펩 티 드 및 단백질 정량화를 사용 하 여 자동 면역-MALDI (iMALDI)

요약

자동된 면역-MALDI (iMALDI) 기술을 사용 하 여 복잡 한 생물 학적 체액에서 단백질 정량화에 대 한 프로토콜 제공 됩니다.

초록

질량 분석 (MS)는 각 대상 분자의 질량 대 전 비의 직접적인 탐지 결과로 우수한 시험으로 복잡 한 견본에서 단백질을 측정에 대 한 가장 일반적으로 사용 되는 기술 중 하나입니다. 그러나, 대부분의 다른 분석 기법 처럼 MS 기반 proteomics, 높은 풍부 analytes 측정으로 편견을가지고, 그래서 그것을 달성 하기 위해 도전 검색 낮은 ng/mL의 제한 또는 복잡 한 예제 및 이것에서 pg/mL은 많은 농도 범위 biofluids 인간 플라스마 등에서 질병 관련 단백질. 낮은 풍부한 analytes의 검색에서을 돕기 위해, 면역 강화에 집중 하 고 순화 MS 측정, 시험 감도 크게 향상 하기 전에 분석 분석 결과 통합 되었습니다. 이 작품에서는, 면역 Matrix-Assisted 레이저 탈 착/이온화 (iMALDI) 기술은 단백질과 펩 티 드 biofluids에의 정량화에 대 한 제시, 구슬에 면역-농축에 따라, 사전 차입 없이 MALDI MS 측정 뒤. 안티 펩 티 드 항 체는 자성 구슬에 기능성 고 샘플 incubated. 세척, 구슬 MALDI 표적 격판덮개에 직접 전송 됩니다 후 신호 매트릭스 솔루션 구슬에 적용 된 후 MALDI 시간의 비행 (TOF MALDI) 악기에 의해 측정 됩니다. 샘플 준비 절차는 다른 면역 MS 분석 실험에 비해 간소화 하 고 MALDI 측정은 빠르다. 전체 샘플 준비 향상 된 분석 결과 재현성 및 높은 처리량 처리 시스템, 액체 자동입니다. 이 문서에서는, iMALDI 분석 결과 펩 티 드 안을 결정 하는 데 사용 되 나 (중앙 나) 기본 aldosteronism (PA)의 심사에 대 한 플라즈마 renin 활동의 판독으로 임상으로 사용 되는 플라즈마에 농도.

서문

질량 분석 양적 proteomics에 불가 결 한 도구가 되고있다. 질량 분석 대상 단백질 또는 펩 티 드의 질량을 확인할 수 있습니다, 그리고 따라서 취득된 분석 신호 수 있습니다 매우 구체적인 immunoassays에 비해. 2 개의 이온화 방법, 분무 및 MALDI, 가장 일반적으로 단백질 및 펩 티 드^1,2,,34를 탐지 하는 데 사용 됩니다. MS 기반 단백질 정량화의 주요 과제는 높은 풍부한 단백질의 ng/mL 또는 pg/mL 농도에서 복잡 한 샘플에 낮은 풍부한 단백질의 검출에 거짓말 그리고 인간 플라스마에서 발견 많은 후보 단백질 바이오 마커 내이 범위⁵. 이 문제는 대부분 본질적으로 넓은 동적 범위와 인간 프로테옴⁶의 복잡성에 의해 발생 됩니다.

극복 하기 위해 이러한 탐지 과제, 면역 MS 방법은 대상 단백질 또는 펩 티 드 고체 표면에 샘플 솔루션에서 풍부 하 게 개발 되었다 뒤에 analytes과 MS 측정^7,8 의 차입 ^{, 9 , 10}. 면역 강화 통해는 analytes 복잡 한 샘플에서 순화 된다 그리고 다른 분자에서 이온 억제 효과 최소화 하는 따라서. 다양 한 고체 지원 중 자석 구슬은 현재 가장 널리 사용으로 높은 항 체 바인딩 용량의 장점 및 취급의 용이성. 마그네틱 구슬 다른 functionalizations와 크기를 개발 하 고 immunoprecipitation 실험에 대 한 상용화 되었습니다. 날짜 하려면, immuno-농축 구슬에는 되었습니다 인터페이싱 분무 이온화 (ESI)과 MALDI MS 단백질 및 펩 티 드 측정에 대 한. 안정 동위 원소 표준 및 안티 펩 티 드 항 체 (SISCAPA) 기술에 의해 캡처, 샘플에서 단백질 소화는, 면역 강화에 대 한 항 체 코팅 구슬 부 화 뒤. "클래식" SISCAPA에서 캡처된 proteotypic 펩 티 드, 구슬에서 eluted 있으며 측정 하 여 액체 착 색 인쇄기-ESI-석사 (LC-석사), 또는 직접적인 주입 ESI-다중 반응 모니터링-석사 (ESI-MRM-석사)^11,12. 면역-농축 향상 MRM 분석 결과 감도 3-4 배나 낮은 ng/mL 범위¹³도달.

분무 MS에 비해, MALDI MS 빠릅니다, 그리고 포함 하지 않는 청소 및 LC 열의 재 평형 carryover 및 오염 문제가 없습니다 그래서 높은 처리량 연구¹⁴를 위해 더 적당 한 만들기. 와 결합 하 여 면역-농축 MALDI MS 펩 티 드와 단백질 (proteotypic 펩 티 드의 정량 기준)의 과민 하 고 특정 정량화에 대 한 우리의 실험실에서 면역 MALDI 기술 개발 되었습니다^{15,16 ,17}. 면역-농축 후 구슬 MALDI 표적 격판덮개에 예금 하 고 매트릭스 솔루션 구슬에 추가 하 고 접시 건조 후 MALDI TOF MS 분석에 대 한 준비가 되어. 구슬에서 펩 티 드의 차입 별도 단계로 수행 되지 않습니다 하지만 선호도 바인딩된 analytes는 eluted MALDI 매트릭스 솔루션에 의해 비드 관광 명소, 그로 인하여 시료 준비를 단순화 하 고 샘플 손실 최소화에 추가 되 면. IMALDI 기술 다양 한 애플 리 케이 션^18,19에 적용 된 및 최근에 자동화 되었으며 안 측정에 사용 되 나 (중앙 난) 플라즈마 renin 활동 (PRA)²⁰결정. 이 프로토콜은 자동된 iMALDI 분석 결과 수행 하는 데 사용 하는 절차를 시연할 예정 이다. 예를 들어, 10% 미만의 간 날 CVs 프라 분석 결과 복용 하루²⁰당 744 샘플 측정 기능으로 자동화를 통해 달성 되었습니다.

이 원고에서 iMALDI PRA 분석 결과 대상 분자로 단백질 소화를 요구 하지 않는다 (중앙 나) 1295.7 Da의 분자 무게 펩 티 드 이다. 다른 분석 실험 단백질 소화 필요 하 고 펩 티 드 그대로 단백질 대리로 사용 되에서 iMALDI에 대 한 선택 된 펩타이드 독특하고 800 다 그래서 그는 c에서 쉽게 구별 될 수 있다 이상의 질량을 가진 대상 단백질에 특정 해야 MALDI 매트릭스 솔루션에서 hemical 잡음입니다. 안티 펩 티 드 항 체는 면역 강화는 펩 티 드에 대 한 필요 합니다. PRA를 측정 하는 iMALDI 분석 결과 대 한 프로토콜 4 단계로 구성: 1) 중앙의 세대 나 인간의 플라즈마; 2) 중앙의 면역-농축 항 체 코팅 구슬;를 사용 하 여 나 3) 이전 비즈는 MALDI 표적 격판덮개 추가 매트릭스 솔루션; 그리고 4) MALDI TOF MS 및 데이터 분석²⁰수집을 신호.

프로토콜

아래에 설명 된 시 약의 양을 20 환자 혈장 샘플의 측정 기준. 프로토콜 다음과 아래 빅토리아 대학교의 가이드라인 제시 ' s 인간 연구 윤리 위원회.

1. 세대의 중앙 인간 플라스마에서 나

1. 녹여 플라즈마 샘플 (≥ 200 µ L) 방에 온도 물 5 분, 목욕 하 고 완전히 해 동 때까지 얼음에 샘플을 넣어 다음.
2. 1.1 mL 깊은 잘 격판덮개 (샘플 접시)의 웰 스를 분리 하 고 접시 2 ° C와 1278 x g.에서 10 분 원심 분리기에 원심을 수동으로 각 플라즈마 샘플의 전송 200 µ l
3. 는 자동된 액체 처리 시스템을 사용 하 여 직렬로 6 교정기 솔루션 치킨 난 백 알 부 민을 준비 500 fmol / µ L 중앙 나 NAT 표준 솔루션을 희석 (0.1, 0.2, 0.6, 1.9, 5.7, 17.2 fmol / µ L).
4. 피펫은 200 µ L의 세대의 잘, 그리고 125 µ L 각 교정기 버퍼 샘플 접시.
   참고: 버퍼링 된 식 염 수 (PBS) 버퍼 갓 실험 당일에 준비 해야 하는 인산 염에 CEWA.
5. 는 자동된 액체 처리 시스템을 사용 하 여, 새로운 접시에 섞어 표면에 뜨는 플라즈마의 125 µ L 또는 PBS에 CEWA의 125 µ L 중앙의 25 µ L 나 세대 버퍼, 0.2 m m ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA), 트리 스 1 M, 1 mM 포함 phenylmethylsulfonyl 불 (PMSF).
   참고: 준비는 중앙 난 1 M Tris/0.2 mM EDTA 수성 버퍼를 혼합 하 여 세대 버퍼 (pH 5.5에 조정 초 산을 사용 하 여) PMSF 솔루션 메탄올 (100 mM). 두 솔루션 모두 실험의 날에 4 ° C. 믹스 두 솔루션에서 1 개월을 저장할 수 있습니다.
6. 자동으로 96 잘 접시, 3 복제 솔루션 당, 잘 당 34 µ L로 솔루션을 전송합니다. 3 h. 위해 37 ° C에서 접시를 품 어

2. 중앙의 면역-농축 나 사용 하 여 항 체 코팅 구슬

1. 자기 단백질 G 구슬에 항 체의 활용
   참고: 구슬와 항 체의 활용은 중앙 3 h 동안 수동으로 수행 나 생성 기간에는 실험의 하루입니다. 다른 analytes에 대 한 활용된 구슬 속성 및 항 체의 안정성에 따라 3 개월 이상, 4 ° C에서 동작 하는 0.015% 챕 (PBSC)를 포함 하는 PBS 버퍼에 저장할 수 있습니다.
   1. 전송 110 µ L (충분히 20 샘플을 측정 하 고 6-포인트 표준 곡선을 만들기 위한) 구슬 슬러리의 1.5 mL 튜브에. 구슬 7 번의 25% 이기/PBSC, 1 mL와 함께 세 번 PBSC의 1 mL 씻으십시오. 마그네틱 스탠드를 사용 하 여 작은 각 세척 단계 사이 구슬. 후에 마지막 워시 워시 버퍼를 제거
      참고: 25 %7 번 세척 이기/PBSC은 트윈-20 등 구슬 슬러리에 MS-호환 되지 않는 첨가물 제거 중요 합니다. 이 광범위 한 세척 단계 필요 하지 않을 수 있습니다 선택 된 구슬에 같은 첨가제 경우.
   2. PBSC의 110 µ L에 구슬 resuspend 및 안티 중앙의 110 µ L 추가 나 항 체 (최종 항 체 농도: 100 µ g/mL). Pipetting, 구슬 및 솔루션을 혼합 하 고 다음 1 시간, 8 rpm에 회전에 대 한 실내 온도에 그들을 품 어.
   3. 구슬 PBSC의 1 mL로 3 번 세척 하 고 PBSC의 1100 µ L에서 resuspend.
      참고: 경우 어떤 구슬 솔루션은 외피 동안 튜브의 캡으로 흘 렀 다, 스핀 2680 x g.에서 벤치탑 원심 분리기를 사용 하 여 솔루션 다운
   4. 96 잘 접시 (구슬 표준 접시)에 구슬 솔루션을 수동으로 전송합니다. 자동된 액체 처리 시스템을 약 수 같은 96 잘 접시, 당 잘. 120 µ L에 구슬 사용
2. 구슬에 면역-농축
   1. 중앙 3 h 나 생성 기간 배양 접시에 배치 후 리안 나의 세대를 종료 10 분을 위한 아이스
   2. 자동으로 SIS 펩 티 드 재고 솔루션 (10 pmol/μ) 약 희석 PBS를 가진 버퍼, 그리고 자동으로 추가 약 96 잘 PCR 접시에 안정적인 isoptope 표준 펩타이드 희석 수. 외피 격판덮개의 각 음에 1.5 µ L의 안정 동위 원소 표준 (SIS) 펩 티 드 솔루션 (100 fmol 포함)을 전송 하 고 플라즈마 샘플 또는 PBS 버퍼에 CEWA와 함께 섞어.
   3. 자동으로 비드 솔루션 잘 당 10 mL에 외피 격판덮개의 내용을 전송, 혼합.
   4. 8 rpm에 회전 하는 동안 1 시간에 4 ° C에서 접시를 품 어.
   5. 씻어 구슬 세 번 자동으로 5 m m 염화 중 탄산염 (AmBic) 솔루션, 잘 세척 당 당 100 µ L. 마지막 세척 후 5mm 각 잘에서 AmBic 솔루션의 7 µ L에 구슬 resuspend. 자석 마지막 워시 후 하단에 비즈를 사용 하 여

3. MALDI 표적 격판덮개 및 추가 매트릭스 솔루션에 구슬의 전송

2600의 점 크기를 자동으로 MALDI 표적 격판덮개에 구슬 슬러리의 전송 7 µ L

µ m. 구슬 밖으로 건조 하자.
참고: 작은 USB 전원 팬 비드 건조 과정을 가속 화 하기 위해 사용할 수 있습니다.
1. 자동으로 α-cyano-4-hydroxycinnamic 산 (HCCA)의 2 µ L 추가-각 샘플 대상 접시에 자리에 잘 매트릭스 매트릭스 솔루션 (3 mg/mL HCCA, 1.8 mg/mL 암모늄 시트르산, 70% 이기, 그리고 0.1 %trifluoroacetic 산 포함) .

4. MALDI TOF MS 및 데이터 분석에 의해 인수 신호

긍정적인 반사 모드를 사용 하 여 MALDI TOF 악기와

1. 분석 샘플 명소. 내부 교정, 데이터 스무 딩, 및 공급 업체 특정 소프트웨어와 함께 자동으로 초기 빼기 수행.
   참고: (긍정/부정, 선형/반사판) 선택한 모드 MALDI TOF 측정 대상 펩 티 드 또는 단백질에 따라.
2. 상대 응답 비율 (Nat/SIS 강도 비율)를 계산 하 고 각 샘플의 농도 중앙의 결정 하기 위해 표준 곡선에 그것을 비교. PRA 어디 방정식 (1)를 사용 하 여 계산 δ t _{중앙 난 세대} 중앙 I.의 생성에 사용 된 시간을 나타냅니다
   PRA = [중앙 난] / δ t _{중앙 난 세대} (1)

결과

중앙을 측정 하기 위한 자동화 된 iMALDI 절차 나 그림 1에 표시 됩니다. 대상 펩 티 드 (내 인 성 펩 티 드 또는 소화 단백질에서 펩 티 드) 안티 펩 티 드 자석 구슬에 풍성 하 게 하 고 구슬 MALDI 측정 대상 접시에 전송 됩니다. 전체 프로시저 추가 펩타이드 차입 단계를 필요로 하는 다른 면역-MS 기술에 비해 간단 합니다. IMALDI 분석 결과의 자동화와 10

토론

기존의 MS 기반 단백질 정량화에 비해, iMALDI는 analytes 풍부 하 고 따라서 단백질 또는 펩 티 드 낮은 농도에서 정할 수 있도록 복잡 한 샘플에서 그들을 정화 하 항 체를 사용 합니다. IMALDI 프로토콜에 중요 한 단계는 대상 펩 티 드의 면역 농축입니다. 이 목적에 대 한 선호도와 높은 특이성 항 체를 선택 합니다. SISCAPA에서 그것은 10^-9 M 또는 더 나은에서 항 체 친 화력 낮은 ng/mL^2...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Healthy control human plasma	Bioreclamation	HMPLEDTA2
Ammonium bicarbonate	Sigma Aldrich	09830
Ammonium citrate dibasic	Sigma Aldrich	09833
CHAPS (>=98%)	Sigma Aldrich	C9426
Albumin from chicken egg white (>98%)	Sigma Aldrich	A5503
Ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma Aldrich	EDS
Alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid	Sigma Aldrich	70990
Phosphate buffered saline	Sigma Aldrich	P4417
Phenylmethanesulfonyl fluoride	Sigma Aldrich	78830
Trifluoroacetic acid	Thermo Fisher Scientific	85172	LC-MS grade
acetonitrile	Fluka	34967	LC-MS grade
water	Fluka	39253	LC-MS grade
acetic acid	Fluka	320099	LC-MS grade
Tris(hydroxymethyl)aminomethane	Roche Diagnostics	3118169001
Dynabeads Protein G magnetic beads	Thermo Fisher Scientific	10003D	2.8 μm, 30 mg/mL
anti-Ang I goat polyclonal antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-7419
Nat and SIS Ang I	synthesized at the University of Victoria-Genome BC Proteomics Centre
Automated liquid handling system	Agilent	16050-102	Agilent Bravo robotic workstation
Magnet	Thermo Fisher Scientific	12321D	Invitrogen DynaMag-2 magnet
Tube rotator	Theromo Scientific	400110Q	Labquake Tube Rotator
Magnet	Thermo Fisher Scientific	12027	DynaMag-96 side skirted magnet
Magnet	VP Scientific	771RM-1	used to pull the beads to the bottom of the well
MALDI-TOF	Bruker		Bruker Microflex LRF instrument