JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Представлен протокол для количественного определения белка в сложных биологических жидкостей, с использованием технологии автоматизированного иммуно MALDI (iMALDI).

Аннотация

Масс-спектрометрия (МС) является одним из наиболее часто используемых технологий для количественной оценки белков в сложных проб, с отличным пробирного специфичности в результате прямого обнаружения соотношение массы и заряда каждой молекулы целевых. Однако на основе MS протеомики, как большинство других аналитических методов, имеет уклон в сторону измерения высоких изобилие аналитов, так это сложно добиться обнаружения ограничивает низкой нг/мл или ПГ/мл в сложных образцов и это является диапазон концентраций для многих болезни соответствующих белков в biofluids таких как человеческой плазмы. Для оказания помощи в обнаружении низкого изобилие аналитов, иммуно обогащение интегрирована в assay сконцентрироваться и очищают аналита перед МС измерение, значительно улучшая анализа чувствительности. В этой работе технология иммуно - Matrix-Assisted лазерной десорбции/ионизации (iMALDI) представлены для количественного определения белков и пептидов в biofluids, основанные на иммуно обогащение на бусы, следуют MALDI MS измерения без предварительного Элюирование. Антитела против пептида функционализированных на магнитные бусы и инкубировали с образцами. После мытья, бисер передаются непосредственно на пластину MALDI целевой, и сигналы измеряются MALDI-время полета (MALDI-TOF) документа после того, как матрица решение было применено к бисеру. Упрощается процедура подготовки образца, по сравнению с другими иммуно MS анализов, и измерение MALDI быстро. Подготовка всей выборки автоматизирован с жидкостью системы, обработки с улучшение пробирного воспроизводимость и высокую пропускную способность. В этой статье, iMALDI assay используется для определения пептид ангиотензин I (анг я) концентрация в плазме крови, которая клинически используется как индикация активности ренина плазмы для скрининга первичный гиперальдостеронизм (PA).

Введение

Масс-спектрометрия стала незаменимым инструментом в количественном протеомики. Масс-спектрометрия можно определить массы целевых белков и пептидов, поэтому полученные аналита сигналы могут быть весьма конкретными по сравнению с иммуноанализа. Два способа ионизации, электроспрей и MALDI, наиболее часто используются для определения белков и пептидов,1,2,3,4. Серьезной проблемой в количественной оценки на основе MS белка лежит в обнаружении низкого изобилие белков в сложных проб на нг/мл или ПГ/мл концентрация в присутствии высоких изобилие белков, и многие кандидат белковых биомаркеров в плазме крови человека в рамках этого диапазона5. Эта проблема во многом вызвано изначально широкий динамический диапазон и сложность человеческого протеома6.

Для преодоления этих проблем обнаружения, иммуно MS методы были разработаны для обогащения белков-мишеней или пептиды из примеров решений на прочную поверхность, следуют элюции аналитов и МС измерение7,8 , 9 , 10. через иммуно обогащение, аналитов очищаются от сложных образцов и таким образом к минимуму Ион подавление эффекты от других молекул. Среди различных твердых поддерживает, магнитные шарики в настоящее время наиболее широко используются как они имеют преимущества высокой антитела связывающая способность и простотой в обращении. Магнитные бусы с различными functionalizations и размеров разработаны и коммерциализации для иммунопреципитации экспериментов. На сегодняшний день, иммуно обогащение на бусины была сопряжена с электроспрей ионизации (ESI) и MALDI MS для измерения белков и пептидов. В стабильных изотопов стандартов и захвата анти пептида антитела (SISCAPA) технологии перевариваются белки в образцах, следуют инкубации с антителами бусины иммуно-обогащения. В «классических» SISCAPA захваченные proteotypic пептидов этого eluted из бисера и измеряется по жидкой хроматографии-ESI-мс (LC-MS), или путем прямого инфузии ESI-несколько реакции мониторинг-мс (ESI-мно-МС)11,12. Иммуно обогащение улучшена чувствительность пробирного управления записями сообщений по 3-4 порядка величины, достигнув диапазон низких нг/мл13.

По сравнению с электроспрей MS, MALDI MS быстрее и не включают очистки и восстановления сбалансированности LC столбцов так Есть никаких проблем загрязнения и уноса, что делает его более подходящим для высок объём исследований14. Иммуно-MALDI технология была разработана в нашей лаборатории объединить иммуно обогащения с MALDI MS для чувствительной и конкретной количественной оценки пептидов и белков (основанный на количественный proteotypic пептидов)15,16 ,17. После иммуно обогащение бисер залегают на плите целевой MALDI, матрица решение добавляется к бисеру и плита готова для анализа MALDI-TOF MS после высыхания. Элюирующий пептидов из бисера не выполняется как отдельный шаг, но сходство прыгните аналитов этого eluted путем решения матрицы MALDI когда он добавляется к шарик пятна, таким образом упрощая пробоподготовки и минимизации потерь образца. IMALDI технология применялась в различных приложениях18,19и недавно автоматизированных и используется для измерения ангиотензин I (анг я) для определения плазмы ренина активность (PRA)20. Этот протокол будет демонстрировать процедура, используемая для выполнения автоматизированных iMALDI assay. Принимая PRA assay как, например, CVs между день менее 10% были достигнуты благодаря автоматизации, с возможностью измерения 744 проб в день20.

Assay пра iMALDI, продемонстрировали в этой рукописи не требует переваривания белка, как молекулы целевых (анг я) – это пептид с молекулярной массой 1295.7 да. В других анализов, где необходима переваривания белка и пептид используется как суррогат для интактных белков выбранный пептидные для iMALDI должны быть уникальными и специфическими для целевого белка, с массой более 800 да так что она может быть легко отличить от c химический шум от решения матрицы MALDI. Анти пептида антитела необходимы для иммуно обогащение пептидов. Протокол для измерения пра iMALDI assay состоит из четырех этапов: 1) поколение Анг I в плазме крови человека; 2) иммуно обогащение анг я использую бисер антителами; 3) передача Бусы MALDI целевой пластины и Добавление матрицы решения; и 4) сигнал приобретение MALDI-TOF-MS и данных анализа20.

протокол

количество реагентов, описанные ниже основывается на измерении 20 образцов пациента плазмы. Протокол представлена ниже следующим образом руководство Университета Виктории ' Комитет по этике исследований человеческого ф.

1. поколение Анг I в плазме крови человека

  1. оттепель образцы плазмы (≥ 200 мкл) в комнате ванна на 5 мин температуры воды, а затем поместить образцы на льду до тех пор, пока полностью разморожен.
  2. Перевести 200 мкл каждого плазмы образца вручную, чтобы отделить скважин 1.1 мл штанхглубинных плиты (образец плита) и центрифуги пластину в центрифуге для 10 мин на 2 ° C и 1278 x g.
  3. Использовать автоматизированные жидкость, системы обработки серийно разбавить 500 фмоль/мкл Анг I NAT стандартное решение подготовить шесть решений калибратор с курицей яичный альбумин (0,1, 0,2, 0,6, 1.9, 5.7, 17.2 фмоль/мкл).
  4. Пипетку 200 мкл каждого калибратора хорошо и 125 мкл поколения буфер образца пластины.
    Примечание: CEWA в фосфат буферизации физраствора (PBS) буфера необходимо свежеприготовленные на день эксперимента.
  5. С помощью автоматизированных жидкости, системы обработки, в новой пластинкой смесь 125 мкл плазмы супернатанта или 125 мкл CEWA в PBS с 25 мкл анг я поколения буфер, который содержит 1 М трис, 0,2 мм Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) и 1 мм phenylmethylsulfonyl фторид (PMSF).
    Примечание: Подготовьте анг я поколения буфера путем смешивания 1 М трис/0,2 мм ЭДТА водный буфера (приспособиться к рН 5,5 с использованием уксусной кислоты) и решение PMSF (100 мм в метаноле). Оба решения может храниться до 1 месяца на 4 ° C. смесь двух решений на день эксперимента.
  6. Автоматически перевести решения в 96-луночных плита, 3 реплицирует каждого решения, 34 мкл в колодец. Инкубировать пластины при 37 ° C для 3 х.

2. Иммуно обогащение анг я антителами используя бусы

  1. спряжение антител на магнитные бусы белок G
    Примечание: спряжение антитела с бисером производится вручную в течение 3 ч анг я поколения период на день эксперимента. Для других аналитов конъюгированных бусины могли бы храниться в PBS буфер, содержащий 0,015% ПАРНЕЙ (PBSC) при 4 ° C на три месяца или дольше, в зависимости от свойств и стабильности антитела.
    1. Передачи 110 мкл суспензии из бисера (достаточно для измерения 20 образцов и приготовления калибровочной кривой 6-точка) в 1,5 мл трубку. Вымойте бусины семь раз с 1 мл 25% Ацетонитрил/PBSC и три раза с 1 мл раствора PBSC. Использование магнитного стенд для пеллет бусы между каждым шагом стиральная. Удаление буфера мыть после последнего Вашингтон
      Примечание: Стирка 7 раз с 25% Ацетонитрил/PBSC имеет решающее значение для удаления MS-несовместимые добавок в шарик шлама, таких как Tween-20. Если есть нет таких добавок в выбранном бусы, этот шаг обширные Стиральная не может быть необходимым.
    2. Ресуспензируйте бисер в 110 мкл PBSC и 110 мкл анти анг я антитела (концентрация окончательный антитела: 100 мкг/мл). Смешать бусы и решения, закупорить и инкубировать их при комнатной температуре в течение 1 ч, вращающихся на 8 об/мин.
    3. Мыть бисер 3 раза с 1 мл раствора PBSC и Ресуспензируйте в 1100 мкл PBSC.
      Примечание: Если какое-либо решение шарик утекло в крышку трубки во время инкубации, спина вниз решения с помощью настольная центрифуга на 2680 x г.
    4. Вручную передать решение шарик 96-луночных плиты (шарик Стандартные плиты). Используйте автоматизированные жидкости, обработки системы Алиготе бусины же 96-луночных пластины, 120 мкл за хорошо.
  2. иммуно обогащение на бисер
    1. после 3 h Анг I поколения период, место пластину инкубации на ICE для 10 мин прекратить поколения Ang I.
    2. Автоматически разбавить SIS пептид Стоковый раствор (10 пмоль/мкл) 100 раз с PBS буфер и далее автоматически Алиготе стабильной isoptope Стандартный пептид разбавления до 96-луночных ПЦР-планшете. Перевести 1.5 мкл раствора стабильного изотопа стандартов (SIS) пептида (содержащие 100 фмоль) в каждой скважине пластину инкубации и смешайте его с образцы плазмы или CEWA в PBS буферов.
    3. Автоматически передавать содержимое пластину инкубации шарик решение, 10 мл на хорошо, смешайте.
    4. Инкубировать пластину на 4 ° C в течение 1 ч при вращении в 8 об/мин.
    5. Мыть бисер три раза автоматически с 5 мм бикарбонат аммония (AmBic) раствор, 100 мкл на хорошо за мыть. После последнего мыть Ресуспензируйте бисер в 7 мкл 5 мм AmBic решение в каждой скважине. Использовать магнит тянуть бисер на дно после последнего Вашингтон

3. Передача бусы на MALDI целевой пластины и Добавление матрицы решения

  1. передачи 7 мкл шарик навоза автоматически на пластину целевой MALDI пятно размером 2 600 мкм. Пусть бисером высохнуть.
    Примечание: Небольшой USB-powered вентилятор может использоваться для ускорения процесса сушки шарик.
  2. Автоматически 2 мкл α-циано-4-Гидроксикоричная кислоты (HCCA)-Матрица решения (содержащие 3 мг/мл HCCA, цитрат аммония 1,8 мг/мл, Ацетонитрил 70% и 0,1%, trifluoroacetic кислота) от матрицы хорошо на каждый образец пятно на пластину целевой .

4. Сигнал приобретение MALDI-TOF-MS и анализа данных

  1. анализ образца пятна с инструментом MALDI-TOF режиме положительных отражателя. Выполнение внутренней калибровки, сглаживание данных и вычитание автоматически с поставщика программного обеспечения.
    Примечание: Режим (положительных/отрицательных, линейный/рефлектор) выбран для MALDI-TOF измерения зависит от целевой пептидов или белки.
  2. Рассчитать относительный ответ коэффициент (коэффициент интенсивности Nat/SIS) и сравнить его с калибровочной кривой определить из анг концентрация в каждом образце. Рассчитать PRA, используя уравнение (1), где Δt анг я поколение представляет время, используется для генерации Ang I.
    PRA = [анг я] / Δt анг я поколения (1)

Результаты

Автоматизированная iMALDI процедура измерения анг я показано на рисунке 1. Целевой пептидов (эндогенные пептидов или пептиды из переваренной белков) обогащены на борьбе с пептидной магнитные бусы, а затем бисер передаются целевой пластина для измерения MA...

Обсуждение

По сравнению с обычными белка на основе MS количественной оценки, iMALDI использует антитела, чтобы обогатить аналитов и очистить их от сложных образцов, поэтому делает возможным количественно белков и пептидов при низких концентрациях. Важнейшим шагом в iMALDI протоколе является иммуно обо?...

Раскрытие информации

C.H.B держит патент на технологию iMALDI.

Благодарности

Мы благодарим финансовой поддержки из генома Канады и Британской Колумбии генома для операций (204PRO) и развития технологии (214PRO) через сеть инноваций генома (Джин). Мы благодарим платформы обнаружения наркотиков в исследовательском институте центра здоровья университета МакГилл для использования MALDI-TOF инструмента для съемок. H.L. благодарен за поддержку от докторантура стипендий от национальной науки и инженерных исследований Совет Канады (СЕНТИ). C.H.B благодарен за поддержку от переднего края Дотационный фонд (LEEF). C.H.B. благодарен за поддержку Председателя McGill Сигал в молекулярная онкология в университете Макгилла (Монреаль, Квебек, Канада). M.X.C. и C.H.B. благодарна за поддержку от Уоррен ю. Сопер благотворительный фонд и Фонд семьи Сегал Элвин еврейской больницы (Монреаль, Квебек, Канада).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Healthy control human plasmaBioreclamationHMPLEDTA2
Ammonium bicarbonateSigma Aldrich09830
Ammonium citrate dibasicSigma Aldrich09833
CHAPS (>=98%)Sigma AldrichC9426
Albumin from chicken egg white (>98%)Sigma AldrichA5503
Ethylenediaminetetraacetic acidSigma AldrichEDS
Alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acidSigma Aldrich70990
Phosphate buffered salineSigma AldrichP4417
Phenylmethanesulfonyl fluorideSigma Aldrich78830
Trifluoroacetic acidThermo Fisher Scientific85172LC-MS grade
acetonitrileFluka34967LC-MS grade
waterFluka39253LC-MS grade
acetic acidFluka320099LC-MS grade
Tris(hydroxymethyl)aminomethaneRoche Diagnostics3118169001
Dynabeads Protein G magnetic beadsThermo Fisher Scientific10003D2.8 μm, 30 mg/mL
anti-Ang I goat polyclonal antibodySanta Cruz Biotechnologysc-7419
Nat and SIS Ang Isynthesized at the University of Victoria-Genome BC Proteomics Centre
Automated liquid handling systemAgilent16050-102Agilent Bravo robotic workstation
MagnetThermo Fisher Scientific12321DInvitrogen DynaMag-2 magnet
Tube rotatorTheromo Scientific400110QLabquake Tube Rotator
MagnetThermo Fisher Scientific12027DynaMag-96 side skirted magnet
MagnetVP Scientific771RM-1used to pull the beads to the bottom of the well
MALDI-TOFBrukerBruker Microflex LRF instrument

Ссылки

  1. Aebersold, R., Mann, M. Mass spectrometry-based proteomics. Nature. 422 (6928), 198-207 (2003).
  2. Nicol, G. R., et al. Use of an Immunoaffinity-Mass Spectrometry-based Approach for the Quantification of Protein Biomarkers from Serum Samples of Lung Cancer Patients. Mol. & Cell. Proteomics. 7 (10), 1974-1982 (2008).
  3. Webster, J., Oxley, D., Zanders, E. D. . Chemical Genomics and Proteomics: Reviews and Protocols. , 227-240 (2012).
  4. Yergey, A. L., et al. De novo sequencing of peptides using MALDI/TOF-TOF. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 13 (7), 784-791 (2002).
  5. Anderson, L. Six decades searching for meaning in the proteome. J. Proteomics. 107, 24-30 (2014).
  6. Landegren, U., et al. Opportunities for Sensitive Plasma Proteome Analysis. Anal. Chem. 84 (4), 1824-1830 (2012).
  7. Guo, A., et al. Immunoaffinity Enrichment and Mass Spectrometry Analysis of Protein Methylation. Mol. & Cell. Proteomics. 13 (1), 372-387 (2014).
  8. Florentinus-Mefailoski, A., Soosaipillai, A., Dufresne, J., Diamandis, E. P., Marshall, J. G. An enzyme-linked immuno-mass spectrometric assay with the substrate adenosine monophosphate. Anal. Bioanal. Chem. 407 (4), 1119-1130 (2015).
  9. Fredolini, C., et al. Immunocapture strategies in translational proteomics. Expert Rev Proteomics. 13 (1), 83-98 (2016).
  10. Tran, J. C., et al. Automated Affinity Capture and On-Tip Digestion to Accurately Quantitate in Vivo Deamidation of Therapeutic Antibodies. Anal. Chem. , (2016).
  11. Razavi, M., Leigh Anderson, N., Pope, M. E., Yip, R., Pearson, T. W. High precision quantification of human plasma proteins using the automated SISCAPA Immuno-MS workflow. N. Biotechnol. 33 (5 Part A), 494-502 (2016).
  12. Razavi, M., et al. High-Throughput SISCAPA Quantitation of Peptides from Human Plasma Digests by Ultrafast, Liquid Chromatography-Free Mass Spectrometry. J. Proteome Res. 11 (12), 5642-5649 (2012).
  13. Anderson, N. L., et al. SISCAPA Peptide Enrichment on Magnetic Beads Using an In-line Bead Trap Device. Mol. & Cell. Proteomics. 8 (5), 995-1005 (2009).
  14. Parker, C. E., Pearson, T. W., Anderson, N. L., Borchers, C. H. Mass-spectrometry-based clinical proteomics - a review and prospective. The Analyst. 135 (8), 1830-1838 (2010).
  15. Reid, J. D., Holmes, D. T., Mason, D. R., Shah, B., Borchers, C. H. Towards the Development of an Immuno MALDI (iMALDI) Mass Spectrometry Assay for the Diagnosis of Hypertension. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 21 (10), 1680-1686 (2010).
  16. Mason, D. R., Reid, J. D., Camenzind, A. G., Holmes, D. T., Borchers, C. H. Duplexed iMALDI for the detection of angiotensin I and angiotensin II. Methods. 56 (2), 213-222 (2012).
  17. Camenzind, A. G., vander Gugten, J. G., Popp, R., Holmes, D. T., Borchers, C. H. Development and evaluation of an immuno-MALDI (iMALDI) assay for angiotensin I and the diagnosis of secondary hypertension. Clin. Proteomics. 10 (1), 20 (2013).
  18. Jiang, J., et al. Development of an immuno tandem mass spectrometry (iMALDI) assay for EGFR diagnosis. Proteomics Clin Appl. 1, (2007).
  19. Jiang, J., Parker, C. E., Fuller, J. R., Kawula, T. H., Borchers, C. H. An Immunoaffinity Tandem Mass Spectrometry (iMALDI) assay for Detection of Francisella tularensis. Analytica chimica acta. 605 (1), 70-79 (2007).
  20. Popp, R. An automated assay for the clinical measurement of plasma renin activity by immuno-MALDI (iMALDI). Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1854 (6), 547-558 (2015).
  21. Schoenherr, R. M., et al. Automated screening of monoclonal antibodies for SISCAPA assays using a magnetic bead processor and liquid chromatography-selected reaction monitoring-mass spectrometry. J Immunol Methods. 353 (1-2), 49-61 (2010).
  22. Borchers, C. H. Methods of quantitation and identification of peptides and proteins. US patent. , (2010).
  23. Borchers, C. H. Methods of quantitation and identification of peptides and proteins. Canadian patent CA. , (2011).
  24. Weiß, F., et al. Catch and measure-mass spectrometry-based immunoassays in biomarker research. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1844 (5), 927-932 (2014).
  25. Nelson, A. L. Antibody fragments: Hope and hype. mAbs. 2 (1), 77-83 (2010).
  26. Gupta, V., et al. An evaluation of an aptamer for use as an affinity reagent with MS: PCSK9 as an example protein. Bioanalysis. 8 (15), 1557-1564 (2016).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

126MALDIiMALDI

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены