбора также составляет основную разницу с предыдущими отчетами. Несколько групп , которые ранее описанные RMCE в hPSCs, либо в AAVS1 или других локусах, использовали только один позитивный шаг выбора ^7,14,16. Это не представляет собой основные технические преимущества по сравнению с редактированием гена, выполняемой с нуклеаз, потому что скрининг колонии должен быть в равной степени выполняться для того, чтобы продемонстрировать правильную интеграцию и отсутствие случайной интеграции на клонального уровне.

Использование этой системы RMCE в нескольких чЭСК / IPSC линий требует preintegration описанного FRT-содержащего кассету в AAVS1 локуса каждой независимой линии. Тем не менее, как только генерируется,его быстрота и простота позволяет развивать полу высокую пропускную способность генетических экранов в определенных изогенных настроек для приложений, упомянутых выше, которые в противном случае были бы технически очень много времени. Кроме того, все векторы RMCE построены в векторе рЪ AAVS1 ген-таргетинга , используемый для целевой локус с ZFNs, но Таленс или CRISPR / cas9 были также зарегистрированы. двойственности RMCE вектора является весьма полезным для создания нескольких линий для определенного трансгена в hPSCs с или без FRT. Например, один удар продемонстрировал успех в определенном генетическом скрининге, проведенного RMCE в идеале должны были бы быть проверены в нескольких строках HPSC для подтверждения результатов. При отсутствии нескольких RMCE-пригодных линий клетки-хозяина, прямой ген нацеливание удара с использованием нуклеазы может быть выполнена. Полезность двойственного характера векторов RMCE было доказано нашей группой ^20. В этом исследовании, коррекция гена проводилась в пациенте полученныхЛобно - височная деменция (FTD) иПСК , которые несут мутацию вызывает PROGRANULIN (PGRN) выражение дефицита. Ген комплементационный по ZFNs-опосредованной вставки в AAVS1 локуса кассеты , что восстановленный PGRN уровней, исправлены дефектный фенотип в corticogenesis , связанной с наличием мутации. Кроме того, сопоставимое линия была сгенерирована с помощью RMCE в WT ЭСК для использования в качестве контроля для экзогенной PGRN выражения.

При отсутствии рекомбинантных колоний, проверить эффективность трансфекции вектора-донора RMCE. эффективность трансфекции, превосходящие 30% -ным выходом, результаты которого приведены выше. Снижение эффективности трансфекции уменьшают эффективность рекомбинации. И, наконец, система RMCE была сформирована в локусе AAVS1, но оно применимо к любым другим локусом.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
DR4 Mouse Embryonic Fibroblasts (MEF)	AMS bio	GSC-6204G	hPSC culture on feeers
CF-1 MEF, mitomycin-C treated	AMS Bio	GSC-6001M
EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution	Millipore	ES-006-B	iMEF plating
DMEM/F-12, HEPES	Gibco	31330-038
KnockOut Serum Replacement	Gibco	10828-028
L-Glutamine	Sigma Aldrich	G8540	For hESC medium
L-Glutamine 200 mM	Gibco	25030-081	For iMEF medium
2-Mercaptoethanol 50 mM	Gibco	31350-010
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)	Gibco	11140-035
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140122
Human basic FGF	Peprotech	100-18C
Y-27632 in Solution	VWR	688001-500
DMEM High Glucose	Gibco	41965-039
Fetal Bovine Serum	Sigma Aldrich	F7524
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Gibco	25300-054	hPSC culture on feeders
Matrigel hESC qualified	VWR	734-1440
mTeSR1 complete medium kit	Stem cell technologies	05850	For Feeder free culture
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent	Gibco	A1110501	For feeder free culture
Y-27632 in solution	VWR	56726
Human Stem Cell Nucleofector Kit 2	Lonza	VVPH-5022
Puromycine Dihydrochloride	Gibco	A11138-03
FIAU (Fialuridine)	ABX	2910
Hygromycin B	Sigma Aldrich	H3274
pFLPe			Modified to from pCAGGS-FLPe (MES4488, Open Biosystems) to remove puromycin
RMCE donors	-	-	Modified from pZ donor AAVS1 puromycin vector (PZD0020-1KT, Sigma Aldrich)13
5mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer	Falcon	352235
PureLink Genomic DNA kit	Invitrogen	K182001
GoTaq Flexi DNA Polymerase	Promega	M8298
Agarose	Sigma	A9539
SYBR Safe DNA Gel Stain	Invitrogen	S33102
Nucleofector 2b Device	Lonza (Amaxa)	AAB-1001
NucleoCounter NC-100	Chemometec	NC-100
BD FACS Canto	BD Biosciences	337175
NucleoCassette	Chemometec	941-0002