번데기 날개 초파리 Immunodetections 또는 PCR 분석 실험에 적합의 해 부를 신속 하 고 효율적인 방법

요약

정확 하 게 초파리 조직에서 성적 증명서 또는 단백질을 감지 하는 능력은 그들의 풍부 및 지역화 프로세스와 관련 된 개발을 공부 하 고 중요 합니다. 여기에 번데기 날개를 해 부하는 간단한 프로시저의 설명이 이다. 이 날개는 몇 가지 기법 (immunohistochemistry, PCR 분석 결과, 등)에서 샘플으로 사용할 수 있습니다.

초록

초파리 melanogaster 의 날개 개발 조직 수준에서 morphogenesis 공부에 대 한 이상적인 모델입니다. 이러한 부속 라는 날개 imaginal 디스크 배아 발달 동안에 형성 하는 세포의 그룹에서 개발. 애벌레 단계에서 imaginal 디스크 성장, 세포의 수를 증가 하 고 monolayered 상피 구조를 형성. 번데기의 경우, 내부 imaginal 디스크 밖으로 새싹 되는 날개의 앞 여백 선 따라 bilayers에 접어. 이 과정 동안, 경도 primodia 정 맥 정 맥 셀 날개의 장래 등 쪽과 복 부 표면에 시작 됩니다. 번데기 단계에서 각 표면의 정 맥 세포의 줄무늬 꽉 튜브;를 생성 하기 위해 의사 소통 동시에 간 정 맥 그들의 형성을 시작합니다.

적절 한 분자 마커의 도움으로 개발 하는 동안 날개를 구성 하는 주요 요소를 식별 가능 하다. 이러한 이유로 정확 하 게이 구조에서 성적 증명서 또는 단백질을 감지 하는 능력은 그들의 풍요로 움과 날개의 개발 프로세스에 관련 된 지역화를 공부 하 고 중요 합니다.

절차는 여기 조작 번데기 날개, 날개를 해 부하는 번데기 단계에서 하는 방법에 자세한 지침을 제공에 초점을 맞추고 설명 합니다. 번데기 조직의 해 부 3 탈피 애벌레에 있는 그들의 대조 물 보다 수행 하기 위해 더 어렵습니다. 이 때문에이 이렇게 신속 하 고 효율적인 고품질 샘플을 얻기 위해, 개발 되었다. Immunostain 및 마운트 하는 방법의 세부 사항은 단백질 또는 세포 구성 요소, 시각화 수 있도록 이러한 날개 샘플 프로토콜에서 제공 됩니다. 작은 전문 그것 시간의 짧은 금액에 8-10 고품질 번데기 날개를 수집 가능 하다.

서문

초파리 날개 날개 imaginal 디스크에서 개발 된다. 이러한 날개 디스크의 원시 배아 상피에서 invaginate는 20-30 imaginal 셀의 작은 그룹으로 배아 개발 하는 동안 옆으로 배치 됩니다. 유 충 탈피 세 번째 단계로 성장 하는 동안 유사 분열에서에서 발생 합니다 imaginal 셀에 특정 특성의 숫자 (약 50000 셀)을 제기 하 고 날개를 형성 디스크^1,2,3, ⁴. 셀 확산, 그들은 패션 관 상피, 자동 접이식 소형 나선 결과. Pupation, 동안 디스크 상피 형태 2 층 날개 밖으로 망원경 그리고 경도 정 맥 시작 그들 사이 격차는 날개 발달^5,6동안 두 번 발생 합니다.

항상 혈관의 배치는 동일한 패턴; 쉽게 모든 변경 내에서 혈관 형성을 식별 하는 기능 돌연변이 매우 표시 (예: 누락 되거나 추가 정 맥, 정 맥의 위치, 등등에서 변화.) 합니다. 흥미롭게도, 표현 형 변이 일반적으로 신호 경로 날개 개발와 관련 된 알려진 또는 소설 구성에 돌연변이의 증거. 경로 위치를 결정 하 고 정 맥 및 intervein 영토를 유지 하는 역할을 수행 중 이다 Hedgehog (Hh) 통로^6,,78.

모델 시스템으로 번데기 날개의 중요성을 감안할 때, 그것은 함께 작동 하도록 좋은 품질 샘플을 얻기 위해 중요 한 됩니다. 과거에는, 날개 초파리 해 부 프로토콜 게시 과학자 하지 실행할 수 있는 샘플을 달성 하기 위해 적절 한 가이드를 주었을 합니다. 연구원의 지도 없이 하나 명확 하 게 과정을 시각화 수 없습니다. 이러한 대체 해 접근 번데기 2, 조직 주위에서 날개 분리 분할 이며 반복적으로 파편을 제거 하기 위하여 세척. 이런이 종류의 자유로운 날개를 두고 접근 주장의 오염 하지만 이전 경험 때문에 프로세스는 느린 고 연약한 날개⁹의 구조를 손상의 더 높은 기회가 있다.

여기에 설명 된 절차를 특정 단백질 또는 사본 immunodetection 프로토콜 또는 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 분석 실험을 사용 하 여 적합 한 번데기 날개 샘플 받는 신속 하 고 효율적인 방법을 찾을 수 수요에 의해 개발 되었다. 이 표현과 패치 (Ptc 또는 Hh 통로의 정식 수용 체)의 지역화를 설명 하기 위해 번데기 날개 샘플을 성공적으로 수행 완료 관련 세부 정보를 포함 하는 프로토콜을 제공에서 발견 되 절차입니다.

프로토콜

주 1

1. 수집 및 경작 번데기입니다.

1. Puparium 대형 (APF) 또는 교양된 튜브에서 젖은 페인트 브러시를 사용 하 여 prepupae 후 0 h를 제거 하 고 거의 완전 한 개발 기간에 새로운 튜브에 넣어 (2.1 및 2.2 참조).
   참고: 파리의 건강 한 인구 표준 자란 프로토콜을 사용 하 여 유지 되어야 합니다. 3 또는 4 일 후 달걀 누워 있다, 성인 개인의 최적의 개발 있도록 튜브에서 제거할 수 있습니다. 그들은 세 번째 탈피 애벌레 pupation 시작 될 때까지 일정 한 온도에서 유지 관리 됩니다. 애벌레/번데기 전환 0 h APF를 간주 하는 prepupa의 형성에 의해 표시 됩니다. prepupa 앞쪽 spiracles 튀어나온 모양 둥근 된 직사각형을 움직이지 흰 애벌레입니다.

주 2

2입니다. 양도, 해 부 및 고정입니다.

1. 칠하기 붓에 번데기 (2 h 개발 시간이 되기 전에 완료) 전송 더블 양면 테이프와 현미경 슬라이드를 준수. 등 쪽 측 및 두 부와 행 끝 같은 방향으로 향하게 하는 형태로 pupae를 놓습니다.
2. 일정 한 온도를 현미경 슬라이드를 반환 하 고 (즉, 24-30 h APF) 적절 한 개발 시간을 완료 하는 데 번데기를 허용.
   참고: 이중 양면 테이프와 현미경 슬라이드 번데기 케이스 (아래 참조)를 제거 하는 일시적인 절 개 플랫폼 될 것입니다. (유리병) 밖에 서 현미경 슬라이드에 시간 경과 집게와 쉽게 깨뜨릴 만들기 번데기 경우 건조에 도움이 됩니다.
3. operculum 집게를 사용 하 여 번데기 케이스에서 제거 합니다.
4. (비디오에서와 같이) 집게 경우 휴식 그것의 꼬리 끝에는 번데기의 측면을 따라 라인을 만들기. 적절 한 조명 분명 번데기 날개의 바로 위에 경첩 공간 만들기 번데기의 내부 형태를 검출 하기 위하여 가능 하다. 이 공간 번데기를 손상 없이 여 수행 하는 가이드 역할을 합니다.
5. 케이스, 열린된 국경에 의해 그들을 데리 고 이중 면 테이프 그들을 막을 것 이다 반대 측에 그들의 부분을 제거 합니다. 해 부의 끝에 번데기는 거의 "누드", 케이스의 단지 작은 조각을 후부 팁을 덮고 있을 것 이다 있을 것 이다.
   참고: 위 꼬리 끝에는 작은 양의 경우의 목적은 이중 양면 테이프와 함께 슬라이드에 사건에서 부드러운 릴리스 되도록. 이 작업 뒤에 이유는 때문에 너무 많이 제거 하면 경우의 수는 크게 번데기 손상 위험. 다른 한편으로 너무 작고, 제거 하면 번데기 쉽게 오지 않을 경우 무료.
6. 아래로 밀어 (겸 자)와 케이스의 나머지. 이 운동은 머리와 흉부 준수 하 고 다음 단계에서 전송 우선 위치에 번데기의 앞쪽 끝을 올릴 것 이다.
7. 더블 양면 테이프와 새 슬라이드 하 고 번데기 또는 pupae 행에 반전. 번데기의 파손을 방지 하기 위해 stereomicroscope의 도움으로 움직임을 관찰 하 여이 방법을 수행 하는 것이 좋습니다.
8. 약간 pupae 테이프에 충실 하 고 부드럽게 슬라이드의 경우 나머지에서 번데기를 제거 하려면 활강을 누릅니다. 현미경 슬라이드 반전: 번데기 수준 그들의 머리의 등 쪽에 붙어 있을 것입니다 / 가슴 지역.
9. 4 %paraformaldehyde 모든 벌 거 벗은 pupae를 커버 하 고 10 분을 기다립니다. 우리의 경험에는 정착 제와 시간이 경과 표 피 회사, 덜 끈 적 하 고 취급 하 게 쉬운 그것을 만들기의 일관성을 변경 수 있습니다.
   참고: Ribonucleic 산 (RNA) 추출을 수행 하려면 RNase와 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)에 대 한 대체 paraformaldehyde 물 무료 하 고 만드는 각 돌출부의 힌지 지점 근처 (가 위 만으로도) 컷 번데기 날개를 제거 합니다. Guanidinium 안산 및 페 놀 시 약의 1 mL microcentrifuge 튜브에 번데기 날개를 전송 집게를 사용 하 여. 50-80 날개의 총 수집 후 RNA 추출^10,11수행까지-80 ° C에서 microcentrifuge 튜브를 저장 합니다.
10. 작은 절 개를 경첩 지역에서 날개의 또는 근처를 확인 합니다. 정착 액 날개 상피에 도달 하실 수 있습니다. 날개에는 피 펫 (p200) 플러시 통을 사용 하 여. 홍 조 대체 하는 경우는 오염 된 흥분 시키는 새로운. 홍 조, 후 5 분 동안 정착 액에 날개를 유지.
    참고: 이 책략 오염 직물의 대다수를 멀리 맑게 하는 데 도움이, 비록 일부 hemocytes와 지방 방울 남아 있을 수 있다 날개의 등 쪽과 복 부 상피 층 사이 덫 ( 그림 1A참조).
11. (비디오에서와 같이) 표 피 테두리에서 집게로 눈물 구멍을 확대 하 고 표 피 sac에서 날개 상피의 릴리스를 사용. 일단 날개 조직 발표, 고정 30 분 완료 paraformaldehyde 솔루션에 둡니다.
12. 것을 PBST 4 던 플라스틱 접시 가득 고정된 날개를 전송 (Triton X-100 0.05%). 4 ° c.에 게 하룻밤

3 일

3. 1 차적인 항 체 외피입니다.

1. PBST에서 번데기 날개 잠복기 조직 permeabilize (Triton X-100 0.2%) 부드러운 액체 중간 움직임을 촉진 하기 위하여 락 플랫폼을 사용 하 여 15 분.
   참고: 샘플을 설치까지 단계 락 플랫폼을 사용 하 여 수행 한다.
2. PBSTA를 사용 하 여 샘플을 차단 (BSA 3%, Triton X-100 0.1%) 1 시간에 대 한.
3. 동일한 버퍼를 사용 하 여 1 차적인 항 체 (마우스 항-Ptc, 1: 100)를 희석 하 여 4 ° c.에 하룻밤 번데기 날개를 품 어

4 일

4. 이차 항 체 외피입니다.

1. 워시 샘플 4 x 10 분 각 PBST와 (Triton X-100 0.05%)
2. 이차 항 체 (예, 반대로 마우스에 형광 색소 활용 된)와 함께 품 어 PBSTA에 적절 한 농도를 희석 (BSA 3%, Triton X-100 0.1%) 2 시간에 대 한 어둠 속에서 실내 온도에.
   참고: 적절 한 경우 조직 counterstain를 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 및 phalloidin을 사용 합니다. 이차 항 체의 신호의 중복을 방지 하기 위해 형광 방출 파장을 고려와 함께이 프로브를 추가 합니다.
3. 워시 샘플 4 x 10 분 각 PBST와 (Triton X-100 0.05%)

5입니다. 장착

1. 마치 그들은 사각형의 꼭지점 현미경 슬라이드에 투명 한 매니큐어의 4 점 들을 배치 하 여 샘플 슬라이드를 준비 합니다.

포인트는 coverslips 나머지 것입니다 있을 것입니다 그들은 조직을 분쇄 방지 하는 데 도움.

미디어 (글리세롤/트리 스-HCl 80%)의 모서리 (점)을 건드리지 않고 매니큐어로 만든 점 들의 사각형의 중심에 장착의 장소 30 µ L. 노란 자른된 팁과 피 펫을가지고, 일부 설치 미디어를 로드 하 고 여러 번데기 날개에 그립니다.

현미경 슬라이드에 미디어를 마운트의 도트에 번데기 날개를 전송. 팁의 도움으로 설치 미디어를 확산 하 고 부동에서 그들을 방지 하기 위해 번데기 날개를 싱크 합니다. 커버 유리에 배치 되는 날개 평면 유지 하는 경우 조직의 형태를 유지 됩니다. 커버 유리를 배치 하기 전에 공기 방울을 제거 합니다.

기포의 생성을 방지 하려는 샘플에 coverslip 낮은. 이 움직임은 겸의 도움으로 할 수 있습니다.

결과

프로토콜에는 날개의 익숙한 형태를 유지 하는 번데기 날개 샘플을 얻기 위해 간단한 방법을 제공 합니다. 이 준비에서 2 차원 또는 3 차원 분포 및 날개의 분화 중 단백질의 농축 조사로 예상 될 수 있는 이미지의 더미를 얻을 수 있다. 유사한 프로토콜 수집 보완 deoxyribonucleic acid (cDNA), PCR 반응에 사용 된 서식 파일을 합성 하는 데 필요한 큰 번데기 날개 샘플 (관련 된 50-80 ...

토론

이 비디오에서 설명 하는 해 부의 방법은 다양 한 기법에 대 한 다른 개발 단계에서 초파리 번데기 날개의 높은 품질의 샘플을 준비 사용할 수 있습니다 (예를 들어, 면역 형광 검사, PCR 분석 실험, cDNA 합성 생체 외에서 개발 날개). 이 방법의 관점에서 관련 된 과학자 24-30 h APF를 사용 했습니다. 그러나 젊은 이상 번데기의 해 부에 필수적인 단계 내에서 아무런 장애물이 있어야...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stereomicroscope with cool light illumination	Nikon	SMZ1000
Rocking platform	Biometra (WT 16)	042-500
Microscope slides	StarFrost	8037/1
Cover glasses (24 x 32 mm)	Deltalab	D102432
Forceps	F.S.T	11252-00
Scissors	Lawton	63-1400
Multi-well plastic dish	Thermo Scientific	144444
p100 or p200 pipette	Finnpipette (Labsystems)	9400130
1X PBS (Dulbecco)	Gibco	21600-010
4% paraformaldehyde	Sigma	158127
Triton X-100	Sigma	T8787
BSA	Bio Basic INC.	9048-46-8
Glycerol	Mallinckrodt	5092
Tris	Amresco	497
TRIzol Reagent	Ambion	15596026
DEPC treated water	MO.BIO	17011-200
Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG (H+L), 2 mg/mL (working dilution 1/800)	Invitrogen	A11030
Monoclonal anti-Ptc (Apa-1) 54 μg/mL (working dilution 1/100)	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)		By Isabel Gerrero from DSHB under the auspices of the NICHD and maintained by The University of Iowa, Department of Biological Sciences, Iowa City, IA 52242.
DAPI, 1 mg/mL (working dilution 1/5000)	Invitrogen	62248
Phalloidin conjugated to Alexa 488, 300 U/1.5 mL methanol (1/600 working dilution)	Invitrogen	A12379
Canton S (fly stock)	Bloomington Drosophila Stock Center