Быстрый и эффективный метод для того чтобы рассечь куколки крылья дрозофилы подходит для Immunodetections или анализы ПЦР

Резюме

Способность точно обнаруживать стенограммы или белков в тканях дрозофилы имеет решающее значение для изучения их изобилие и локализации, связанных с процессом развития. Вот описание простой процедуры для того чтобы рассечь куколки крылья. Эти крылья могут использоваться в качестве образцов в несколько приемов (иммуногистохимии, ПЦР анализа и т.д.).

Аннотация

Крыло развитие в Drosophila melanogaster является идеальной моделью для изучения морфогенеза на тканевом уровне. Эти придатках развиваются из группы клеток, названный крыло имагинальных дисков, сформированные в ходе эмбрионального развития. В личиночной стадии имагинальных дисков растут, увеличивая его количество клеток и формирования однослойное эпителиальных структур. Внутри куколки дела имагинальных дисков бутон и сложите в бислоев вдоль линии, которая становится будущее края крыла. В ходе этого процесса продольной primodia вен возникают Вены клетки на перспективных дорсальной и вентральной поверхности крыла. На стадии куколки полосы вен клеток каждой поверхности общаться с целью создания жесткой трубы; в то же время кросс вен начать их формирования.

С помощью соответствующих молекулярных маркеров это возможно для определения основных элементов, составляющих крыла во время его разработки. По этой причине способность точно обнаруживать стенограммы или белков в этой структуре имеет решающее значение для изучения их изобилие и локализации, связанных с процессом развития крыла.

Процедура описана здесь сосредоточена на манипулирование куколки крылья, предоставляя подробные инструкции о том, как анализировать крыло на стадии куколки. Рассечение куколки ткани сложнее, чем их коллеги в третьего возраста личинок. Вот почему этот подход был разработан, чтобы получить быстрое и эффективное высокое качество образцов. Подробная информация о том, как имунноконтраст и горе эти образцы крыло, чтобы позволить визуализации белки или клеточных компонентов, предоставляются в протоколе. С небольшим опытом можно собрать 8-10 высокое качество куколки крылья в короткий промежуток времени.

Введение

Дрозофилы крылья развиты из имагинальных дисков крыла. Изначального этих дисков крыла отложить в сторону во время эмбрионального развития как небольшие группы 20-30 имагинальных ячеек из эмбриональных эпителия инвагинировать. В то время как личинка растет на третий этап instar, митоз происходит в имагинальных клеток на конкретных характеристические времена, повышение его номера (около 50000 клетки) и формирования крыло диск^{1,2,3, 4}. Как клетки размножаются, они модные трубчатых эпителия, что приводит к самостоятельной раскладной компактный спираль. В ходе Окукливание эпителий диска Телескопы в виде двухслойной крыло и продольные Вены начать как пробелы между ними, которое происходит дважды в течение крыло развития^5,6.

Расположение вен всегда имеет идентичные шаблон; возможность легко определить все изменения в пределах вен образования делает мутации чрезвычайно видимым (например отсутствующие или лишние вен, изменения в духе позиции и т.д.). Интересно, что вариации фенотип обычно являются свидетельством мутаций в известных или Роман компонентов сигнальные пути, которые имеют отношение к развитию крыла. Одним из путей, которые играет определенную роль в определении положения и поддержания вен и intervein территорий является ежа (Hh) путь^6,,78.

Учитывая важность куколки крыла как модель системы, это будет важно для получения хорошего качества образцов для работы с. В прошлом ученые, которые опубликованы протоколы для того чтобы рассечь дрозофилы крылья не дали соответствующее руководство для достижения реальных образцов. Без руководства исследователь один нельзя четко визуализировать процесс. В этих альтернативных подходов рассечения куколки разделен на два, отделяя крыло от окружающих тканей и многократно промывают для удаления мусора. Такого рода подход претензий оставить бесплатно крыло загрязняет, но из-за предыдущего опыта процесс медленнее и выше вероятность компрометации структуру хрупких крылья⁹.

Процедуру, описанную здесь был разработан спроса найти быстрый и эффективный метод для получения образцов куколки крыла, подходящих для выявления специфических белков или стенограммы, протоколы immunodetection или полимеразной цепной реакции (ПЦР) анализов. Чтобы проиллюстрировать это, выражение и локализации заплата (Ptc или канонического рецептор Hh путь) обнаружен в образцах куколки крыла, обеспечивая протокол, который включает в себя соответствующие детали успешно провести полный процедура.

протокол

1 день

1. сбор и культивирования куколок.

1. Удалить 0 h после формирования puparium (АТФ) или prepupae, с помощью мокрой кистью из искусственного флаконов и поместить их в новые флаконы для почти полного периода развития (см. 2.1 и 2.2).
   Примечание: Здорового населения мух должна поддерживаться с помощью стандартных протоколов культивирования. После трех или четырех дней, в которые откладывает яйца взрослые могут быть удалены из флаконов для оптимальной разработки лиц. Они поддерживаются при постоянной температуре до третьего возраста личинок инициировать окукливание. Личинок/куколки переход характеризуется формирования prepupa, считается 0 h НФА. Prepupa является немобильные белые личинки, имеющий продолговатые, округлой формы с выступающим передней дыхальца.

День 2

2. Передача, рассечение и фиксации.

1. До передачи куколки (2 ч перед время разработки завершения) с кистью, микроскопа с двухсторонней ленты присоединились к нему. Расположите куколки в форме строки со спинной стороны, вверх и акушерский заканчивается лицом в одном направлении.
2. Возвращение микроскопа в постоянной температуры и позволяют куколок выполнить соответствующее время развития (т.е. 24-30 h НФА).
   Примечание: Микроскопа с двухсторонней ленты будет лицевой рассечение платформой для удаления куколки дела (см. ниже). Промежуток времени на микроскопа (вне флакона) помогает сухой куколки дело, что делает его легко разбиваемое пинцетом.
3. Удалите крышечки из куколки дела с помощью щипцов.
4. Сломать дело с щипцами (как показано в видео) делая линию вдоль стороны куколки в хвостовой конец его. С соответствующим освещением можно обнаружить внутреннюю форму куколки, делая очевидным пробелом чуть выше петли куколки крыла. Это место служит руководством для выполнения открытия без повреждения куколки.
5. Удаление части дела, поднимая их на открытые границы и проведение их на противоположной стороне, где двухсторонний скотч проведет их. В конце рассечение куколок будет почти «голый», только небольшой кусок этого дела будет охватывать задней оконечности.
   Примечание: Оставляя небольшое количество дела на верхнем конце хвостового предназначен для обеспечения гладкой освобождения от дела на слайд с двухсторонней ленты. Обоснование этого действия, это потому что если вы удалить слишком много дела вы значительно риск повреждения куколки. С другой стороны если вы удалите слишком мало, куколки не придет легко бесплатно дела.
6. Нажмите вниз (с щипцами) остальная часть дела. Это движение будет поднять переднего конца куколки, позволяя головы и грудной клетки, чтобы остаться в состоянии преференциального присоединиться и быть переданы на последующем шаге.
7. Возьмите новый слайд с двухсторонней ленты и инвертировать его куколки или строке куколок. Мы рекомендуем этот подход, наблюдая за движениями с помощью стереомикроскопом для предотвращения поломки куколок.
8. Слегка нажмите для куколок придерживаться ленты и мягко скользить слайд, чтобы удалить куколки от остальной части дела. Инвертировать микроскопа: куколок будет застрял на спинной стороне на уровне их головы / область грудной клетки.
9. Охватывают все голые куколки с параформальдегида 4% и подождите 10 минут. По нашему опыту этот промежуток времени с фиксатором помогает изменить последовательность кутикулы, делая его фирмы, менее липкой и простой в обращении.
   Примечание: Для выполнения извлечения рибонуклеиновой кислоты (РНК), замену параформальдегида для фосфат амортизированное saline (PBS) с РНКазы свободной воды и удалить куколки крылья, делая разрез (с помощью ножниц) вблизи шарнира точки каждого придаток. С помощью щипцов, куколки крыло передать microcentrifuge трубка с 1 мл раствора реагента Гуанидиновые тиоцианат и фенола. После сбора в общей сложности 50-80 крылья, Храните пробки microcentrifuge-80 ° c до выполнения РНК добыча^10,11.
10. Сделайте небольшой надрез в регионе петли крыла или вблизи него. Разрешить фиксатором для достижения крыло эпителия. Использование пипетки (p200) флеш фиксирующие над крылом. При промывке заменить загрязненных фиксировать с новым. После промывки, держите крыла в фиксатором для 5 мин.
    Примечание: Хотя этот маневр помогает очистить большинство загрязняющих ткани, некоторые hemocytes и тучные капельки могут оставаться в ловушке между дорсальной и вентральной эпителиального слоя крыла (см. рис. 1A).
11. Разрыв с щипцами от кутикулы границ (как показано в видео) расширение отверстие и включение выпуска крыло эпителия от кутикулы sac. Попав в ткани крыло, оставьте его в параформальдегида решение завершить 30 мин фиксации.
12. Передать один 4-навернулись пластиковые блюдо заполнены с PBST фиксированной крылья (Тритон X-100 0,05%). Магазин на ночь при 4 ° C.

День 3

3. основное антитело инкубации.

1. Разрушения тканей, инкубации куколки крылья в PBST (Тритон X-100 0,2%) за 15 мин, с использованием качания платформы для облегчения нежные жидкость среднего движения.
   Примечание: До монтажа образцов, шаги должны выполняться с помощью качания платформы.
2. Блокировать образцов, с помощью PBSTA (BSA 3%, Тритон X-100 0,1%) за 1 ч.
3. Используйте тот же буфер для разбавления основное антитело (мыши анти Ptc, 1: 100) и инкубировать куколки крылья на ночь при 4 ° C.

День 4

4. Вторичное антитело инкубации.

1. Мыть образцы 4 x 10 мин с PBST (Тритон X-100 0,05%)
2. Проинкубируйте с вторичных антител (например, анти мыши проспряганное флюрохром) разбавляют до соответствующей концентрации в PBSTA (BSA 3%, Тритон X-100 0,1%) в темноте, втечение 2 ч при комнатной температуре.
   Примечание: Если это уместно, используйте 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) и/или Фаллоидин к counterstain ткани. Добавьте эти зонды с вторичного антитела, принимая во внимание длина волны излучения флуорохромов для предотвращения дублирования сигналов.
3. Мыть образцы 4 x 10 мин с PBST (Тритон X-100 0,05%)

5. Монтаж

1. Подготовьте образец слайда, поставив 4 точек прозрачный лак на микроскопа, как если бы они были вершины квадрата.

Они будут точки, где будет лежать coverslips, помогая избегать дробления ткани.

Место 30 мкл монтажа СМИ (80% глицерина/трис-HCl) в центре площади точек, сделанные с лак без касатьться любой из углов (точек). Возьмите пипетку с желтой обрезанные кончиком, загрузить некоторые монтажные средства массовой информации, а затем обратить в нескольких куколки крылья.

Передача куколки крылья на точку монтажа СМИ на микроскопа. С помощью наконечника распространение СМИ монтажа и раковина куколки крылья, чтобы предотвратить их от плавающих. Морфология ткани будет храниться если крылья остаются плоскими, когда Стекло покровное помещается на. Перед установкой крышки стекла, удалите пузырьки воздуха.

Нижняя coverslip на образцы, пытаясь не допустить формирования пузырьков воздуха. Это движение может быть сделано с помощью щипцов.

Результаты

Протокол предоставляет простой метод для получения образцов куколки крыла, которые сохраняют знакомые морфология крыла. Из этих препаратов можно получить стеки изображений, которые могут быть спроектированы как 2-D и 3-D, для изучения распределения и/или обогащения бел...

Обсуждение

Метод вскрытия, описанные в этом видео может использоваться для подготовки образцов высокого качества дрозофилы куколки крыльев от развития различных этапов для многих типов методов (например, иммунофлюоресценции, синтез cDNA в анализы ПЦР, в пробирке крыло развития). С т?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stereomicroscope with cool light illumination	Nikon	SMZ1000
Rocking platform	Biometra (WT 16)	042-500
Microscope slides	StarFrost	8037/1
Cover glasses (24 x 32 mm)	Deltalab	D102432
Forceps	F.S.T	11252-00
Scissors	Lawton	63-1400
Multi-well plastic dish	Thermo Scientific	144444
p100 or p200 pipette	Finnpipette (Labsystems)	9400130
1X PBS (Dulbecco)	Gibco	21600-010
4% paraformaldehyde	Sigma	158127
Triton X-100	Sigma	T8787
BSA	Bio Basic INC.	9048-46-8
Glycerol	Mallinckrodt	5092
Tris	Amresco	497
TRIzol Reagent	Ambion	15596026
DEPC treated water	MO.BIO	17011-200
Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG (H+L), 2 mg/mL (working dilution 1/800)	Invitrogen	A11030
Monoclonal anti-Ptc (Apa-1) 54 μg/mL (working dilution 1/100)	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)		By Isabel Gerrero from DSHB under the auspices of the NICHD and maintained by The University of Iowa, Department of Biological Sciences, Iowa City, IA 52242.
DAPI, 1 mg/mL (working dilution 1/5000)	Invitrogen	62248
Phalloidin conjugated to Alexa 488, 300 U/1.5 mL methanol (1/600 working dilution)	Invitrogen	A12379
Canton S (fly stock)	Bloomington Drosophila Stock Center