АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Протокол для microfluidic спиннинг и микроструктуры характеристика регенерированного шелка Фиброин леска представлен.

Аннотация

Протокол демонстрирует метод для имитации процесса прядения шелкопряда. В процессе собственного спиннинг Договаривающихся спиннинг воздуховодов позволяет протеины шелка быть компактной и приказал обрезка и удлинение силами. Здесь biomimetic microfluidic канал был разработан чтобы имитировать конкретные геометрии спиннинг протока тутового шелкопряда. Спиннинг регенерированный Фиброин шелка (RSF), легированных с высокой концентрацией, была экструдированного через микроканальные сухой спин волокон при температуре и давлении. В процессе после обработки как прядения волокна были обращено и хранятся в водном растворе этанола. Синхротронного излучения широкоугольных рентгеновской дифракции (SR-WAXD) технология была использована для расследования микроструктуры одного RSF волокон, которые были исправлены в держатель образца с оси волокна RSF нормально Микролучевой рентгеновский снимок. Кристалличность, размер кристаллитов и кристаллической ориентации волокна были рассчитаны из WAXD данных. Дифракции дуги в районе экватора двумерной модели WAXD указывают, что после обработки волокна RSF имеет степень высокой ориентации.

Введение

Паук и шелкопряд может произвести выдающиеся шелковые волокна из водного раствора белка раствора при температуре и давлении. Стрижка и объемный поток может вызывать образование жидких кристаллов текстуры шелка железы1. В последние годы наблюдается большой интерес в имитируя процесс прядения паука для того, чтобы производить Искусственние волокна высокой прочности. Однако большое количество паука шелк белка не производиться эффективно и экономично земледелия пауков из-за людоедства. Значительное количество шелк шелкопряда можно легко получить от сельского хозяйства. В противном случае шелкопряд и паук имеют аналогичные спиннинг процесса и аминокислотный состав. Таким образом шелкопряда Фиброин шелка выбирается в качестве заменителя спина искусственного шелка животных многими исследователями.

Паук и шелкопряда выдавливать раствор белка через их спиннинг протока в волокно в воздухе. Высокое напряжение сил вдоль протока спиннинг скорее растянуть молекул Фиброин шелка более расширенный конформации2. Искусственного шелка, которые были вращаться волокон, с помощью обычных мокрого прядения и сухой спиннинг процессов3,4, которые не принимают во внимание жидкости сил, возникающих в воздуховоде спиннинг.

Во-первых microfluidic подходы были использованы для расследования Ассамблея шелковыми белками5,6. Затем изготовление microfluidic RSF было исследовано через моделирование режа и объемные силы7,8. Модуль упругости Юнга и диаметр RSF волокон могут быть настроены путем microfluidic мокрого прядения, но прочности Рисованные волокна было меньше, чем 100 МПа7. Наконец высокая прочность волокон RSF успешно были подготовлены с использованием метода microfluidic сухой спиннинг, но диаметр волокна составляет только 2 мкм8. Недавно microfluidic мокрого прядения успешно использовалась в производстве высокопрочных рекомбинантных паук шелковые волокна. Рисунок после спиннинг в воздухе улучшена поверхностных и внутренних дефектов искусственного волокна9.

В этом исследовании внедрена Улучшенная microfluidic спиннинг процесс RSF волокна. Она призвана имитировать процесс прядения шелк шелкопряда, включая спиннинг допинг, стрижка силы и процесс сухой спиннинг. Этот метод спиннинг не только может производить высокой прочности искусственный шёлк, но также может регулировать диаметр волокна. Во-первых RSF, спиннинг допинг стриженый и вытянутые в биомимик канала второго порядка экспоненциального распада. Во-вторых в процесс сухой спиннинг microfluidic10изучались влияет относительная влажность (RH) на волокна морфологии и свойства. По сравнению с обычными спиннинг прядильная, наша система microfluidic крайне biomimetic и может использоваться для производства высокопрочного волокна из растворов при температуре сухой или мокрой спиннинг метод.

Благодаря высоким разрешением, высокая яркость и высокоэнергетического излучения синхротронного излучения рентгеновского она может использоваться для характеристики микроструктуры одного волокна с диаметром нескольких микрометров4,11 , 12 , 13 , 14. здесь, SR-WAXD техника использовалась для расчета кристалличности, размер кристаллитов и кристаллической ориентации волокон RSF.

протокол

внимание: пожалуйста, проконсультируйтесь с все соответствующие паспорта безопасности материалов перед использованием. Некоторые из химических веществ, используемых при подготовке литье острой токсичностью. Пожалуйста, используйте средства индивидуальной защиты (очки, перчатки, лаборатории пальто, брюки полная длина и закрыты носок туфли).

1. Microfluidic спиннинг RSF водный раствор

  1. , Подготовка RSF водный спиннинг допинг 4 , 15 16
    1. Degumming шелкопряда кокон
      1. Degum Тутовый шелкопряд коконы дважды в Na 2 CO 3 водные растворы (0,5 wt % в воде) при 100 ° C на 30 минут, а затем вымыть шелка с дейонизированной водой, чтобы удалить Серицин.
    2. Dissolving кокон шелкопряда вываренную
      1. сухой вываренную кокон шелков в воздухе; затем растворить шелка вываренную кокон в водном растворе LiBr 9,0 М с соотношением 1:10 (w/v) при 40 ° C на 2 ч. Например, добавить 10 мл LiBr на 1 грамм шелка ( рис. 1a).
    3. Centrifuging и фильтрация
      1. разбавить раствор RSF в 1,5 раза, деионизированной водой. Центрифуги и фильтр для удаления примесей. Центрифуга RSF решение в 250 мл бутылки на 4 ° C для 10 мин на 1,234.8 x g. фильтр RSF решения с помощью 20 мкм фильтром и вакуумного насоса. Двойной фильтр бумага кровать предпочтительно, учитывая эффект экспериментирования.
    4. Dialyzing
      1. Dialyze RSF решение в деионизированной воде на 5 ° C в течение 3 дней, с использованием полупроницаемой мембраной целлюлозы (MWCO: 14 000 ± 2000). Общий объем RSF раствора составляет около 1 Л, загруженной в 4 пакетика диализа. Положите эти мешки диализа в ведро, который заполняется с 10 L обратный осмос (RO) деионизированная вода.
        Примечание: Значение пэ-аша деионизированной воды должно быть выше, чем 6, чтобы избежать гелеобразования во время процесса концентрации. РН деионизованной воды не требуют регулировки для этого протокола.
    5. Сосредоточение
      1. конденсируется RSF водный раствор 20 wt % путем принудительного воздуха на 5 ° C. Добавить 3 M CaCl 2 водный раствор в RSF решение 1.0 ммоль/г Ca 2 + конечная концентрация; затем сосредоточиться, Принуждённая циркуляция воздуха поток для 38-47 wt %.
      2. Весить одну каплю раствора RSF на стеклянное скольжение и затем высушить его на 2 часа в духовке при температуре 105 ° C.
        Примечание: Вес процент оставшихся твердых по сравнению с веса капли, прежде чем сушки является общая концентрация белка и 2 CaCl. RSF концентрации происходит после вычета массы CaCl 2. По крайней мере четыре повторные измерения были выполнены. Наши предыдущие исследования показали, что концентрации Ca 2 + значительно сказывается на реологические свойства и spinnability водных растворов RSF. Тем временем добавлением Ca 2 + побудило ограниченное образование β-листа и агрегирование RSF 17. В родной спиннинг дурмана CaCl 2 считается играть важную роль во время хранения спиннинг допинг, чтобы избежать гелеобразования перед спиннинг. 18
  2. Подготовка microfluidic чип 8 , 19
    1. Подготовка photomask
      1. Дизайн в микро канал Программы CAD. Печатать файл CAD производить высокого разрешения прозрачности 19.
    2. Подготовка плесени
      1. очистки стекла слайд
        1. в химической капот, варить стеклянное скольжение в смешанных решение концентрированной серной кислоты и 30 vol % раствором перекиси водорода (10:1) для 20 мин на горячей плите.
          Предупреждение: паров серной кислоты и перекиси водорода чрезвычайно токсичны.
      2. Мойки стекла слайд
        1. мыть стекла слайд с помощью деионизированной воды и сушить с высокой чистоты азота.
      3. Покрытие пленкой
        1. пальто Су-8 фоторезиста на стеклянное скольжение по плану покрытие устройством с разрывом 100 мкм между нижней поверхности панели покрытия и верхней поверхности стекла.
      4. Спина покрытие
        1. распространение фоторезиста на стеклянное скольжение сформировать равномерную пленку с помощью coater спин на 40.3 x g 30 s. Толщину равномерную пленку составляет около 85 мкм.
      5. Кристаллизации
        1. затвердеть фоторезиста в духовку с температурой управление программы. Повышение температуры от комнатной температуры до 65 ° C на 2 ° C/мин и удерживайте при 65 ° C на 2 мин продолжить тепла от 65 ° C до 95° C и удерживайте на 95 ° C на 15 мин поворот от печи и прохладный естественно комнату Температура в печи.
      6. Ультрафиолетового освещенности
        1. Expose стороне стекла слайд с фоторезиста ультрафиолетового света для 12 s с помощью прозрачности как photomask фотолитографии 19.
          Примечание: Волновое ультрафиолетового света-365 Нм и воздействия энергии является 273.6 МДж/см 2.
          Предупреждение: Принимать меры надлежащей безопасности во время работы с УФ-излучения и духовки.
      7. Затвердеть фоторезиста, как описано в шаге 1.2.2.5.
      8. Развивающихся
        1. очистить фоторезиста ультразвука в разработчик решения 30 s. омыватель стекла слайд, изопропиловый спирт и разработчик, чередующихся между ними, пока нет никаких осадков на стеклянное скольжение.
      9. Затвердеть фоторезиста в духовку с температурой управление программы. Повышение температуры от комнатной температуры до 170 ° C на 2 ° C/мин и удерживайте на 170 ° C на 30 мин поворот от печи и прохладный естественно до комнатной температуры в печи.
    3. Мягкой литография
      1. залить 8,8 g жидких полидиметилсилоксан (PDMS) предварительно полимер плесени и лекарство от 30 мин при температуре 65 ° C, и 15 мин на 80 ° C. жидкое PDMS предварительно полимер состоит из PDMS и отвердителя (обычно на 10:1 (w/w)).
    4. Груши
      1. Punch отверстие через PDMS реплики в начале канала на дрель. Диаметр сверла-1,2 мм.
    5. Уплотнительная
      1. Печать PDMS реплики с каналом в плоский слой PDMS без шаблона, плазменной очистки кислорода на поверхности двух слоев PDMS.
        Примечание: Общий процесс подготовки чипа занимает около 72 ч.
  3. Изготовления RSF волокна
    1. инъекции спиннинг допинг
      1. Inject RSF, спиннинг допинг в микроканальные 2 мкл/мин с помощью насоса шприца.
    2. Окружающей среды регулирования
      1. отрегулировать относительной влажности 40 ± 5 RH % или 50 ± 5 RH %, с использованием увлажнителя. На RH 40 ± 5%, как прядения волокна затвердевших более быстро, чем 50 ± 5 RH %.
    3. Производство RSF волокна
      1. Touch RSF падение на платформе pinpoint на выходе канала microfluidic, рисовать RSF волокна в воздух и затем катушки на ролик через 10 см зазора со скоростью 3 см/сек ( рисунок 1b ).
    4. Хранить RSF волокон в запечатанном Эксикатор за 24 ч.
    5. Волокна после лечения
      1. привлечь как прядения волокна 4 раза на 0,9 мм s -1 в 80 vol % ethanoл раствора на заказ машины, а затем сохранить Рисованные волокна фиксированной и погружать волокон в решение за 1 час. Из-за этого лечения, длина волокна было изменено от первоначально 15 мм до 60 мм.
    6. Подготовка образца для характеризации
      1. исправить пост обработанных волокон на раме бумаги с длиной 10-мм калибр. По крайней мере 20 волокна являются необходимость измерения, включая испытания на растяжение, SEM, ФУРЬЕ и рассеяния. Диаметры пост Рисованные волокна диапазоне от 5 до 10 мкм. рис. 1 показана схема производства волокна и WAXD характеристика. Механические свойства волокон RSF были рассмотрены материальной системы тестирования (25 ± 2) ° C и (45 ± 5) % относительной влажности. Расширение оценить и контрольными точками были соответственно 2 мм/мин и 1 см,.

2. Синхротронного излучения характеризация кристаллической структуры RSF волокна

  1. синхротронного излучения характеристика 4 , 13 , 17
    1. Регулировка излучение
      1. соответственно скорректировать волны рентгеновского и размера пятна 0.07746 Нм и 2 3 x 2 мкм,.
        Примечание: Протокол выполняется с помощью BL15U1 излучение на объекте синхротронного излучения Шанхая.
    2. Расположение рентгеновского пятно
      1. найти местоположение месте рентгеновского.
        Примечание: Расположение рентгеновского месте регулируется лаборант на объекте синхротронного излучения.
    3. Тестирование стандартного образца: диоксид церия (Генеральный директор 2)
      1. Тест 2 порошок CeO стандартного образца. 2 порошок CeO характеризовался для вычисления центра окружности и расстояние от образца до детектора.
    4. Пробоподготовки
      1. исправить RSF нитей параллельно друг с другом на раме бумаги с колеи длиной 10 мм. Клей бумаги кадр на этапе тестирования.
        Примечание: Держите волокна горизонтально.
    5. Испытаний SR-WAXD
      1. Открыть затвор
        1. Закрыть дверь на излучение станции после того, что существует не человек в комнате. Откройте затвор рентгеновского пучка источника.
      2. Фокусировки
        1. переместить волокна слегка, пока не в фокусе. Настроить расположение волокон вдоль x, y, z направлении удаленно через программное обеспечение ( рис. 1 c).
      3. Образец экспозиции
        1. перемещения волокна вверх и вниз удаленно через программное обеспечение, до тех пор, пока он находится на месте, рентген. Нажмите кнопку Пуск на программное обеспечение, чтобы разоблачить волокна рентгеновское излучение для 20 s ( рис. 1 c).
      4. Фон дифракции
        1. тест дифракции на фоне воздуха с выдержкой 20 s. перемещения волокна от рентгеновского пятно удаленно через программное обеспечение. Пресс " начало " кнопку на программное обеспечение, чтобы разоблачить рентгеновское излучение в " воздушной среды " для 20 s.
  2. Обработки данных SR-WAXD 13
    1. калибровки программного обеспечения
      1. обработки данных WAXD с помощью FIT2D (V12.077). Калибровка центра окружности и расстояние образца детектор с использованием данных дифракции порошок CeO 2.
    2. 2-D дифракционной картины
      1. вычитание фона воздуха из волокна дифракционный рисунок с помощью FIT2D (V12.077).
    3. Кристалличность и кристаллитов размер
      1. интегрировать дифракции света как функция рассеяния угла 2θ. Выполните деконволюция интенсивность интеграции автоматизированной пик разделения программного обеспечения (версия 4.12) 12. Степень кристалличности, x c, оценивалась от отношения:
        figure-protocol-11530
        , где я c представляет собой совокупность интегрированных интенсивности кристаллические пики и я является комплексной интенсивность аморфного halo 4 , 11. Интеграция моделей WAXD показал ширину пик [200], [020], [002] размышления. FWHM этих пиков, были использованы для определения размера кристаллитов вдоль, b и c осей с помощью Шеррер ' s формула 4.
    4. Определение ориентации кристаллитов
      1. вычисления ориентации кристаллитов и аморфных согласно азимутальной внедрений (020) и (210) пики 11. Кристаллической ориентации можно рассчитать количественно с Герман ' s ориентации. Здесь, как (020) и (210) пики были оборудованы две функции Гаусса. Короче один кристаллической ориентации и другой широкой является для ориентированных на аморфных материалов 13. Здесь, ориентации кристаллитов RSF волокон были по сравнению с использованием полную ширину в половина максимума (FWHM) пиков азимутальной интеграции (002).

Результаты

Высокая прочность волокон RSF успешно были произведены используя microfluidic спиннинг метод. Кривых напряжение деформация и SEM изображения растягивается RSF волокон C44R40 показано на рисунке 2. По крайней мере 10 волокна были измерены в испытания на растяжение. К...

Обсуждение

Во время диализа RSF раствор рН имеет решающее значение для следующего процесса концентрации. Если значение пэ-аша обессоленной воды меньше, чем 6, RSF решение будет легче гель во время процесса концентрации. Чтобы избежать гелеобразования, CaCl2 добавляется в решение RSF. Концентрация Ca...

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Эта работа финансируется Фонд национального естественных наук Китая (21674018), Национальный исследовательский ключ и Программа развития Китая (2016YFA0201702 /2016YFA0201700) и программа «Шугуан», поддержке развития образования Шанхай Фонд и Шанхай муниципального образования Комиссии (15SG30), DHU отличать молодой профессор программы (A201302), фондов фундаментальных исследований для университетов Центральной и 111 проекта (№ 111-2-04).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
B. mori CocoonsFarmer in Tongxiang, Zhejiang Province, China
Sodium carbonate, anhydrous, 99.8%Shanghai Lingfeng Chemical Reagent Co., Ltd., ChinaAnalytically Pure
Lithium bromide, 99.1%Shanghai China Lithium Industrial Co., Ltd., ChinaAnalytically Pure
Calcium chloride, anhydrous, 96.0%Shanghai Lingfeng Chemical Reagent Co., Ltd., ChinaAnalytically Pure
Ethanol, anhydrous, 99.7%Sinopharm Group Chemical Reagent Co.,Ltd., China10009218Analytically Pure
SU-8 photoresistMicroChem Corp., USA
Developing solutionMicroChem Corp., USA
Sylgard 184Dow Corning, USA
IsopropanolShanghai Lingfeng Chemical Reagent Co., Ltd., ChinaAnalytically Pure
Concentrated sulfuric acidPinghu Chemical Reagent Factory, ChinaAnalytically Pure
30 vol% hydrogen peroxideShanghai Jinlu Chemical reagent Co., Ltd., ChinaAnalytically Pure
AcetoneShanghai Zhengxing Chemical Reagent Factory, ChinaAnalytically Pure
Oxygen plasma treatmentDT-01, Suzhou Omega Machinery Electronic Technology Co., Ltd., China
Syringe pump KD Scientific, USAKDS 200P
HumidifierSEN electric
DrillerHangzhou Bo Yang Machinery Co., Ltd., Chinabench drilling machine Z406c
Material testing systemInstron, USAModel: 5565
PeakFitSystat Software, Inc., USAVersion 4.12

Ссылки

  1. Asakura, T., et al. Some observations on the structure and function of the spinning apparatus in the silkworm Bombyx mori. Biomacromolecules. 8 (1), 175-181 (2007).
  2. Vollrath, F., Knight, D. P. Liquid crystalline spinning of spider silk. Nature. 410 (6828), 541-548 (2001).
  3. Zhou, G. Q., Shao, Z. Z., Knight, D. P., Yan, J. P., Chen, X. Silk Fibers Extruded Artificially from Aqueous Solutions of Regenerated Bombyx mori Silk Fibroin are Tougher than their Natural Counterparts. Adv Mater. 21 (3), 366-370 (2009).
  4. Sun, M. J., Zhang, Y. P., Zhao, Y. M., Shao, H. L., Hu, X. C. The structure-property relationships of artificial silk fabricated by dry-spinning process. J Mater Chem. 22 (35), 18372-18379 (2012).
  5. Martel, A., et al. Silk Fiber Assembly Studied by Synchrotron Radiation SAXS/WAXS and Raman Spectroscopy. J Am Chem Soc. 130 (50), 17070-17074 (2008).
  6. Rammensee, S., Slotta, U., Scheibel, T., Bausch, A. R. Assembly mechanism of recombinant spider silk proteins. P Natl Acad Sci USA. 105 (18), 6590-6595 (2008).
  7. Kinahan, M. E., et al. Tunable silk: using microfluidics to fabricate silk fibers with controllable properties. Biomacromolecules. 12 (5), 1504-1511 (2011).
  8. Luo, J., et al. Tough silk fibers prepared in air using a biomimetic microfluidic chip. Int J Biol Macromol. 66, 319-324 (2014).
  9. Peng, Q. F., et al. Recombinant spider silk from aqueous solutions via a bio-inspired microfluidic chip. Sci Rep. 6, (2016).
  10. Peng, Q. F., Shao, H. L., Hu, X. C., Zhang, Y. P. Role of humidity on the structures and properties of regenerated silk fibers. Prog Nat Sci-Matter. 25 (5), 430-436 (2015).
  11. Sampath, S., et al. X-ray diffraction study of nanocrystalline and amorphous structure within major and minor ampullate dragline spider silks. Soft Matter. 8 (25), 6713-6722 (2012).
  12. Martel, A., Burghammer, M., Davies, R. J., Riekel, C. Thermal Behavior of Bombyx mori silk: Evolution of crystalline parameters, molecular structure, and mechanical properties. Biomacromolecules. 8 (11), 3548-3556 (2007).
  13. Pan, H., et al. Nanoconfined crystallites toughen artificial silk. J Matter Chem B. 2 (10), 1408-1414 (2014).
  14. Zhang, C., et al. Microstructural evolution of regenerated silk fibroin/graphene oxide hybrid fibers under tensile deformation. Rsc Adv. 7 (6), 3108-3116 (2017).
  15. Wei, W., et al. Bio-inspired capillary dry spinning of regenerated silk fibroin aqueous solution. Mat Sci Eng C-Mater. 31 (7), 1602-1608 (2011).
  16. Jin, Y., Zhang, Y. P., Hang, Y. C., Shao, H. L., Hu, X. C. A simple process for dry spinning of regenerated silk fibroin aqueous solution. J Mater Res. 28 (20), 2897-2902 (2013).
  17. Jin, Y., Hang, Y. C., Zhang, Y. P., Shao, H. L., Hu, X. C. Role of Ca2+ on structures and properties of regenerated silk fibroin aqueous solutions and fibres. Mater Res Innov. 18, 113-116 (2014).
  18. Koh, L. D., et al. Structures, mechanical properties and applications of silk fibroin materials. Prog Polym Sci. 46, 86-110 (2015).
  19. McDonald, J. C., Whitesides, G. M. Poly(dimethylsiloxane) as a material for fabricating microfluidic devices. Accounts Chem Res. 35 (7), 491-499 (2002).
  20. Knight, D. P., Vollrath, F. Liquid crystals and flow elongation in a spider's silk production line. P Roy Soc B-Biol Sci. 266 (1418), 519-523 (1999).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

127biomimeticmicrofluidic

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены