Un metodo rapido ed efficiente per sezionare Pupal ali della drosofila adatto per Immunodetections o analisi di PCR

Riepilogo

La capacità di rilevare con precisione le trascrizioni o proteine nei tessuti della drosofila è fondamentale per lo studio della loro abbondanza e localizzazione relazionati al processo di sviluppo. Ecco la descrizione di una procedura semplice per dissecare pupale ali. Queste ali possono essere utilizzate come campioni in diverse tecniche (immunohistochemistry, analisi di PCR, ecc.).

Abstract

Lo sviluppo dell'ala in Drosophila melanogaster è un modello ideale per studiare la morfogenesi a livello del tessuto. Queste appendici si sviluppano da un gruppo di cellule che si chiamano dischi immaginali ala formate durante lo sviluppo embrionale. In stadi larvali si sviluppano i dischi immaginali, aumentando il numero delle cellule e formando strutture epiteliali monostrati. All'interno del caso pupal, i dischi immaginali bud fuori e piegare in doppii strati lungo una linea che diventa il futuro margine dell'ala. Durante questo processo, le vene longitudinali primodia provengono vena cellule sulle superfici dorsali e ventrali prospettica dell'ala. Durante la fase di pupa le strisce delle cellule della vena di ogni superficie comunicano al fine di generare tubi stretti; allo stesso tempo, la croce-vene iniziano la loro formazione.

Con l'aiuto di marcatori molecolari appropriati, è possibile identificare gli elementi principali che compongono l'ala durante il suo sviluppo. Per questo motivo, la capacità di rilevare con precisione le trascrizioni o proteine in questa struttura è fondamentale per lo studio della loro abbondanza e localizzazione relazionati al processo di sviluppo dell'ala.

La procedura qui descritta si concentra sulla manipolazione pupale Ali, fornendo istruzioni dettagliate su come sezionare l'ala durante la fase di pupa. La dissezione del tessuto pupal è più difficile da eseguire rispetto alle loro controparti in terzo instar larve. Ecco perché questo approccio è stato sviluppato, per ottenere campioni di alta qualità rapido ed efficiente. Dettagli di come immunostain e Monte questi esempi di ala, per consentire la visualizzazione delle proteine o dei componenti delle cellule, vengono forniti nel protocollo. Con poca esperienza è possibile raccogliere Ali pupal di alta qualità di 8-10 in un breve lasso di tempo.

Introduzione

Ali di Drosophila sono sviluppate dai dischi immaginali ala. La primordiale di questi dischi ala vengono messe da parte durante lo sviluppo embrionale come piccoli gruppi di 20-30 cellule immaginale che invaginano dall'epitelio embrionale. Mentre la larva cresce alla terza fase instar, mitosi si verifica nelle cellule immaginale in specifici momenti caratteristici alzando i suoi numeri (circa 50000 cellule) e formando l'ala disco^{1,2,3, 4}. Come le cellule proliferano, essi moda un epitelio tubulare, risultante in una spirale auto-pieghevole compatta. Durante impupamento, l'epitelio disco telescopi fuori all'ala forma i due strati e le vene longitudinali iniziare come lacune tra di loro, che si verifica due volte durante ala dello sviluppo^5,6.

La disposizione delle vene sempre ha un modello identico; la capacità di identificare facilmente ogni alterazione all'interno della formazione di vene rende mutazioni estremamente visibile (ad esempio mancanti o aggiuntivi vene, cambiamenti in vena posizioni, ecc.). Interessante, le variazioni di fenotipo sono solitamente le prove delle mutazioni nei componenti noti o romanzo di vie che sono rilevanti per lo sviluppo dell'ala di segnalazione. Una delle vie che svolge un ruolo nella determinazione della posizione e della manutenzione della vena e intervein territori è il pathway di Hedgehog (Hh)^6,7,8.

Data l'importanza dell'ala pupal come sistema modello, sarà importante ottenere campioni di buona qualità per lavorare con. In passato, gli scienziati che hanno pubblicato i protocolli per sezionare Drosophila Ali non hanno dato una guida appropriata per raggiungere campioni realizzabili. Senza la Guida di un ricercatore, uno non può visualizzare chiaramente il processo. In questi approcci alternativi per dissezione la pupa è divisa in due, separando l'ala dal tessuto circostante e ripetutamente lavata per rimuovere i detriti. Questo tipo di approccio sostiene di lasciare l'ala libera di contamina, ma a causa di precedenti esperienze il processo è più lento e c'è una maggiore probabilità di compromettere la struttura delle ali fragili⁹.

La procedura qui descritta è stata sviluppata dall'esigenza di trovare un metodo veloce ed efficiente per ottenere campioni di pupal ala adatti per rilevare specifiche proteine o trascrizioni utilizzando protocolli immunodetection o analisi di reazione a catena (PCR) della polimerasi. Per illustrare questo, l'espressione e la localizzazione di Patched (Ptc o il recettore canonico del pathway di Hh) viene rilevato in campioni di pupal ala, fornendo un protocollo che include dettagli rilevanti per svolgere con successo la completa procedura.

Protocollo

1 ° giorno

1. raccolta e coltura pupe.

1. 0 h dopo formazione pupario (APF) o membranose usando un pennello bagnato dai flaconcini colte e adagiatele in new fiale a quasi completa il periodo di sviluppo (Vedi 2.1 e 2.2).
   Nota: Una popolazione sana di mosche dovrebbe essere mantenuta utilizzando protocolli standard di coltura. Dopo tre o quattro giorni in cui le uova vengono deposte, gli adulti possono essere rimossi dai flaconcini per consentire uno sviluppo ottimale degli individui. Sono mantenute a temperatura costante fino a quando le larve instar terza avviare impupamento. La transizione larvale/pupa è contrassegnata dalla formazione di prepupa considerato il h 0 APF. La prepupa è una immobile larva bianca che ha un oblungo, di forma rotonda con sporgenti spiracoli anteriori.

2 ° giorno

2. il trasferimento, la dissezione e la fissazione.

1. Trasferimento alle pupe (2 h prima che il tempo di sviluppo completi) con un pennello, il vetrino da microscopio con nastro biadesivo aderito ad esso. Posizionare le pupe per formare che una riga con i lati dorsale alto e cefalica finisce rivolte nella stessa direzione.
2. Restituire il vetrino a temperatura costante e consentire le pupe completare il tempo di sviluppo appropriato (cioè 24-30 h APF).
   Nota: Il vetrino da microscopio con il nastro biadesivo sarà una piattaforma di dissezione transitoria per rimuovere il caso pupal (Vedi sotto). Il lasso di tempo sul vetrino da microscopio (fuori il flaconcino) aiuta ad per asciugare il caso pupal rendendolo facilmente frangibile con il forcipe.
3. Rimuovere l'opercolo dal caso pupal usando il forcipe.
4. Rompere il caso con il forcipe (come mostrato nel video) facendo una linea lungo il lato della pupa all'estremità caudale di esso. Con la giusta illuminazione è possibile rilevare la forma interna della pupa rendendo evidente uno spazio appena sopra la cerniera dell'ala pupal. Questo spazio funge da guida per eseguire l'apertura senza danneggiare la pupa.
5. Rimuovere le parti del caso, li raccolga fino al confine aperto e li trasportano verso il lato opposto, dove il nastro biadesivo li terrà. Alla fine della dissezione le pupe sarà quasi "nude", solo un piccolo pezzo del caso sarà che coprono la punta posteriore.
   Nota: Lo scopo di lasciare una piccola quantità di caso sull'estremità caudale superiore è quello di garantire un regolare rilascio dalla custodia il vetrino con il nastro biadesivo. Ragionamento alla base di questa azione è perché se si rimuove troppo del caso si notevolmente rischia di danneggiare la pupa. D'altra parte se si rimuove troppo poco, la pupa non facilmente verrà gratuita del caso.
6. Spingere verso il basso (con forcipe) il resto del caso. Questo movimento sarà sollevare l'estremità anteriore della pupa, consentendo sia la testa e il torace a rimanere in una posizione preferenziale di aderire e di essere trasferiti nel passaggio successivo.
7. Prendere una nuova diapositiva con nastro biadesivo e invertire la pupa o una riga di pupe. Si consiglia di eseguire questo approccio osservando i movimenti con l'aiuto dello stereomicroscopio per prevenire rotture delle pupe.
8. Premere leggermente per far le pupe attacchi al nastro e far scorrere delicatamente il vetrino al fine di rimuovere le pupe dal resto dei casi. Invertire il vetrino da microscopio: le pupe saranno bloccate dal lato dorsale a livello della loro testa / zona del torace.
9. Coprire tutte le pupe nude con paraformaldeide al 4% e attendere 10 min. Nella nostra esperienza, questo lasso di tempo con il fissativo aiuta a cambiare la consistenza della cuticola rendendola costante, meno appiccicoso e facile da gestire.
   Nota: Per eseguire l'estrazione di acido ribonucleico (RNA), paraformaldeide sostituto per tampone fosfato salino (PBS) realizzati con RNAsi libera acqua e rimuovere le ali pupale effettuando un taglio (con l'ausilio di forbici) vicino al punto di cerniera di ciascuna appendice. Usando il forcipe, trasferire l'ala pupal ad un tubo del microcentrifuge con 1 mL di reagente fenolo e tiocianato di guanidinium. Dopo aver raccolto un totale di 50-80 Ali, conservare il tubo del microcentrifuge a-80 ° C fino a eseguire il RNA estrazione^10,11.
10. Praticare una piccola incisione alla regione cerniera dell'ala o vicino ad esso. Consentire il fissativo raggiungere l'epitelio dell'ala. Utilizzando una pipetta (p200) a filo fissativa sopra l'ala. Quando lo svuotamento di sostituire i contaminati fissarsi con nuovi. Dopo il lavaggio, mantenere ala in fissativo per 5 min.
    Nota: Anche se questa manovra aiuta a sgombrare la maggior parte del tessuto contaminante, alcuni emociti e goccioline di grasso possono rimanere intrappolate tra gli strati epiteliali dorsali e ventrali dell'ala (Vedi Figura 1A).
11. Strappare con la pinzetta dai confini della cuticola (come mostrato nel video) espandendo il foro e consentire il rilascio dell'epitelio ala dal sac cuticola. Una volta rilasciato il tessuto di ala, lasciarlo nella soluzione di paraformaldeide per completare 30 min di fissazione.
12. Trasferire le ali fisse in un uno 4-saldata piatto di plastica riempito con PBST (Triton X-100 0,05%). Archivio durante la notte a 4 ° C.

3 ° giorno

3. incubazione primaria dell'anticorpo.

1. Permeabilize il tessuto incubando le ali pupale in PBST (Triton X-100 0,2%) per 15 min usando una piattaforma oscillante per facilitare un movimento medio liquido dolce.
   Nota: Fino al montaggio dei campioni, la procedura deve essere eseguita utilizzando una piattaforma a dondolo.
2. Bloccare i campioni utilizzando PBSTA (BSA 3%, Triton X-100 0,1%) per 1 h.
3. Utilizzare lo stesso buffer per diluire l'anticorpo primario (topo anti-Ptc, 1: 100) e incubare le ali pupale durante la notte a 4 ° C.

4 ° giorno

4. incubazione anticorpo secondario.

1. Lavaggio campioni 4 x 10 min ciascuno con PBST (Triton X-100 0,05%)
2. Incubare con anticorpo secondario (ad es., anti-topo coniugato al fluorocromo) diluita a concentrazione appropriata in PBSTA (BSA 3%, Triton X-100 0,1%) a temperatura ambiente al buio, per 2 h.
   Nota: Se è appropriato, è possibile utilizzare 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) e/o falloidina per colorante di contrasto del tessuto. Aggiungi queste sonde con l'anticorpo secondario tenendo conto della lunghezza d'onda di emissione dei fluorocromi per evitare la sovrapposizione dei segnali.
3. Lavaggio campioni 4 x 10 min ciascuno con PBST (Triton X-100 0,05%)

5. montaggio

1. Preparare un vetrino inserendo 4 puntini di smalto trasparente sul vetrino da microscopio come se fossero i vertici di un quadrato.

Essi saranno i punti dove riposerà i coprioggetti, contribuendo a evitare lo schiacciamento del tessuto.

Posto 30 µ l di montanti (glicerolo/Tris-HCl 80%) al centro della Piazza dei punti realizzati con smalto senza toccare uno qualsiasi degli angoli (puntini). Prendere una pipetta con una punta gialla ritagliata, caricare alcuni mezzi di montaggio e quindi disegnare in diverse ali pupale.

Trasferimento pupale Ali al puntino di supporti di montaggio sul vetrino da microscopio. Con l'aiuto di una punta, sviluppa i mezzi di montaggio e affondare le ali pupale per impedire loro di galleggiare. La morfologia del tessuto viene mantenuta se le ali restano piatte quando il vetro di copertura è posto su. Prima di mettere il vetro di copertura, è necessario rimuovere le bolle d'aria.

Abbassare il coprioggetto sui campioni cercando di evitare la generazione di bolle d'aria. Questo movimento può essere fatto con l'ausilio di pinze.

Risultati

Il protocollo offre un metodo semplice per ottenere campioni di pupal ala che conservano la morfologia familiare dell'ala. Da queste preparazioni è possibile ottenere gli stack di immagini che potrebbero essere proiettati all'esterno come 2D o 3D, per studiare la distribuzione e/o l'arricchimento di proteine durante la differenziazione dell'ala. Un protocollo simile (vedere la nota in 2.9) consente di raccogliere il campione di grande ala pupale (che coinvolge 50-80 pupal Ali) necessario...

Discussione

Il metodo della dissezione descritto in questo video può essere utilizzato per preparare campioni di alta qualità di Drosophila pupale ali dalle fasi differenti di sviluppo per molti tipi di tecniche (ad es., immunofluorescenza, sintesi di cDNA per analisi di PCR, in vitro sviluppo di ala). In termini di questo metodo lo scienziato coinvolto hanno usato 24-30 h APF. Tuttavia, non ci dovrebbe essere nessun ostacolo entro i passi essenziali nella dissezione di pupa più giovane o più anziani....

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stereomicroscope with cool light illumination	Nikon	SMZ1000
Rocking platform	Biometra (WT 16)	042-500
Microscope slides	StarFrost	8037/1
Cover glasses (24 x 32 mm)	Deltalab	D102432
Forceps	F.S.T	11252-00
Scissors	Lawton	63-1400
Multi-well plastic dish	Thermo Scientific	144444
p100 or p200 pipette	Finnpipette (Labsystems)	9400130
1X PBS (Dulbecco)	Gibco	21600-010
4% paraformaldehyde	Sigma	158127
Triton X-100	Sigma	T8787
BSA	Bio Basic INC.	9048-46-8
Glycerol	Mallinckrodt	5092
Tris	Amresco	497
TRIzol Reagent	Ambion	15596026
DEPC treated water	MO.BIO	17011-200
Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG (H+L), 2 mg/mL (working dilution 1/800)	Invitrogen	A11030
Monoclonal anti-Ptc (Apa-1) 54 μg/mL (working dilution 1/100)	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)		By Isabel Gerrero from DSHB under the auspices of the NICHD and maintained by The University of Iowa, Department of Biological Sciences, Iowa City, IA 52242.
DAPI, 1 mg/mL (working dilution 1/5000)	Invitrogen	62248
Phalloidin conjugated to Alexa 488, 300 U/1.5 mL methanol (1/600 working dilution)	Invitrogen	A12379
Canton S (fly stock)	Bloomington Drosophila Stock Center