Peptide et protéine Quantification moyen automatisé Immuno-MALDI (iMALDI)

Résumé

Un protocole pour la quantification de la protéine dans les liquides biologiques complexes à l’aide de la technologie automatisée immuno-MALDI (iMALDI) est présenté.

Résumé

Spectrométrie de masse (MS) est une des technologies plus couramment utilisées pour quantifier les protéines dans des échantillons complexes, avec dosage excellente spécificité à la suite de la détection directe du ratio masse à charge de chaque molécule cible. Cependant, protéomique axée sur les MS, comme la plupart des autres techniques analytiques, a un biais de mesure haute-abondance analytes, donc il est difficile d’atteindre les seuils de détection de basse ng/mL ou pg/mL chez des échantillons complexes et c’est la plage de concentration pour beaucoup maladie-les protéines liquides comme le plasma humain. Pour aider à la détection d’analytes de faible abondance, immuno-enrichissement a été intégré dans l’essai de se concentrer et de purifier l’analyte avant MS mesure, améliorer significativement la sensibilité. Dans ce travail, la technologie immuno - Matrix-Assisted Laser désorption-ionisation (iMALDI) est présentée pour la quantification des protéines et des peptides dans les liquides, issue des immuno-enrichissement sur perles, suivie par MALDI-MS mesure sans préalable d’élution. Les anticorps anti-peptides sont fonctionnalisés sur billes magnétiques et incubées avec les échantillons. Après le lavage, les perles sont directement transférées sur une plaque de mire MALDI, et les signaux sont mesurés par un MALDI-temps des instruments de vol (MALDI-TOF) après que la solution de la matrice a été appliquée aux talons. La procédure de préparation d’échantillon est simplifiée par rapport aux autres tests immuno-MS, et la mesure de la MALDI est rapide. La préparation de l’ensemble de l’échantillon est automatisée avec un liquide de système, de la manutention avec la reproductibilité du dosage améliorée et un débit plus élevé. Dans cet article, le test d’iMALDI est utilisé pour déterminer l’angiotensine peptide j’ai (Ang I) concentration dans le plasma, qui est utilisé cliniquement comme indicateur de l’activité rénine plasmatique pour la projection d’hyperaldostéronisme primaire (PA).

Introduction

Spectrométrie de masse est devenu un outil indispensable en protéomique quantitative. Spectrométrie de masse permet de déterminer les masses des peptides ou des protéines cibles, donc les signaux analyte obtenus peuvent être très spécifiques par rapport aux tests immunologiques. Deux méthodes d’ionisation electrospray et MALDI, sont plus couramment utilisés pour la détection des protéines et des peptides^1,2,3,4. Un défi majeur dans la quantification des protéines basée sur MS réside dans la détection des protéines de faible abondance dans des échantillons complexes à des concentrations ng/mL ou pg/mL en présence de protéines de haute-abondance, et nombreux biomarqueurs protéiques de candidat dans le plasma humain sont au sein de cette gamme⁵. Ce problème est dû en grande partie par l’intrinsèquement une plage dynamique étendue et la complexité du protéome humain⁶.

Pour surmonter ces difficultés de détection, les méthodes immuno-SM ont été développés afin d’enrichir les protéines cibles ou des peptides dans les solutions d’échantillon sur une surface solide, suivie d’élution de l’analyser et MS mesure^{7,8 , 9 , 10}. par immuno-enrichissement sans cause, les analytes sont purifiées à partir des échantillons complexes et donc les effets de la suppression des ions d’autres molécules sont réduites au minimum. Parmi les différents supports solides, billes magnétiques sont actuellement plus largement utilisés car ils ont les avantages de la capacité de liaison anticorps élevés et facilité de manipulation. Billes magnétiques avec différentes fonctionnalisation et tailles ont été développés et commercialisés pour des expériences d’immunoprécipitation. A ce jour, immuno-enrichissement sur perles a été interfacé avec ionisation par électrospray (ESI) et MALDI-MS pour la mesure de protéines et de peptides. Dans les normes des isotopes stables et la capture par la technologie anticorps anti-peptide (SISCAPA), les protéines dans les échantillons sont digérées, suivie d’une incubation avec perles revêtus d’anticorps pour immuno-enrichissement. Dans SISCAPA « classique », les peptides proteotypic capturés sont éluées de talons et mesurées par Liquid Chromatography-ESI-MS (LC-MS), ou par perfusion directe ESI-Multiple réaction Monitoring-MS (MRM-ESI-MS)^11,12. Immuno-enrichissement amélioré la sensibilité de l’éssai MRM de 3-4 ordres de grandeur, atteignant le rang faible ng/mL¹³.

Par rapport à electrospray-MS, MALDI-MS est plus rapide et n’implique pas le nettoyage et la rééquilibration des colonnes LC donc il n’y a aucun problème de report et contamination, plus adapté aux études haut débit¹⁴. Immuno-MALDI technologie a été développée dans notre laboratoire à combiner immuno-enrichissement avec MALDI-MS pour la quantification sensible et spécifique des peptides et des protéines (basés sur le dosage des peptides proteotypic)^{15,16 ,},¹⁷. Après enrichissement immuno, les perles sont déposés sur une plaque de mire MALDI, la solution de matrice est ajoutée aux billes et la plaque est prête pour l’analyse par un MALDI-TOF-MS après séchage. L’élution des peptides de la perle n’est pas exécutée comme une étape distincte, mais affinité lié aux analytes sont éluées par la solution de matrice MALDI lorsqu’il est ajouté aux spots perle, ce qui simplifie la préparation de l’échantillon et réduisant au minimum la perte de l’échantillon. La technologie iMALDI a été appliquée dans une variété d’applications^18,19et récemment a été automatisée et utilisée pour la mesure de l’angiotensine I (Ang je) pour la détermination de l’activité (PRA) rénine plasmatique²⁰. Ce protocole fera la démonstration de la procédure utilisée pour effectuer un test automatique iMALDI. Prendre le dosage de la PRA à titre d’exemple, la inter-journée CVs de moins de 10 % ont été obtenus grâce à l’automatisation, la capacité de mesurer 744 échantillons par jour²⁰.

Le test PRA iMALDI démontré dans ce manuscrit ne nécessite pas de digestion des protéines, comme la molécule cible (Ang I) est un peptide avec un poids moléculaire de 1295.7 Da. Lors d’autres essais où la digestion de protéines est nécessaire et un peptide est utilisé comme substitut pour la protéine intacte, le peptide sélectionné pour iMALDI doit être unique et spécifique à la protéine cible, avec une masse plus de 800 Da alors qu’elle peut être aisément distinguée de la c bruit chimique de la solution de matrice MALDI. Anticorps anti-peptides sont requis pour l’immuno-enrichissement des peptides. Le protocole de test iMALDI PRA de mesure se compose de quatre étapes : 1) génération de Ang j’ai dans le plasma humain ; 2) immuno-enrichissement d’Ang I à l’aide de petites perles revêtus d’anticorps ; 3) transfert de perles à une plaque de mire MALDI et ajout solution de matrice ; et 4) acquisition de signal par une analyse de MALDI-TOF-MS et données²⁰.

Protocole

les montants des réactifs décrits ci-dessous sont basés sur la mesure des 20 échantillons de plasma patient. Le protocole présenté ci-dessous suit les directives de l’Université de Victoria ' Comité de déontologie de la recherche humaine s.

1. génération de Ang j’ai dans le Plasma humain

1. décongeler les échantillons de plasma (≥ 200 µL) dans une salle l’eau à température de bain pendant 5 min et puis mettre les échantillons sur la glace jusqu'à ce que complètement décongelée.
2. Transférer 200 µL de chaque échantillon de plasma manuellement pour séparer les puits d’une plaque de fond de puits de 1,1 mL (plaque d’échantillon) et centrifuger la plaque dans une centrifugeuse pendant 10 min à 2 ° C et 1278 x g.
3. Utiliser un liquide automatique, système de manutention en série diluer une solution titrée 500 fmol/µL Ang I NAT pour préparer six calibrateurs avec albumine de blanc d’oeuf de poulet (0.1, 0.2, 0.6, 1,9, 5,7, 17,2 fmol/µL).
4. Pipette 200 µL de chaque étalon à un puits et 125 µL de génération tampon plaque échantillon.
   Remarque : Le chaieb en phosphate tampon tampon salin (PBS) doit être fraîchement préparées le jour de l’expérience.
5. à l’aide d’un liquide automatique, système de manutention, dans une nouvelle assiette Mélanger 125 µL du plasma surnageant ou 125 µL de chaieb dans du PBS avec 25 µL d’Ang j’ai tampon de génération, qui contient les Tris, l’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) de 0,2 mM et 1 mM 1 M le fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF).
   NOTE : Préparer l’Ang j’ai tampon génération en mélangeant un tampon aqueux 1 M Tris/0,2 mM EDTA (ajusté à pH 5.5 à l’aide d’acide acétique) et une solution PMSF (100 mM dans le méthanol). Les deux solutions peuvent être conservées jusqu'à 1 mois à 4 solutions de ° C. Mélangez les deux le jour de l’expérience.
6. Transférer automatiquement les solutions dans une plaque à 96 puits, 3 répétitions par solution, 34 µL / puits. Incuber les plaques à 37 ° C pendant 3 h

2. Immuno-enrichissement de Ang je revêtus d’anticorps à l’aide de perles

1. conjugaison d’anticorps sur des billes magnétiques de protéines G
   Remarque : conjugaison de l’anticorps avec les perles est effectuée manuellement pendant les 3 h Ang j’ai des période de génération sur le jour de l’expérience. D’autres analytes, les perles conjugués pourraient être en mesure d’être stocké dans le tampon PBS contenant 0,015 % CHAPS (PBSC) à 4 ° C pendant trois mois ou plus, selon les propriétés et la stabilité de l’anticorps.
   1. Transfert 110 µL de lisier de perle (assez pour 20 échantillons de mesure et de faire une courbe standard de 6 points) dans un tube de 1,5 mL. Laver les perles sept fois avec 1 mL d’acétonitrile/PBSC de 25 % et trois fois avec 1 mL de PBSC. Utiliser un support magnétique pour granuler les perles entre chaque étape de lavage. Retirer le tampon de lavage après le dernier lavage à.
      Remarque : Laver 7 fois avec 25 % acétonitrile/PBSC est essentiel pour éliminer les additifs MS incompatible avec du lisier de perle, comme le Tween-20. S’il n’y a pas d’additifs dans les perles sélectionnées, cette étape un lavage n’est peut-être pas nécessaire.
   2. Remettre en suspension les perles dans 110 µL de PBSC et ajoutez 110 µL d’anti-Ang I anticorps (concentration finale d’anticorps : 100 µg/mL). Mélanger la solution et perles en pipettant également et puis les incuber à température ambiante pendant 1 h, tournant à 8 tr/min.
   3. Laver les billes 3 fois avec 1 mL de PBSC et resuspendre dans 1100 µL de PBSC.
      Remarque : Si aucune solution de perle a coulé dans le capuchon du tube pendant l’incubation, tourner vers le bas de la solution à l’aide d’une centrifugeuse de paillasse à 2680 x g.
   4. Transférer la solution de perle manuellement dans une plaque à 96 puits (plaque standard perle). Utiliser le liquide automatisé système partie aliquote de manutention des perles sur la même plaque 96 puits, 120 µL par puits.
2. Immuno-enrichissement sur les perles
   1. après les 3 h Ang période de génération, placer la plaque d’incubation sur glace pendant 10 min mettre fin à la génération d’Ang I.
   2. Automatiquement diluer la solution mère de SIS peptide (10 pmol/μL) 100 fois avec du PBS de mémoire tampon et en outre automatiquement partie aliquote de la dilution de peptide standard stable isoptope à une plaque PCR 96 puits. Transférer 1,5 µL d’une solution de peptide de normes (SIS) isotopes stables (contenant 100 fmol) dans chaque puits de la plaque d’incubation et mélangez-le avec les échantillons de plasma ou la chaieb dans des tampons de PBS.
   3. Automatiquement transférer le contenu de la plaque d’incubation dans la solution de perle, 10 mL par puits, mélanger.
   4. Incuber la plaque à 4 ° C pendant 1 h tout en tournant à 8 tr/min.
   5. Laver les perles trois fois automatiquement avec la solution de bicarbonate d’ammonium (AmBic) de 5 mM, 100 µL / puits / cycle de lavage. Après le dernier lavage, remettre en suspension les perles dans 7 µL de 5 mM AmBic solution dans chaque puits. Utiliser un aimant pour tirer les billes vers le bas après le dernier lavage à.

3. Transfert de perles sur une plaque de mire MALDI et ajout de la Solution de matrice

1. Transfer 7 µL du lisier perle automatiquement sur une plaque de mire MALDI avec une taille de spot de 2 600 µm. Laissez sécher les perles.
   Remarque : Un petit ventilateur alimenté par USB peut être utilisé pour accélérer le talon du processus de séchage.
2. Ajouter automatiquement 2 µL de α-cyano-4-hydroxycinnamique (LCSS)-solution de matrice (contenant 3 mg/mL LCSS, citrate d’ammonium et 1,8 mg/mL, 70 % d’acétonitrile et 0,1 % d’acide trifluoroacétique) de la matrice bien sur chaque échantillon spot sur la plaque cible .

4. Acquisition par un MALDI-TOF-MS et l’analyse des données de signaux

taches

1. analyser l’échantillon avec un instrument de MALDI-TOF à l’aide de mode réflecteur positive. Effectuer l’étalonnage interne, lissage de données et de la soustraction de référence automatiquement avec le logiciel spécifique au fournisseur.
   Remarque : Le mode (positif/négatif, linéaire/réflecteur) sélectionné pour mesure de MALDI-TOF dépend de la cible peptides ou des protéines.
2. Calculer le taux de réponse relative (ratio d’intensité de Nat/SIS) et la comparer à la courbe d’étalonnage pour déterminer de l’Ang I concentration dans chaque échantillon. Calculer PRA où à l’aide de l’équation (1), Δt _{Ang je génération} représente le temps utilisé pour la génération d’Ang I.
   PRA = [Ang I] / Δt _{Ang je génération} (1)

Résultats

Une procédure automatisée d’iMALDI pour mesurer les Ang I est montré dans la Figure 1. Peptides de la cible (peptides endogènes ou peptides de protéines digérées) sont enrichies sur le anti-peptides billes magnétiques, et ensuite les perles sont transférés à une plaque de mire pour la mesure de MALDI. L’ensemble de la procédure est simplifiée par rapport aux autres technologies d’immuno-MS qui nécessitent des mesures supplémentaires de pe...

Discussion

Par rapport à la quantification des protéines classiques basées sur, iMALDI utilise les anticorps d’enrichir l’analyser et de les purifier des échantillons complexes, rendant donc impossible de quantifier les protéines ou les peptides à de faibles concentrations. Une étape cruciale dans le protocole d’iMALDI est l’immuno-enrichissement des peptides cible. À cette fin, avec une grande spécificité et l’affinité des anticorps doivent être sélectionnés. Dans SISCAPA, on a signalé que des affinités d...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Healthy control human plasma	Bioreclamation	HMPLEDTA2
Ammonium bicarbonate	Sigma Aldrich	09830
Ammonium citrate dibasic	Sigma Aldrich	09833
CHAPS (>=98%)	Sigma Aldrich	C9426
Albumin from chicken egg white (>98%)	Sigma Aldrich	A5503
Ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma Aldrich	EDS
Alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid	Sigma Aldrich	70990
Phosphate buffered saline	Sigma Aldrich	P4417
Phenylmethanesulfonyl fluoride	Sigma Aldrich	78830
Trifluoroacetic acid	Thermo Fisher Scientific	85172	LC-MS grade
acetonitrile	Fluka	34967	LC-MS grade
water	Fluka	39253	LC-MS grade
acetic acid	Fluka	320099	LC-MS grade
Tris(hydroxymethyl)aminomethane	Roche Diagnostics	3118169001
Dynabeads Protein G magnetic beads	Thermo Fisher Scientific	10003D	2.8 μm, 30 mg/mL
anti-Ang I goat polyclonal antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-7419
Nat and SIS Ang I	synthesized at the University of Victoria-Genome BC Proteomics Centre
Automated liquid handling system	Agilent	16050-102	Agilent Bravo robotic workstation
Magnet	Thermo Fisher Scientific	12321D	Invitrogen DynaMag-2 magnet
Tube rotator	Theromo Scientific	400110Q	Labquake Tube Rotator
Magnet	Thermo Fisher Scientific	12027	DynaMag-96 side skirted magnet
Magnet	VP Scientific	771RM-1	used to pull the beads to the bottom of the well
MALDI-TOF	Bruker		Bruker Microflex LRF instrument