Высокая пропускная способность, в режиме реального времени, двойного считывания Тестирование внутриклеточного антимикробной активности и эукариотической клетки цитотоксичность

Резюме

A high throughput, real-time assay was developed to simultaneously identify (1) eukaryotic cell-penetrant antimicrobials targeting an intracellular bacterial pathogen, and (2) assess eukaryotic cell cytotoxicity. A variation on the same technology was thereafter combined with digital dispensing technology to enable facile, high-resolution, dose-response, and two- and three-dimensional synergy studies.

Аннотация

Традиционные меры внутриклеточного антимикробной активности и эукариотических клеток цитотоксичности полагаются на конечных анализов. Такие конечные точки анализы требуют несколько дополнительных экспериментальных шагов до начала считывания, такие как лизис клеток, определение элементарной колониеобразующих или добавления реагента. При выполнении тысячи анализов, например, во время высокопроизводительного скрининга, усилие вниз по течению, необходимое для этих типов анализов значительна. Поэтому, чтобы облегчить высокую пропускную способность противомикробное открытие, мы разработали анализ в режиме реального времени для одновременного идентификации ингибиторов внутриклеточного роста бактерий и оценки эукариотической клетки цитотоксичность. В частности, обнаружение внутриклеточный рост бактерий в режиме реального времени стало возможным благодаря маркировке бактериальных штаммов скрининга либо с бактериальным лк оперона (1 - ^е поколение) для анализа или флуоресцентный белок репортеров (2 - ^го поколения, ортогональным анализ). Нетоксичное, клеточная мембрана-impermeant, кислотно-связывающий краситель нуклеиновойТакже была добавлена ​​во время первичного инфицирования макрофагов. Эти красители исключаются из жизнеспособных клеток. Тем не менее, нежизнеспособные клетки-хозяева теряют целостность мембраны, разрешающий вход и флуоресцентного мечения ядерной ДНК (дезоксирибонуклеиновой кислоты). Следует отметить, что связывание с ДНК связано с большим увеличением флуоресцентного квантовым выходом, который обеспечивает считывание решение на основе гибели клетки-хозяина. Мы использовали этот комбинированный анализ для выполнения экран высокой пропускной способностью в формате микропланшетов, а также для оценки внутриклеточного роста и цитотоксичности с помощью микроскопии. Следует отметить, что противомикробные может демонстрировать синергизм в которых комбинированное действие двух или более антимикробных при применении вместе больше, чем при применении по отдельности. Тестирование на синергии в пробирке против внутриклеточных патогенов , как правило, чудовищный задача , как должна быть оценена комбинаторные перестановками антибиотиков при различных концентрациях. Тем не менее, мы обнаружили, что наши в режиме реального времени анализа в сочетании с автоматизированной, цифровой технологии раздаточного рermitted легкое тестирование синергии. Используя эти подходы, мы были в состоянии систематически обследовать действие большого числа одних антимикробных и в сочетании с внутриклеточным патогеном, легионелл.

Введение

Возбудители, которые растут или временно проживают в внутриклеточным трудно терапевтически искоренить. Облигатные или относительно облигатные внутриклеточные патогены , такие как легионелл, Coxiella burnetii, Brucella SPP. , Francisella tularensis и Mycobacterium SPP. часто требуют длительного курса антибактериальной терапии для лечения, которые могут варьироваться от нескольких месяцев до даже лет. Кроме того, внеклеточные патогены могут скоротечно занимают внутриклеточные ниши и таким образом избежать зазора обычными курсами антибактериальной терапии, а затем появляются, чтобы начать новые раунды вирулентных инфекции. Золотистый стафилококк ¹ и уропатогенные Enterobacteriaceae ^2,3 инфекции два все чаще признаются примеры. Таким образом, основной целью обнаружения наркотиков является выявление новых противомикробных препаратов, которые проникают во внутриклеточные отсеки. Оптимальная терапия быстро ликвидироватьвнутриклеточные микроорганизмы и предотвратить развитие резистентности через суб-ингибиторной антимикробного воздействия особенно желательно.

С этой целью мы разработали технологию высокопроизводительного скрининга для выявления внутриклеточных-пенетранта противомикробные препараты , нацеленные на внутриклеточный рост модели патогена, легионелл. ⁴ Предыдущие клинические наблюдения указывают на то, что стандартное тестирование чувствительность к антибиотикам не точно предсказать , в естественных условиях терапевтической эффективности против этого организма. ⁵ В частности, это произошло потому , что основные классы противомикробных , таких как бета-лактамов и аминогликозидов, хотя они весьма эффективны против axenically выращенного Legionella, не в достаточной степени проникают в внутриклеточные отсеки , где Legionella проживает. ^5,6 Впоследствии данные свидетельствуют о том, что технически более сложные анализы внутриклеточного роста эффективно предсказали клиническую эффективность. ⁷ К сожалению, эти анализы были чрезвычайно трудоемкие анализы конечных точек, требующих зараженных макрофаги, противомикробные препараты, чтобы быть лизируют в разное время точек для колониеобразующих единицы перечисления. Такие анализы являются непрактичными делать в больших масштабах и непригодны для обнаружения наркотиков с высокой пропускной способностью.

Таким образом, мы разработали технологию для определения в реальном времени внутриклеточного роста бактерий. ⁶ Это было достигнуто за счет использования бактериального штамма модифицированного путем интеграции либо бактериальной люциферазы оперон ⁸ (проба первого поколения, описанный ранее) ⁴ или флуоресцентный белок ⁹ репортеров (второго поколения, ортогональный анализе описано здесь) в бактериальную хромосому. Таким образом, люминесцентный или флуоресцентный сигнал обеспечивает заменяющим, в режиме реального времени отсчет бактериального числа.

Тем не менее, эти атрибуты не затрагивают основную confounder внутриклеточного infectioп анализы, вне цели воздействия на клетки-хозяева. В частности, гибель клетки-хозяина по своей сути ограничивает внутриклеточный рост и приводит к ложной положительной идентификации антимикробного эффекта. Поскольку многие соединения в библиотеках скрининга являются эукариотической клетки токсические, такие ложные срабатывания будут подавлять истинные противомикробные средства, что требует большого количества наблюдения, конечная точка цитотоксичности для разрешения.

Таким образом, это был большой интерес, чтобы быть в состоянии оценить жизнеспособность клеток эукариот и внутриклеточный рост одновременно. Следует отметить, что характеристика нежизнеспособных эукариотических клеток является потеря целостности клеточных мембран. Поэтому Зонды, которые проверяют проницаемость клеточной мембраны, могут быть использованы для оценки жизнеспособности клеток. Ранее мы охарактеризовали способность ряда предполагаемо клеточных мембран-impermeant, флуоресцентный, ДНК-связывающих красителей для доступа и окрашивает ядерную ДНК мертвых клеток. ⁴ При связывании ядерную ДНК, эти красители показывать значительное увеличение quantuм флуоресцентный выход приводит к увеличению сигнала над фоном раствора флуоресценции. Таким образом, эти красители при условии количественного считывания эукариотической клеточной гибели. ⁴ Следует отметить, что мы обнаружили , что некоторые были не токсичны сами по себе в течение длительного совместной инкубации с J774 макрофагами. При добавлении во время первичной инфекции, они обеспечили в режиме реального времени, флуоресцентный отсчет эукариотической клеточной смерти, которая может быть измерена с помощью микропланшет флуориметре или наблюдаемую микроскопически.

Таким образом, путем объединения использование бактериального репортера и нетоксичного, мембранная-impermeant, ДНК-связывающие красители, мы смогли разработать простой, неразрушающий, в режиме реального времени анализа для измерения как бактериальной нагрузки и эукариотической клетки цитотоксичность одновременно. Этот анализ позволил нам экран в 384-луночного формата пластины ~ 10000 известных биоактивных включая ~ 250 антимикробные и> 240000 малые молекулы с функционально неохарактеризованной активностью по способности ингибировать внутриклеточный ростЛегионелл, в то же время при создании эукариотических данных цитотоксичности для каждого соединения. ⁶ Наш анализ известных антимикробных против внутриклеточного роста легионелл был наиболее полное исследование этого типа на сегодняшний день. ⁶

На основе эффективности нашего формате анализа, мы также исследовали в дальнейшем потенциально синергетические эффекты известных антимикробных при использовании в комбинации. Одним из наиболее распространенных тестов синергии, так называемый шахматный анализ, Стандартно выполняется путем оценки комбинаторных эффектов двукратными серийными разведениями двух или более противомикробных препаратов. ¹⁰ В этих анализах, синергизм определяется наблюдением большего эффекта , когда два или более противомикробные препараты применяются вместе , чем сумма эффектов каждого применяемого отдельно. Следует отметить, что до сих пор, только целенаправленным и селективным тестирование синергии проводили против внутриклеточных легионелл из-за больших усилий, участвующих в традиционных конечных точек анализов, умноженное на комбинаторных перестановок требуется.

Для облегчения тестирования синергии, мы использовали наш реального времени внутриклеточного роста / эукариотической анализа на цитотоксичность в сочетании с автоматизированной цифровой технологией раздаточного ^6. Это автоматизации позволило нам обойтись серийных разведений соединений, растворенных в диметилсульфоксиде или в отдельности или в комбинации в виде 384-водного раствора. ¹¹ Кроме того, такая надежная технология жидкости обработка позволила нам легко выполнять более высокое разрешение, квадратного корня из двух (а не стандарт, более низкое разрешение, удвоение) комбинации разбавления для достижения более высоких уровней специфичности в нашем двумерная, в шахматном порядке синергии анализ. Это разрешение было особенно ценно в решении проблем в области синергии о воспроизводимости при использовании двукратном разбавлении серии ^12. И, наконец, наш анализ был количественным, а также TherEfore измеряется градаций торможения. В результате, анализ захватили полноту ингибиторной информации, экспрессируемый в isocontour isobolograms, в котором isocontours соединить комбинаторные концентрации с аналогичными уровнями ингибирования роста. ⁶ Эта стратегия позволила визуализировать построение комбинаторных кривых доза-ответ. Чтобы проиллюстрировать нашу методологию, мы описываем наш протокол для выполнения этих анализов и показывают репрезентативные результаты.

протокол

1. в реальном масштабе времени внутриклеточный роста и эукариотической клетки цитотоксичности

1. Подготовка клетки-хозяева (J774A.1 клетки)
   1. Культура J774A.1 Mus Musculus макрофагами , как клетки в суспензии в среде RPMI 1640 с 9% железа с добавкой сыворотки теленка. Первоначально канал в культуре ткани колбы. После того, как клетки становятся конфлюэнтными в 75 см ² культуре ткани колбу в 15 мл среды, разделить их скребком и разбавлением до 65 мл с тем же типом среды, из которых 15 мл возвращают в колбу с тканевой культурой и 50 мл переносят в 250 мл бактериальной шейкер колбу.
   2. Для расширения масштабов, культуры в суспензии в 250 мл и / или 1000 мл бактериальных колб, заполненных до одной пятой объема с тканевой культуральной среде. Аэрируйте путем установки скорости вращения при приблизительно 120 оборотов в минуту. Для последовательного роста, инкубировать ровно в 5% CO ₂ и 37 ° С.
   3. Урожай клетки , когда они достигают плотности в диапазоне 2,5 × 10 ⁶ клеток/ мл до 5 × 10 ⁶ клеток / мл. Убедитесь, что мертвый процент клеток (наиболее легко анализировали с помощью окрашивания трипановым синим) не превышает 25%, а мертвые клетки увеличат фоновый шум в цитотоксичности.
   4. Тарелка в белом цвете, культуре ткани лечение, 384-луночных микропланшетов при 5 × 10 ⁴ клеток J774A.1 в 30 мкл тканевой культуральной среде на лунку. Инкубируйте микропланшеты в течение ночи, чтобы достигнуть 90% сплошности на день эксперимента.
2. Подготовка люминесцентный или флуоресцентный легионелл
   1. Прохождение L. pneumophila (LP02 :: Flaa :: лк ⁸⁾ бактерии на соответствующей среде, то есть, буферный древесный уголь дрожжевой экстракт (BCYE) среды. При использовании тимидина ауксотрофного штамма, дополняют среду с 100 мкг / мл тимидина. Подготовить участки бактерий для экспериментов путем распространения организмов толстым слоем на новой BCYE пластине и инкубирования в один прекрасный день (если из предыдущей пластины прохода) или два-три дня (если из замороженной), чтобы получить сливающиесярост.
      1. Готовят BCYE пластины путем растворения 10 г дрожжевого экстракта, 10 г N - (2-ацетамидо) -2-аминоэтансульфоновая кислоты, 0,35 г K ₂ HPO _4, и 1 г одноосновного калия α-кетоглутарат в 950 мл деионизированной воды. Доведения рН до 6,9 с помощью гидроксида калия (≥2.5 мл 11,9 М раствора).
      2. Добавьте 15 г агара и 2 г активированного угля; и довести до 1 л конечного объема. Добавление магнитной мешалкой и автоклав. Охлаждающей среды до 55 ° С и добавляют стерилизованным фильтрацией растворов, содержащих 0,4 г L-цистеин и 0,42 г аммоний железа (III) цитрат, растворенный в деионизированной воде. Используйте магнит мешалка для смешивания перед заливкой чашек Петри.
      3. Для тестирования роста pneumophila L. в аксенными среде роста, готовят ACES-дрожжевой экстракт бульон (Айе) путем объединения всех химических реагентов , используемых для BCYE древесный уголь , за исключением и агар. Фильтр стерилизовать и использовать сразу или заморозить для дальнейших экспериментов.
   2. Ресуспендируют организмы в продая среда тканевой культуры использовали для J774A.1 клеток с 100 мкг / мл тимидина добавок в зависимости от обстоятельств.
3. Макрофаги инфекции
   1. Добавить представляющих интерес тестируемых соединений (скрининга соединений, а также положительный и отрицательный контроль для бактериального ингибирования роста и эукариотических клеток лизис). Предпочтительно, чтобы растворить маточные растворы при ≥500x в ДМСО (диметилсульфоксид), или водный раствор, чтобы обеспечить достаточное разбавление транспортного средства.
      1. Хотя исходные растворы можно хранить в замороженном виде, избежать циклов замораживания-оттаивания для лабильных соединений и противомикробных препаратов.
   2. Развести светящихся бактерий к мишенью 2,5 х 10 ⁶ КОЕ (колониеобразующих единица) / м и флуоресцентные репортерные-меченых бактерий до 1,0 × 10 ⁷ КОЕ / мл в тканевой культуральной среде , и добавить соответствующий нетоксичный, мембранно-impermeant, нуклеиновые кислоты- связывание красителя в 2.5x конечной концентрации для анализа.
   3. Добавьте 20 мкл смеси для каждой J774A.1 культуры хорошо, конечный объем анализа50 мкл, конечная концентрация бактериальной 1 × 10 ⁶ КОЕ / мл (люкс оперон репортер) или 4 х 10 10 ⁶ КОЕ / мл (флуоресцентный репортер белка).
   4. Инкубируют при 37 ° С в течение 1-3 дней в атмосфере 5% СО ₂ при 100% относительной влажности , чтобы предотвратить испарительные краевых эффектов.
4. Анализ счётчика
   1. Read бактериальный рост и токсичности эукариотической клетки на микропланшет-фотометр и флуориметре, применительно к репортерам используется.
      1. Для того, чтобы избежать температурных ассоциированных с краевыми эффектами, термически уравновешивания микропланшетов перед чтением люминесценции путем размещения в один слой на лабораторном столе с крышками приоткрыта в течение приблизительно 20 мин (или в кабинете биологической безопасности с крышками выключенном в течение примерно 10 мин).
   2. Возвращение микропланшетов в инкубатор, если в режиме реального времени считывания в более поздние моменты времени желательно.

Анализ 2. Данные

1. Нормализация данных в положительной и отрицательной кондля расчета управления установлен процент или Fold-торможение для внутриклеточного роста бактерий и процент цитотоксичности для эукариотических клеток.
2. Для оценки анализа надежности, расчета статистического разделения между положительным и отрицательным контролем как для бактериального ингибирования роста и цитотоксичности с использованием Z-фактор (Z ') анализа , где Z' = 1 - 3 (σ _р + σ _п) / | х _р + ц _п |. В этом уравнении, о _р и σ _п являются стандартные отклонения для положительных и отрицательных контрольных скважин, соответственно; μ _р и ц _п представляют собой средние значения для положительных и отрицательных контрольных лунок, соответственно.
   1. Для скрининга с высокой пропускной способностью, вычисления стандартных Z-баллы (или другой альтернативы, количественные статистические показатели) для оценки воздействия испытуемых соединений, представляющих интерес. В качестве альтернативы, рассчитать простую Наклоняемый сокращение или лог-кратное снижение как потенциально физиологически более актуальной мера эффекта величины для геометрически реплицирующимися бактерий.

3. Одно и многомерный (т.е. Synergy) доза-ответ Тестирование и интерпретация данных

1. Приготовьте макрофаги и бактерии, как описано в разделе 1 протокола.
2. Непосредственно перед инфекцией или аксенными инкубации, добавить противомикробные препараты экспериментального интереса к сериалу, удвоение серии разбавления, с целью Spanning на высоком конце концентрацию , которая полностью исключает рост (т.е. минимальная подавляющая концентрация или MIC) и низким положить конец концентрации, которая не проявляет никакой очевидной активностью.
3. Используйте автоматизированную систему обработки жидкости для облегчения однократную дозу-ответ и комбинаторной установку тестирования синергии путем прямого, автоматического добавления антимикробных разведениях в соответствии с протоколом производителя.
4. Рассмотрим использование суб-удвоенных разведений, например,841 / 54841eq1.jpg "/> - кратной серии разведений, и анализ размножается для повышения точности и воспроизводимости данных.
5. Для макрофагальной инфекции, разбавить люминесцирующие бактерии мишенью 2,5 × 10 ⁶ КОЕ (колониеобразующих единица) / мл в тканевой культуральной среде. Добавьте 20 мкл смеси для каждой культуры J774A.1, а конечный объем анализа 50 мкл, конечная концентрация 1 бактериальной х 10 ⁶ КОЕ / мл; и инкубировать при 37 ° С в 5% CO ₂ при 100% относительной влажности.
   1. Для аксенными испытаний на рост, разбавленные светящихся бактерий до конечной концентрации 1 × 10 ⁶ КОЕ / мл в среде AYE, добавляют по 50 мкл в каждую лунку 384-луночного планшета и инкубировать при 37 ° С в 5% CO ₂ при 100% относительной влажности.
6. Вычислить дробный индекс концентрации ингибитора для антимикробных комбинаций, которые ингибируют рост бактерий. Для каждого лекарственного средства в комбинации (а, б,.. П), что приводит к полному или> 99% ингибирования бактериального гrowth, рассчитать индивидуальную дробной подавляющей концентрации (FIC _{а, б, п...)} следующим образом : FIC _а = концентрация соединения "а" , разделенное на минимальной концентрации ингибитора "а" сам по себе. _, Используя ту же формулу, вычислить FIC _B, и т.д. Затем вычислить комбинаторный индекс FIC или FIC = FIC _а + FIC _B +. , .FIC _П для каждой тормозной комбинации.
   1. Используйте комбинаторный индекс, который отклоняется от 1,0 дальше всего для оценки эффекта синергии. Рассмотрим отсечку ≤0.5 как консервативную указанием синергетического эффекта и ≥4, эффект антагониста. ¹²
   2. Участок isobolograms, isocontour isobolograms, и / или изоповерхность isobolograms ⁶ в качестве альтернативных графических представлений комбинаторных эффектов.

Результаты

Микропланшетов внутриклеточный анализ роста

Рисунок 1 Схемы этапы анализа. Автоматизированные шаги, показанные могут быть выполнены вручную. Однако пропускная способность значительно облегчается с использованием жидких с?...

Обсуждение

Мы описываем анализы в режиме реального времени для одновременного обнаружения внутриклеточного роста бактерий и клетки-хозяина цитотоксичности. Есть несколько важных шагов в протоколе. Во-первых, для надежного проведения анализа, должно быть достаточным, спектральное разделение ме...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
J774A.1 cells	American Type Culture Collection	TIB-67	Host cell
ACES	Sigma-Aldrich	A9758	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Yeast extract, ultrafiltered	Becton-Dickinson/Difco	210929	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium; lower grades may cause impaired growth and/or alter sensitivity of Legionella to growth inhibitors
Alpha-ketoglutaric acid, monopotassium salt	Sigma-Aldrich	K2000	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P5280	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Potassium phosphate, dibasic	Thermo Fisher Scientific	P288-500	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
L-cysteine	Sigma-Aldrich	C-7755	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Ammonium iron(III) citrate	Sigma-Aldrich	F5879	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium; ferric pyrophosphate may be used instead but is more difficult to weigh accurately
Potassium hydroxide solution, concentrated	Thermo Fisher Scientific	SP236-500	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Deonized water	N/A	N/A	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Thymidine (tissue culture grade)	Sigma-Aldrich	T1895	For supplementing both RPMI 1640 and buffered yeast extract agar/medium — lower grade thymidine may be used for the latter, but may cause impaired cell growth and/or cell death in RPMI 1640
RPMI 1640, standard formulation	Corning via Thermo Fisher Scientific	10-040-CV	For growing J774A.1 cells prior to plating; includes 2 mM L-glutamine
RPMI 1640 lacking phenol red	Corning via Thermo Fisher Scientific	17-105-CV	For plating J774A.1 cells in 384 well dishes (not suitable for growth prior to plating); also lacks L-glutamine — supplement to 2 mM before use
L-glutamine, 200 mM in 0.85% NaCl (tissue culture grade)	HyClone via Thermo Fisher Scientific	SH30034.02	For supplementing RPMI 1640 lacking L-glutamine, to 2 mM final concentration
Iron-supplemented calf serum	Gemini Bioproducts	100-510	For supplementing RPMI 1640, to 9.1% final concentration
Trypan Blue solution	Sigma-Aldrich	T8154	For staining for J774A.1 cell death determination while counting cell density
SYTOX Green, 5 mM solution in DMSO	Thermo Fisher Scientific	S7020	For staining for J774A.1 cell death determination by fluorescence reading or epifluorescence microscopy (in conjunction with orange-red or far red fluorescent bacteria). Use at 125 nM final concentration.
Cell culture incubator	Thermo Fisher Scientific	13-255-26	For incubation of J774A.1 cells (both before and after infection); can also be used for incubation of bacteria, or a standard atmosphere incubator can be used instead)
Orbital shaker	BellCo Glass	7744-01010	For shaking incubation of J774A.1 cells before infection; fits inside cell culture incubator; includes shaker base 7744-01000 and tray 7740-01010 (these are also available separately)
Shaker flasks (250 ml)	ChemGlass Life Sciences	CLS-2038-04	For shaking incubation of J774A.1 cells before infection
Shaker clamps for flasks (250 ml)	BellCo Glass	7744-16250	For shaking incubation of J774A.1 cells before infection
Shaker flasks (1,000 ml)	ChemGlass Life Sciences	CLS-2038-07	For shaking incubation of J774A.1 cells before infection
Shaker clamps for flasks (1,000 ml)	BellCo Glass	7744-16100	For shaking incubation of J774A.1 cells before infection
Sponge foam caps for flasks (250 ml-1,000 ml)	ChemGlass Life Sciences	CLS-1490-038	For shaking incubation of J774A.1 cells before infection; reduces risk of contamination relative to standard metal caps
MultiDrop Combi programmable multichannel peristaltic pump	Thermo Fisher Scientific	5840300	For dispensing J774A.1 cells, medium, and bacterial suspension containing fluorophores to large numbers of 384 well dishes
Combi standard bore manifold	Thermo Fisher Scientific	24072670	Default predispense volume of 20 μl is insufficient to compensate for settling — increase to 80 μl
White 384 well dishes treated for tissue culture	Corning	3570	For reading luminescence and fluorescence; Greiner catalog # 781080 also tested successfully
DMSO (tissue culture grade, in sealed ampoules)	Sigma-Aldrich	D2650	For dissolving positive control and test compounds
Azithromycin	Sigma-Aldrich	PHR1088	Antibiotic positive control
Saponin (from Quillaja bark)	Sigma-Aldrich	S-4521	Cytoxicity positive control
Multichannel pipettor	Thermo Fisher Scientific	Finnpipette	For transfer of fixed amounts of positive control compounds; pipettor must have digital dispensing with detents to enable repetitive fixed volume dispensing
Epson pin transfer robot	Epson/ICCB-L	(Custom equipment)	For transfer of fixed amounts of test compounds from library arrays
D300 digital dispensing system	Hewlett-Packard via Tecan	D300	For transfer of variable amounts of test compounds ranging from 11 picoliters to 10 µl
T8+ cartridges for D300 digital dispensing system	Hewlett-Packard via Tecan	T8+	For dispensing test compounds
Epifluorescence microscope with computer-connected digital camera	Nikon	Ti	For live cell imaging; any standard fluorescent microscope can substitute, with phase contrast or DIC optics, capable of imaging green (fluorescein), orange-red to red (Texas Red), and far-red (Cy5) fluorescence, with 100X oil objective for highest resolution
Glass-bottom tissue culture dishes	MatTek Corporation	P35G-1.5-20-C	For live cell imaging. Dishes such as the MatTek allow microscopic visualization at 600X or 1,000X magnification through use of an inverted epifluorescent or confocal microscope.  These specific dishes are 3.5 cm nominal diameter, 3.3 cm inside diameter, with 20 mm diameter #1.5 thickness cover slips inserted into the bottoms.
Photoshop CS6	Adobe		Adobe photoshop or similar programs can be used to pseudocolor and merge light microscopic and fluorescent images.
Mathematica 10	Wolfam		For generation of two-dimensioonal isocontour isobolograms and three-dimensional surface isobolograms.