미세 드라이 회전 및 재생성된 실크 Fibroin 섬유의 특성

요약

미세 회전 및 재생성된 실크 fibroin monofilament의 미세 특성화에 대 한 프로토콜 제공 됩니다.

초록

프로토콜 누의 회전 과정을 흉내 낸에 대 한 메서드를 보여 줍니다. 기본 회전 과정에서 계약 회전 덕트 실크 단백질을 콤팩트 하 고 전단 및 신장 힘에 의해 정렬 될 수 있습니다. 여기, biomimetic 미세 채널 누의 회전 덕트의 특정 기하학을 모방 하도록 설계 되었습니다. 재생성 된 실크 fibroin (RSF) 회전 높은 농도, 첨가 온도 압력에서 드라이 스핀 섬유 아닌 통해 돌출 했다. 사후 처리 과정에서로 냈 지 섬유 했다 그려지고 에탄올 용액에 저장 됩니다. 싱크 로트 론 방사선 광각 x 선 회절 (SR-WAXD) 기술은 RSF 섬유 축 x-레이의 microbeam에 샘플 홀더를 고정 하는 단일 RSF 섬유의 미세를 조사 하기 위해 사용 되었다. 화도, crystallite 크기 및 결정 방향 섬유의 WAXD 데이터에서 계산 했다. 2 차원 WAXD 패턴의 적도 근처 회절 호 사후 처리 RSF 섬유 높은 방향 정도 나타냅니다.

서문

거미 및 누 주위 온도 압력에서 수성 단백질 해결책에서 뛰어난 실크 섬유를 생산할 수 있다. 전단 및 extensional 흐름 실크 동맥¹액정 텍스처의 형성을 유도할 수 있다. 최근 몇 년 동안, 고 강도 인공 섬유를 생산 하기 위해서는 거미의 회전 과정을 흉내 낸에 큰 관심이 되었습니다. 그러나, 거미 실크 단백질의 대량 수 없습니다 효율적이 고 경제적으로 의해 생산 농업 식인 풍습으로 인해 거미. 상당한 양의 누 실크는 농업에 의해 쉽게 얻어질 수 있다. 그렇지 않으면, 누와 거미 유사한 회전 과정과 아미노산 성분이 있다. 따라서 누 실크 fibroin 선택 대신 인공 동물 실크 스핀 많은 연구자에 의해.

거미 및 누에에서 섬유에 그들의 회전 덕트를 통해 단백질 해결책을 압출 성형. 가장 가능성이 회전 덕트를 따라 생성 높은 스트레스 힘 더 확장 구조²실크 fibroin 분자 스트레칭. 인공 실크 섬유 기존의 젖은 회전 및 회전 건조 프로세스^3,4, 고려 하지 않는 사용 하 여 회전 된 유체 힘 회전 덕트에서 생성 된 계정.

첫째, 미세 접근 실크 단백질^5,6의 어셈블리를 조사 하기 위해 사용 되었다. 다음, RSF의 미세 제조 전단 및 extensional 세력^7,8모델링을 통해 연구 했다. 영의 계수 및 RSF 섬유의 직경이 미세 젖은 회전에 의해 조정 될 수 있다 하지만 그려진된 섬유의 인장 강도 100 MPa⁷. 마지막으로, 고 강도 RSF 섬유 미세 드라이 회전 메서드를 사용 하 여 성공적으로 준비 하지만 섬유의 직경은 2 µ m⁸만. 최근, 미세 젖은 회전 강도 재조합 거미 실크 섬유의 생산에서 성공적으로 사용 되었다. 공기에서 후 회전 그리기⁹인공 섬유 표면 및 내부 결함 개선.

이 연구에서는 향상 된 미세 회전 RSF 섬유에 대 한 과정 소개 된다. 그것은 회전 마약, 전단 세력, 그리고 드라이 회전 과정을 포함 하 여 누 실크 회전 과정을 모방 하는 것을 목표로. 이 회전 방법은 고 강도 인공 실크 섬유를 생산할 수 있다 뿐만 아니라 또한 섬유의 직경을 조정할 수 있습니다. 첫째, RSF 마약 회전 전단 이었고 두 번째 순서 지 수 감퇴와 biomimic 채널에 길쭉한. 둘째, 섬유 형태와 속성에 상대 습도 (RH)의 영향 미세 드라이 회전 과정¹⁰에서 공부 했다. 기존의 회전 spinneret에 비해, 우리의 미세 시스템 높은 생체 모방 이며 건조 하 여 주위 온도에 솔루션에서 고 강도 섬유를 생산 또는 회전 방법 젖은 사용할 수 있습니다.

때문에 고해상도, 고휘도, 고 에너지 싱크 로트 론 방사선 미소 초점 x 선의를 사용할 수 있습니다 몇 마이크로미터^4,11 의 직경을 가진 단 하나 섬유의 미세 하 ^{, 12 , 13 , 14}. 여기, SR WAXD 기술은 화도, crystallite 크기 및 RSF 섬유의 결정 방향 계산에 사용 되었다.

프로토콜

주의: 사용 하기 전에 모든 관련 물질 안전 데이터 시트를 참조 하십시오. 성형을 준비에 사용 되는 화학 물질의 일부는 심하게 독성이 있습니다. 개인 보호 장비 (안전 안경, 장갑, 실험실 코트, 전장 바지 및 폐쇄 발가락 신발)를 사용 하십시오.

1. 미세 회전의 RSF 용액

준비의 RSF 마약 회전 수성 ^{4 , 15 ,}

¹⁶
1. Degumming 누의
   1. Degum 누에나방 고치 나 ₂ CO ₃ 수성 솔루션 (물에 0.5 wt %)에 두 번 30 분 각, 100 ° C에서 누에고치 및 다음 제거 하는 이온된 수와 실크를 씻는 sericin.
2. Dissolving 반죽 누 누에고치의
   1. 건조 한 공기에 반죽 누에고치 실크; 다음 9.0 M LiBr 수 용액 1:10 (w/v) 40 ° C에서 2 h의 비율에 반죽 누에고치 실크 분해. 예를 들어 1 그램 실크 ( 그림 1a) 당 10 mL LiBr 추가.
3. Centrifuging와 필터링
   1. RSF 솔루션 1.5 배 이온을 제거 된 물에 의해 희석. 원심 분리기 및 불순물을 제거 하는 필터 1,234.8 x g.에서 10 분 원심 분리기 4 ° C에서 250 mL 병에 RSF 솔루션 RSF 솔루션 20 µ m 필터와 진공 펌프를 사용 하 여 필터링 합니다. 더블 필터 종이 침대는 실험 효과 고려 하는 것이 좋습니다.
4. Dialyzing
   1. 룰 반 투과성 멤브레인을 사용 하 여 3 일 동안 5 ° C에서 이온된 수에 RSF 솔루션 Dialyze (MWCO: 14000 ± 2000). RSF 솔루션의 전체 볼륨은 약 1 L, 4 투 석 가방에 로드. 이 투 석 가방 양동이에 넣어는 10 L 역삼 투 (RO)으로 가득 저온.
      참고: 이온된 수의 pH 값을 집중 과정에서 겔 화를 피하기 위해 6 보다 높아야 한다. 이 프로토콜에 대 한 이온된 수의 pH 조정을 요구 하지 않았다.
5. 집중
   1. 응축 RSF 20 wt % 용액 5 ° C. 추가 3 M CaCl ₂ 수성 해결책에서 강제적인된 공기에 의해 1.0 mmol/g 캘리포니아 ^{2 +} 최종 농도; RSF 솔루션 다음 강제적인된 공기에 의해 집중 38-47 wt % 흐름.
   2. 유리 슬라이드에 한 방울 RSF 솔루션의 무게와 다음 오븐 105에서 2 h 동안 건조 ° c.
      참고: 무게 백분율 남은 고체 단백질과 CaCl ₂의 총 농도 건조 하기 전에 드롭의 무게에 비해. RSF 농도 CaCl ₂의 질량의 공제 후 파생 됩니다. 적어도 4 개의 반복 측정 수행 했다. 우리의 이전 연구의 캘리포니아 ^{2 +} 농도 크게 유 변 학적 특성 및 RSF 수성 해결책의 spinnability 영향을 보여주었다. 한편, 캘리포니아 ^{2 +}의 추가 β 시트의 제한 형성과 RSF ¹⁷의 집계 라는 메시지가 나타납니다. 기본 회전 마약 CaCl ₂ 회전 하는 회전 하기 전에 겔 화를 피하기 위해 마약의 저장 하는 동안 중요 한 역할을 간주 됩니다. ¹⁸
1. 미세 칩의 준비 ^{8 , 19}
   1. 포토 마스크를 준비
      1. 에 마이크로 채널을 디자인 한 CAD 프로그램입니다. 고해상도 투명도 ¹⁹를 생산 하기 위해 CAD 파일 인쇄.
   2. 금형 준비
      1. 청소 유리 슬라이드
         1. 화학 후드에 끓인 뜨거운 접시에 집중된 한 황산의 혼합된 솔루션 및 30 vol % 과산화 수소 솔루션 (10:1) 20 분 동안 유리 슬라이드.
            주의: 황산과 과산화 수소 증기는 매우 유독.
      2. 세척 유리 슬라이드
         1. 이온된 수를 사용 하 여 유리 슬라이드를 세척 하 고 건조 고 순도 질소로 불어.
      3. 코팅 필름
         1. SU-8 포토 레지스트 코팅 바의 아래쪽 면과 유리의 위 표면 사이 100 µ m의 간격으로 맞춤식 코팅 장치에 의해 유리 슬라이드에 코트.
      4. 스핀 코팅
         1. 30 40.3 x g에서 spin coater를 사용 하 여 균일 한 필름을 형성 하기 위하여 유리 슬라이드에 포토 레지스트를 확산 s. 균일 한 필름의 두께 약 85 µ m.
      5. 응고
         1. 프로그램 제어 온도 오븐에 포토 레지스트를 공고히. 실 온에서 2 ° C/min에서 65 ° C에 온도 상승 고 잡고 2 분 계속 65 ° C에서 열에 65 ° C ~ 95 ° C에서에서 누른 95 ° C 오븐과 멋진 15 분 회전에서 자연스럽 게 방 오븐에 온도.
      6. 자외선 빛 노출
         1. 노출 유리의 측 12 자외선에는 포토 레지스트와 슬라이드 사진 평판 ¹⁹는 포토 마스크로 투명도 사용 하 여 s.
            참고: 자외선의 wavenumber는 365 nm와 노출 에너지는 273.6 mJ/cm ².
            주의: UV 빛 및 오븐 작업 하는 동안 적절 한 안전 조치를 취할.
      7. 1.2.2.5 단계에서 설명한 대로 포토 레지스트를 공고히.
      8. 개발
         1. 30 미 세척 소 프로 파 놀과 유리 슬라이드에 없습니다 강 수 있을 때까지 둘 사이 번갈아 하는 개발자에 의해 유리 슬라이드에 대 한 개발자 솔루션에 초음파 레지스트 청소.
      9. 프로그램 제어 온도 오븐에 포토 레지스트를 공고히. 실 온에서 2 ° C/min에서 170 ° C 온도 상승 하 고 170 ° C 오븐과 멋진 30 분 설정에서 자연스럽 게 실내 온도에 오븐을.
   3. 소프트 리소 그래피
      1. 형과 65 ° C에서 30 분 동안 치료 8.8 g 액체입니다 (PDMS) 사전 폴리머 붓는 고 80 ° C. 액체 PDMS 사전 폴리머에서 15 분 PDMS와 경화제 (10:1 (w/w))에서 일반적으로 이루어져 있다.
   4. 펀치
      1. 드릴 여 채널의 시작 부분에서 PDMS 복제를 통해 구멍을 펀치. 드릴의 직경은 1.2 m m.
   5. 씰링
      1. 두 PDMS 층의 표면에는 산소 플라즈마 처리에 의해 패턴 없이 평면 PDMS 레이어 채널 PDMS 복제 인감.
         참고: 칩의 전반적인 준비 과정은 약 72 h.
2. RSF의 제조 섬유
   1. 마약 회전의 주입
      1. 아닌 2 µ L/분으로 마약 주사기 펌프에 의해 회전 하는 RSF 주사.
   2. 환경 규제
      1. 조정 40 ± 5 상대 습도 RH % 또는 50 ± 5 가습기를 사용 하 여 RH %. 40 ± 5 RH에서 %로-돌 다 섬유 경화 50 ± 보다 더 빨리 5 RH %.
   3. 생산의 RSF 섬유
      1. 미세 채널의 출구에 정확 하 게에 의해 RSF 드롭 터치, RSF 섬유 공기, 그리고 다음 ( 그림 1b 3 cm/s의 속도로 10 cm 공기 차이 통해 롤러에 릴 ).
   4. 24 헤에 대 한 봉인된 desiccator에 RSF 섬유를 저장
   5. 섬유 후 처리
      1. 80 vol %ethano 0.9 m m s ^-1에서 4 번으로 늘인 섬유를 그릴사용자 컴퓨터 및 다음 계속 그려진된 섬유에 의해 l 솔루션 고정 하 고 1 시간에 대 한 솔루션에 섬유를 담가. 이 치료 때문에 섬유의 길이 60 m m로 원래 15 m m에서 변경 되었습니다.
   6. 특성화에 대 한 샘플 준비
      1. 10 mm 게이지 길이와 사후 처리 섬유 종이 프레임에 수정. 적어도 20 섬유 측정, 인장 시험, SEM, FTIR, WAXS에서 포함에 대 한 필요는. 이후 그려진된 섬유 범위 5에서 10 µ m. 그림 1의 직경의 섬유 생산 및 WAXD 특성화 회로도 보여준다. RSF 섬유의 기계적 성질 (25 ± 2) ° C 소재 테스트 시스템 및 (45 ± 5) % 상대 습도 의해 시험 되었다. 확장 속도 및 게이지 길이 2 mm/min와 1 ㎝를 각각 했다.

2. 싱크 로트 론 방사선 특성의 결정 구조의 RSF 섬유

1. 싱크 로트 론 방사선 특성 ^{4 , 13 , 17}
   1. beamline
      1. 의 조정 조정 엑스레이 및 0.07746 nm을 ², 3 x 2 µ m 크기의 파장 각각.
         참고: 프로토콜 BL15U1 beamline 상해 싱크 로트 론 방사선 시설에서 사용 하 여 수행 됩니다.
   2. X 선 스팟의 위치
      1. x 선 스팟의 위치 찾기.
         참고: x 선 스팟의 위치는 싱크 로트 론 방사선 시설에서 실험실 기술자에 의해 조정 됩니다.
   3. 표준 샘플의 테스트: 세 륨 산화물 (CeO ₂)
      1. 표준 샘플 CeO ₂ 분말을 테스트. 원 센터와 검출기에는 샘플에서 거리를 계산 하기 위해 CeO ₂ 분말 특징 이었다.
   4. 샘플 준비
      1. 10mm 게이지 길이 종이 프레임에 서로 병행에서 RSF 필 라 멘 트를 수정. 테스트 단계에 종이 프레임 접착제.
         참고: 섬유를 수평 유지.
   5. SR WAXD 테스트
      1. 셔터를 열고
         1. 방에 아무 사람은 확인 후 beamline 역의 문을 닫습니다. X 선 빔 소스의 셔터를 열고.
      2. 초점
         1. 초점에 때까지 약간 섬유를 이동. X, y, z 방향 ( 그림 1c) 소프트웨어를 통해 원격으로 섬유의 위치 조정.
      3. 노출 샘플
         1. 이동 섬유 아래로 원격으로 소프트웨어를 통해 때까지 x 선 자리에. 20 x 선 beamline에 섬유를 노출 하는 소프트웨어에 시작 버튼을 누르면 s ( 그림 1c).
      4. 회절 배경
         1. 테스트는 소프트웨어를 통해 원격으로 20 s. 이동 x 선 자리에서 섬유의 노출 시간 공기 배경의 회절. 보도 " 시작 "에 x 선 beamline 노출 소프트웨어에 단추 " 공기 매체 " 20 s.
2. SR WAXD 데이터 처리 ¹³
   1. 소프트웨어 보정
      1. FIT2D (V12.077)를 사용 하 여 WAXD 데이터 처리. 원 센터와 샘플-검출기-CeO ₂ 분말의 회절 데이터를 사용 하 여 거리를 보정.
   2. 2 차원 회절 패턴
      1. FIT2D (V12.077)를 사용 하 여 섬유 회절 패턴에서 공기 배경 빼기.
   3. 화도 및 crystallite 크기
      1. 산란 각도 2θ의 기능으로 회절 강도 통합. 자동된 피크 분리 소프트웨어 (버전 4.12) ¹² deconvolution 강도 통합을 수행 합니다. 화도, _c, x의 정도 관계에서 추정 되었다:
         
         , 어디 내가 _c 결정 봉우리와의 통합된 강렬의 합계는 비정 질 헤일로 ^{4 , 11}의 통합된 강도 이다. WAXD 패턴의 통합 [200]의 피크 폭을 보여주었다, [020], [002] 반사. 이 봉우리의 FWHM 따라 crystallite 크기를 결정 하는 데 사용 했다는 a, b 및 c 축 Scherrer를 사용 하 여 ' s 수식 ⁴.
   4. Crystallite 방향 결정
      1. 는 crystallite의 방향을 계산 하 고 비정 질 (020)의 방위 통합 및 (210) 봉우리 ¹¹. 결정 방향 허먼 따라 양적으로 계산할 수 있다 ' s 방향. 여기, 모두 (020) 및 (210) 봉우리 두 가우스 기능을 장착 했다. 좁은 한 결정 방향 이며 다른 광범위 한 지향된 비정 질 소재 ¹³입니다. 여기, RSF 섬유의 crystallite 방향 방위 통합 (002) 피크의 절반 최대 (FWHM)에 전체 너비를 사용 하 여 비교 했다.

결과

고 강도 RSF 섬유 미세 회전 메서드를 사용 하 여 성공적으로 생산 되었다. 응력-변형 곡선 및 뻗어 RSF 섬유 C44R40의 SEM 이미지는 그림 2에 표시 됩니다. 적어도 10 섬유는 인장 시험에서 측정 되었다. 응력-변형 곡선 섬유의 주요 스트레스와 긴장의 평균 값에 따라 선택 되었다. 섬유의 WAXD 데이터는 그림 3에 나와 있습니다. 화도 및...

토론

RSF 솔루션의 투 석 동안 pH 값이 다음 농도 과정에 대 한 중요 합니다. 이온된 수의 pH 값이 6 보다 작은, RSF 솔루션 집중 과정에서 젤 쉬울 것 이다. 겔 화를 피하기 위해, CaCl₂ RSF 솔루션에 추가 됩니다. CaCl₂ 의 농도 1 mmol RSF의 무게 당.

우리의 이전 작품의 미세 드라이-⁸RSF 수성 해결책 가능성을 보여주었다. 미세 채널의 형상을 단순화 된 단일 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
B. mori Cocoons	Farmer in Tongxiang, Zhejiang Province, China
Sodium carbonate, anhydrous, 99.8%	Shanghai Lingfeng Chemical Reagent Co., Ltd., China		Analytically Pure
Lithium bromide, 99.1%	Shanghai China Lithium Industrial Co., Ltd., China		Analytically Pure
Calcium chloride, anhydrous, 96.0%	Shanghai Lingfeng Chemical Reagent Co., Ltd., China		Analytically Pure
Ethanol, anhydrous, 99.7%	Sinopharm Group Chemical Reagent Co.,Ltd., China	10009218	Analytically Pure
SU-8 photoresist	MicroChem Corp., USA
Developing solution	MicroChem Corp., USA
Sylgard 184	Dow Corning, USA
Isopropanol	Shanghai Lingfeng Chemical Reagent Co., Ltd., China		Analytically Pure
Concentrated sulfuric acid	Pinghu Chemical Reagent Factory, China		Analytically Pure
30 vol% hydrogen peroxide	Shanghai Jinlu Chemical reagent Co., Ltd., China		Analytically Pure
Acetone	Shanghai Zhengxing Chemical Reagent Factory, China		Analytically Pure
Oxygen plasma treatment	DT-01, Suzhou Omega Machinery Electronic Technology Co., Ltd., China
Syringe pump	KD Scientific, USA		KDS 200P
Humidifier	SEN electric
Driller	Hangzhou Bo Yang Machinery Co., Ltd., China		bench drilling machine Z406c
Material testing system	Instron, USA		Model: 5565
PeakFit	Systat Software, Inc., USA		Version 4.12