Проверка роли применим плазмид в эволюции антибиотикорезистентности

Резюме

Здесь мы представляем экспериментальный метод для проверки роли применим плазмид в эволюции к антибиотикам.

Аннотация

Применим плазмиды прокариот чрезвычайно изобилуют, но их роль в бактериальных эволюция по-прежнему осознаются. Недавно мы показали, что увеличение числа копии гена в ячейке, представленной применим плазмид может ускорить эволюцию генов плазмида кодировке. В этой работе мы представляем экспериментальная система для тестирования применим плазмид способность содействовать эволюции ген. С помощью простых молекулярной биологии методов, мы построили модель системы, где ген устойчивости к антибиотикам может быть вставлен в Escherichia coli MG1655, хромосомы или на применим плазмиды. Мы используем подход экспериментальной эволюции для распространения различных штаммов под все возрастающей концентрации антибиотиков и мы измеряем выживания бактериальных популяций с течением времени. Выбор антибиотиков молекулы и сопротивление гена — так, что ген может лишь придать сопротивление путем приобретения мутаций. Этот подход «эволюционная спасения» предоставляет простой метод для проверки потенциала применим плазмиды для содействия приобретению устойчивости к антибиотикам. На следующем шаге экспериментальной системы характеризуются молекулярные основы устойчивости к антибиотикам. Для выявления мутаций отвечает за приобретение антибиотикорезистентности мы используем глубокая секвенирования ДНК образцов, полученных из всего населения и клоны. Наконец чтобы подтвердить роль мутаций в гене под исследование, мы восстановить их в родительский фон и проверить сопротивление фенотип результате штаммов.

Введение

Устойчивость к антибиотикам у бактерий является серьезной медицинской проблемой¹. На фундаментальном уровне распространение устойчивости к антибиотикам болезнетворных бактерий является простой пример эволюции путем естественного отбора^2,3. Проще говоря, использование антибиотиков генерирует выбор для устойчивых штаммов. Ключевой проблемой в эволюционной биологии, поэтому, необходимо понять, какие факторы, которые влияют на способность развиваться устойчивость к антибиотикам бактериальных популяций. Выбор эксперименты появились как очень мощный инструмент для расследования эволюционной биологии бактерий, и это поле дало невероятные идеи в широкий спектр эволюционных проблемы^4,5,6. В экспериментальной эволюции бактериальных популяций, инициированных из одного родительского штамма серийно пассированной определенных и жестко контролируемых условиях. Некоторые мутации, происходящие во время роста этих культур увеличения бактериальной фитнес, и они распространяются через культур путем естественного отбора. В ходе эксперимента образцы населения периодически криогенно сохраняются для создания не развивается замороженных окаменелостей. Широкий ряд подходов может использоваться для характеристики развивается бактериальных популяций, но наиболее распространенными методами являются два фитнес анализов, которые измеряют развивались бактерий способность конкурировать против их далеких предков и всего генома, что используется для идентификации генетические изменения что адаптация привода. После новаторскую работу Ричард Ленский и коллеги^7,8, стандартный подход в экспериментальной эволюции был бросить вызов сравнительно небольшое количество реплицировать населения (обычно < 10) с адаптации к новой экологические проблемы, например новых источников углерода, температуры или хищных ФАГ.

Инфекции, вызванные устойчивых к антибиотикам бактерий стать большой проблемой, когда сопротивление является достаточно высоким, что это не возможно для увеличения концентрации антибиотиков для смертельными уровнями в тканях пациента. Поэтому врачи заинтересованы в что позволяет бактериям развиваться сопротивления для высоких доз антибиотиков, которые превышают этот порог концентрации антибиотиков, клинической точки останова. Как учиться это экспериментально? Если небольшое количество бактериальных популяций оспариваются с высокой дозы антибиотика, как в стиле Ленски эксперимент, то наиболее вероятный результат является что антибиотик будет диск все населения к вымиранию. В то же время если доза антибиотика, который используется низкий, ниже минимальной ингибирующее концентрации (MIC) штамма родителей, то маловероятно что бактериальных популяций будет развиваться клинически значимых уровней сопротивления, особенно если сопротивление влечет за собой большие издержки. Один компромисс между этими двумя сценариями заключается в использовании^10,9,эксперимент «эволюционная спасения»¹¹. В этом подходе, очень большое количество культур (обычно > 40) оспаривается с дозы антибиотиков, которые увеличивают над временем, обычно путем удвоения концентрации антибиотиков каждый день¹². Отличительной чертой этого эксперимента является, что население, которое не развиваться повышенное сопротивление будет управляться на вымирание. Большинство населения, которые оспариваются таким образом будет определяться вымерли, но незначительное меньшинство будет сохраняться меняющимися высокий уровень сопротивления. В этой статье мы покажем, как этот экспериментальный дизайн может использоваться для изучения применим плазмида вклад в развитие сопротивления.

Бактерии приобретают устойчивость к антибиотикам через два основных маршрутов, хромосомных мутаций и приобретение мобильных генетических элементов, главным образом плазмид¹³. Плазмиды играть ключевую роль в эволюции антибиотикорезистентности, потому что они способны переносить гены резистентности бактерий путем конъюгации^14,15. Плазмиды можно разделить на две группы в зависимости от их размера и биология: «маленькие», с высоким копии номер в бактериальной клетке и «большой», с низкой скопировать номер^16,17. Роль крупных плазмид в эволюции антибиотикорезистентности был хорошо документированы, потому что они включают сопряженных плазмиды, которые являются ключевыми факторами распространения сопротивления и сопротивления multi среди бактерий¹⁵. Малые применим плазмиды также чрезвычайно распространены в бактерии^17,18, и они часто код для генов антибиотикорезистентности¹⁹. Однако в меньшей степени была изучена роль малых применим плазмид в эволюции антибиотикорезистентности.

В недавней работе мы предложили, что применим плазмид может ускорить эволюцию генов, которую они несут путем увеличения скорости мутации гена из-за большего числа копии гена в ячейке¹². С штамм E. coli MG1655 и β-лактамаз гена бла_ТЭМ-1 с использованием экспериментальной модели было показано, что применим плазмид ускорить темпы появления мутаций ТЭМ-1, присвоении сопротивление третьего поколения Цефтазидим цефалоспоринов. Эти результаты показали, что применим плазмиды могут играть важную роль в эволюции к антибиотикам.

Здесь мы представляем подробное описание метода, мы разработали расследовать применим при посредничестве плазмида эволюции к антибиотикам. Этот метод имеет три различных этапа: во-первых, включение гена изучается в применим плазмида или хромосому бактерии хозяина. Во-вторых использование экспериментальной эволюции (эволюционной спасения) оценить потенциал различных штаммов адаптироваться к селективного давления. И в-третьих, определение молекулярные основы, лежащие в основе плазмид опосредованной эволюции, с помощью ДНК секвенирования и реконструкции подозреваемых мутации индивидуально в родительский генотипа.

Наконец хотя для изучения эволюции антибиотикорезистентности, был разработан протокол, описанные здесь, можно утверждать, что этот метод может быть вообще полезным для анализа эволюции инноваций, приобретена мутации в любой multicopy кодировке плазмид ген.

протокол

1. строительство экспериментальной системы кодирования генов антибиотикорезистентности

Примечание: Здесь E. coli MG1655 был использован в качестве получателя штамм генов антибиотикорезистентности плазмида или хромосома кодировке. Устойчивость к антибиотикам ген закодированы в хромосомы или применим плазмида в противном случае isogenic штамм (рис. 1).

1. Вставки антибиотикорезистентности гена в λ Фаговые интеграции сайта (attB)²⁰ хромосоме MG1655.
   1. Усилить 500 bp Лонг регионов по обе стороны от хромосомных attB сайта методом ПЦР. Используйте олигонуклеотиды YbhC-F (5'-CCTGTACCGTACAGAGTAAT-3') и attB-R (5'-GCCCGCCACCCTCCGGGCCGGTATAAAAAAGCAGGCTTCA-3') для левой гомологии региона и attB-F (5'-AGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTATACTAACTTGAGCGAAA-3') и YbhB/R (5'- TGGCGATAATATTTCACCGC-3') для правильный. Усилить гена сопротивления бла_ТЭМ-1 , с помощью грунтовки ТЭМ1 pBAD-F (5'-TGAAGCCTGCTTTTTTATACCGGCCCGGAGGGTGGCGGGC-3') и ТЭМ1 pBAD-R (5'-TTTCGCTCAAGTTAGTATAAGGAGCGGGCGCTAGGGCGCT-3'). Дизайн грунты с приблизительно 20 bp (в 5' конца) показаны взаимодополняемости на фрагмент, что собирается быть слиты в последовательности.
   2. Предохранитель гомологии регионов к антибиотикам ген продукт PCR (включая его промоутер региона) с использованием изотермических Ассамблеи²¹, при 50 ° C за 30 мин.
   3. Electroporate MG1655 клеток, содержащих плазмида pKOBEG.
      Примечание: pKOBEG является термочувствительных вектор, содержащий λ красные машины, поощрение основанных на гомологии аллельные обменов между хромосомы и ПЦР продукты²².
      1. Использовать 1 мкл продукта от шаг 1.1.2²³ 40 мкл electrocompetent клеток в 2 мм кюветы на 4 ° C и 2,5 кв. Ресуспензируйте клеток в 1 мл бульона LB + 0,2% арабинозы поддерживать выражение λ красные машины.
      2. Общий объем передать трубку отцентрифугировать и проинкубируйте 2 ч при 30 ° C (разрешительный температура для pKOBEG) с интенсивной тряски (200 об/мин в орбитальный шейкер) для обеспечения фенотипические выражения маркеров сопротивления, вставляется в хромосоме.
      3. Пластина клетки на агаре LB, содержащие соответствующие антибиотик для выбора для антибиотикам ген (ампициллин или carbenicillin на 100 мг/л для бла_ТЭМ-1).
   4. Пластина 100 мкл на одной чашке Петри и спина вниз остальной объем, Ресуспензируйте в 100 мкл свежие LB отвара и пластины на другой чашке Петри. Инкубируйте на ночь на 42 ° C.
      Примечание: Эта температура не разрешительной для репликации pKOBEG. Колонии способны расти в таких условиях будет потеряли pKOBEG и представит генов сопротивления, интегрированы в сайт attB (для простоты будет называться этот штамм MG1655::реса здесь).
   5. Тест для потери pKOBEG путем репликации колоний интерес в плитах с хлорамфениколом (антибиотик, против которого pKOBEG содержит маркер сопротивления).
      Примечание: Отсутствие роста в хлорамфеникол пластины разрешительной температуре 30 ºC свидетельствует об отсутствии плазмиды.
   6. Чтобы проверить клоны, PCR усиливает строительства, с использованием внешних праймеры YbhC-Экстерн (5'-TTTGTGACCAGAAGACCGCA-3') и YbhB-Экстерн (5'-CTCATCAGTAACGATCTGCG-3'), проверить путем электрофореза геля правильный размер ампликон и последовательности очищенный продукт чтобы убедиться, что последовательность гена вставлена правильно.
2. Вставьте генов антибиотикорезистентности в применим плазмиды.
   Примечание: Поскольку плазмид с числа сверхвысокого копии, как правило, навязать большого сокращения в бактериальных принимающей фитнес, мы рекомендуем использовать применим плазмид природного происхождения репликации, таких как p3655 (pSU18T-pBADgfp2, ColE1-тип происхождения ²⁴репликации). Эти плазмиды обычно представляют ряд умеренных копии около 15-20 копий в клетку.
   1. ПЦР усилить генов антибиотикорезистентности выбора (включая промоутер региона), фосфорилировать продукт PCR и перевязать в ПЦР усиливается костяк плазмида:
      1. PCR усиливает устойчивость к антибиотикам ген; для бла_ТЭМ-1 используют грунтовки ТЭМ1 pBAD-F (5'-TGAAGCCTGCTTTTTTATACCGGCCCGGAGGGTGGCGGGC-3') и ТЭМ1 pBAD-R (5'-TTTCGCTCAAGTTAGTATAAGGAGCGGGCGCTAGGGCGCT-3').
      2. Фосфорилировать очищенный продукт с помощью T4 полинуклеотид киназы, следуя инструкциям производителя.
      3. ПЦР усилить плазмиду позвоночника с использованием высокоточных полимеразы и олигонуклеотидов pBAD-F (5'-CGTTGATCGGCACGTAAGAG-3') и pBAD-R (5'-AAACGACGGCCAGTGCCAAG-3').
      4. Перевязать обоих ПЦР фрагментов с помощью T4-лигаза следование рекомендациям производителя.
   2. Electroporate, как описано ранее, 40 мкл electrocompetent E. coli DH5-α клеток с максимум 1 мкл лигирование продукта и выберите соответствующие антибиотики для антибиотикам ген (ампициллин или carbenicillin на 100 мг/Л для бла_ТЭМ-1) и плазмиды позвоночника.
      Примечание: Дополняющего LB с арабинозы здесь нет необходимости.
   3. Экстракт плазмида с использованием коммерческих мини-готовит комплект Выбор читателя:
      1. Урожай 5 мл на ночь культуры центрифугированием при 12000 x g при комнатной температуре. Ресуспензируйте клетки в 250 мкл раствора ресуспендирования и хорошо перемешать. 250 мкл раствора лизис и хорошо перемешать. 350 мкл нейтрализации и хорошо перемешать.
      2. Передача супернатант в столбце привязки ДНК, комплект, центрифуги за 1 мин и отбросить через поток. Мыть дважды столбец с 500 мкл моющего раствора, центрифугирование на одну минуту и отменяя проточные при каждом мытье. Центрифуга пустой столбец 1 дополнительных минут для удаления остаточного Отмывающий буфер.
      3. Место столбца в чистой трубку и добавьте 50 мкл ультра-чистой воды к мембране элюировать очищенная ДНК. Центрифуги для 1-2 мин и собирать, через который поток содержит очищенные плазмид. Сэнгер последовательность гена интереса в плазмиду с праймерами от за пределами вставленные последовательность для подтверждения, что последовательность является правильным и что нет мутации присутствуют в гене сопротивления до эволюции экспериментов.
   4. После проверки последовательности electroporate плазмид в штамм E. coli MG1655, как описано выше.
      Примечание: Это дает штамм MG1655/Преса.

2. Эволюционная спасения подход к экспериментально развиваться к антибиотикам (рис. 1)

1. Полоса из штаммов изучается на ФУНТ пластин: MG1655::реса и MG1655/Преса плюс восприимчивы родительский сорт, MG1655.
   Примечание: Плазмида pRESA должно быть стабильным в MG1655, поэтому нет необходимости для добавления антибиотиков фунтов пластин. Скорости мутации в E. coli являются достаточно низкими, так как только строительство проверяется это не нужно проверить плазмида последовательности на каждом шагу.
2. Подготовить 96-луночных пластины с 200 мкл фунтов в каждой скважине и прививать 48 изолированной колонии каждого штамма в независимых скважин (одна пластина на штамм). Инкубируйте пластины на ночь при 37 ° C и 200 об/мин. Храните замороженные запас этих основатель групп населения.
   Примечание: Для предотвращения и контроля для культуры перекрестное загрязнение в 96-луночных пластин, используемых дизайн плита клетчатый вставочный привитых скважин с бактерии, свободной среде на протяжении 96-луночных пластины. Используйте этот дизайн пластине в течение всей экспериментальной эволюции.
3. Запустите эксперимент эволюционной спасения, пересевать 2 мкл от каждой скважины пластин с основатель населения в новых 96-луночных пластины с 198 мкл фунтов в каждой скважине с sub-inhibitory концентрация антибиотика в исследование. Для эволюционной спасения подхода начинаются с ¼ или 1/8 минимальный тормозной концентрации (MIC, определено ранее²⁵) антибиотика в LB для каждого из трех штаммов и удвоить концентрацию антибиотиков ежедневно. Используйте этот подход, чтобы максимизировать шансы населения приобретать сопротивление мутации²⁶. Инкубируйте пластин при 37 ° C и 200 rpm для 20 h.
   Примечание: Измерения на ночь ОД основатель населения. Если имеются существенные различия среди штаммов в ОД исправьте первоначальный посевным материалом, чтобы начать эксперимент с же количество ячеек на хорошо.
4. Каждый день, измерить ОД каждого населения после ночи культуры и выполнить передачу культур, как описано в разделе 2.3, чтобы новые 96-луночных пластины с двойной концентрации антибиотика, чем за день до. Инкубируйте пластины 20 ч при 37 ° C и 200 об/мин.
   Примечание: Коэффициент разбавления 1: 100 производит около 6-7 поколений в день.
5. Параллельно распространять контроля населения каждого штамма в тех же условиях, как описано в 2.3 и 2.4, но в отсутствие антибиотиков.
   Примечание: Населения управления поможет различать мутации, возникающие вследствие наличия антибиотиков и общих мутаций, помогая бактерий адаптироваться к экспериментальных условиях. Параллельные мутации, возникающие в отсутствие антибиотиков, скорее всего будут помогать бактерий адаптироваться к экспериментальных условий и не связанные с устойчивостью к антибиотикам.
6. Отслеживать количество сохранившихся популяций каждый день путем измерения поглощение на длине волны 600 Нм (OD) культур с помощью пластины читателя.
   Примечание: Значения оптической плотности меньше 0,1 указывают вымирание населения. Смотрите Рисунок 2 пример кривых выживания.
7. Храните замороженные запас всего населения периодически (каждые 3-5 дней).
8. Используйте журнал ранг тесты [пакет «выживания» в RStudio (версия 0.99.486)] для определения статистических различий в выживание населения различных штаммов со временем под повышение концентрации антибиотиков¹².
   Примечание: Этот эксперимент будет определять, если применим плазмид полифункциональное эволюции к антибиотикам для конкретного антибиотика и гена под исследование.

3. молекулярные основы эволюции к антибиотикам (рис. 1)

1. Выполнение общей экстракции ДНК от представителя количество населения и клоны различных штаммов и лечения. Включить родительский штаммов (MG1655, MG1655::реса и MG1655/Преса) чтобы иметь возможность обнаружить мутации, накапливается в ходе эксперимента.
   Примечание: Примеры извлечения ДНК комплекты таблица материалов. Каждый набор имеет различные протоколы; Следуйте инструкциям производителей.
2. Количественную оценку качества ДНК и концентрации. Существуют различные методы для определения качества ДНК и концентрации. Определите качество измерения коэффициенты поглощения 260 Нм/280 Нм и 260 Нм/230 Нм. Использование флуоресцентных, ДНК связывающих краситель для измерения концентрации ДНК, следуя инструкциям производителя, и электрофорез геля агарозы подтвердить, что это не деградации ДНК или РНК загрязнения.
3. Использование глубокой секвенирования ДНК от образцов всего населения и отдельных клонов для изучения генетической основы устойчивости к антибиотикам.
   Примечание: Мы провели все последовательности в центре доверять Уэллком генетики человека, Оксфорд, Великобритания. Более подробную информацию см. в Сан-Миллан и др. 2016¹².
4. Использование конвейера^27,в breseq 0.26.1²⁸ для обнаружения мутаций, использование полиморфизма режим для оценки частоты мутаций в популяциях. Сравните различные развивались геномов родителей генома для обнаружения мутаций, которые накопились за время эксперимента.
5. Сравните мутации накопленных параллельно в населенностях управления с деятельностью населения развивалась под увеличением концентрации антибиотиков для различения мутации, помогая бактерий адаптироваться к общим экспериментальных условий ( те нашли в населенностях управления) и тех, кто причастен к антибиотикам (те нашли исключительно в популяциях, антибиотик давление).
   Примечание: Количество параллельных мутации обычно низкий, так что можно легко оценить различные параллельные мутаций между процедурами. Помимо мутации в гене антибиотикам под исследование, что вполне вероятно найти другие мутации, связанные с антибиотикорезистентности в хромосоме, такие перегласовки в porins или измеряем систем¹².
6. Реконструировать мутации в гене антибиотикорезистентности в родительский сорт, используя тот же подход, как и раздел 1 данного протокола. Выполните пункты 1.1 и 1.2 протокола представить новые мутации в родительский фон (с помощью развивались гены как шаблон ПЦР). Анализируйте антибиотикорезистентности фенотипы этих новых конструкций для подтверждения роли мутаций.

Результаты

В нашей предыдущей работы была исследована эволюция β-лактамаз гена бла_ТЭМ-1 на присвоении сопротивление третьего поколения цефалоспоринов Цефтазидим¹² . Этот ген был выбран потому, что, хотя ТЭМ-1 не дает сопротивление цефтазидим, мутации в bla<...

Обсуждение

Мы представляем новый протокол, молекулярной биологии, экспериментальной эволюции и глубокой секвенирования ДНК, предназначенные для расследования роли применим плазмид в эволюции к антибиотикам у бактерий. Хотя этот протокол сочетает в себе методы из разных областей, все методы, нео...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Thermocycler	BioRad	C1000
Electroporator	BiorRad	1652660
Electroporation cuvettes	Sigma-Aldrich	Z706078
NanoDrop 2000/2000c	Thermo Fisher Scientific	ND-2000	Determine DNA quality measuring the ratios of absorbance 260nm/280nm and 260nm/230nm
Incubator	Memmert	UF1060
Incubator (shaker)	Cole-Parmer Ltd	SI500
Electrophoresis power supply	BioRad	1645070	Agarose gel electrophoresis
Electrophoresis chamber	BioRad	1704405	Agarose gel electrophoresis
Pippettes	Biohit	725020, 725050, 725060, 725070
Multi-channel pippetes	Biohit	728220, 728230, 728240
Plate reader Synergy HTX	BioTek	BTS1LF
Inoculating loops	Sigma-Aldrich	I8388
96-well plates	Falcon	351172
LB	BD Difco	DF0446-17-3
LB agar	Fisher scientific	BP1425-500
Phusion Polymerase	Thermo Fisher Scientific	F533S
Gibson Assembly	New England Biolabs	E2611S
Resctriction enzymes	Fermentas FastDigest
Antibiotics	Sigma-Aldrich
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27104	Plasmid extraction kit
Wizard Genomic DNA Purification Kit	Promega	A1120	gDNA extraction kit
DNeasy Blood & Tissue Kits	Qiagen	69506	gDNA extraction kit
Electroporation cuvettes	Sigma-Aldrich	Z706078
Petri dishes	Sigma-Aldrich	D9054
Cryotubes	ClearLine	390701
96-well plates (-80ºC storage)	Thermo Fisher Scientific	249945
QuantiFluor dsDNA System	Promega	E2670	Quantification of DNA concentartion
Agarose	BioRad	1613100	Agarose gel electrophoresis
50x TAE buffer	BioRad	1610743	Agarose gel electrophoresis
T4 Polynucleotide Kinase	Thermo Fisher Scientific	EK0031
T4 DNA Ligase	Thermo Fisher Scientific	EL0014