항생제 내성의 진화에서 다중 플라스 미드의 역할 테스트

요약

여기 우리는 항생제 내성의 진화에서 다중 플라스 미드의 역할을 테스트 하는 실험 방법 제시.

초록

다중 플라스 미드는 원핵생물에서 매우 풍부 하지만 세균 진화에서 그들의 역할 제대로 이해 남아 있습니다. 우리는 최근에 증가 유전자 복사 셀 다중 플라스 미드를 제공한 당 플라스 미드로 인코딩된 유전자의 진화를 가속 수는 것을 보여주었다. 이 작품에서는, 우리는 유전자 진화를 촉진 하는 다중 플라스 미드의 능력을 테스트 하는 실험 시스템을 제시. 간단한 분자 생물학 방법을 사용 하 여, 우리는 항생제 저항 유전자 대장균 MG1655, 염색체 또는 다중 플라스 미드에 삽입할 수 있는 모델 시스템을 건설 한다. 우리 항생제의 농도 증가 따라 다른 변종을 전파 실험 진화 접근을 사용 하 고 우리는 시간이 지남에 세균성 인구의 생존을 측정. 선택 항생제 분자 그리고 저항 유전자는 유전자 돌연변이의 인수를 통해 저항을 부여만 수 있습니다. "진화 구조" 이렇게 항생제 내성의 획득 홍보 다중 플라스 미드의 잠재력을 테스트 하는 간단한 방법을 제공 합니다. 실험 시스템의 다음 단계에서는 항생제 내성의 분자 기초는 특징 이다. 돌연변이 식별 하기 위해 항생제 내성의 수집에 대 한 책임 우리가 사용 하 여 전체 인구와 클론에서 얻은 샘플의 깊은 DNA 연속. 마지막으로, 연구에서 유전자에 돌연변이의 역할을 확인, 우리 부모의 배경에서 그들을 재구성 하 고 테스트 결과 긴장의 저항 표현 형.

서문

항생제 저항 박테리아에는 주요 건강 문제^1입니다. 근본적인 수준에서 병원 성 박테리아에 항생제 내성의 확산은 자연 선택^2,3진화의 간단한 예입니다. 간단히 말하면, 항생제를 사용 하 여 생성 내성 변종에 대 한 선택 합니다. 진화 생물학에 있는 중요 한 문제는 따라서, 항생제에 저항을 진화 세균성 인구 수에 영향을 주는 요소를 이해 하는 것입니다. 선택 실험 박테리아의 진화 생물학을 조사 하는 매우 강력한 도구로 등장 하 고이 필드 진화 문제^4,,56의 넓은 범위에 대 한 놀라운 통찰력을 생산 하고있다. 실험 진화에서 단일 부모의 부담에서 시작 하는 세균성 인구는 정의 하 고 긴밀 하 게 제어 된 조건 하에서 passaged 직렬. 이러한 문화의 성장 하는 동안 발생 하는 돌연변이의 일부 세균 피트 니스, 증가 하 고 이러한 문화를 통해 자연 선택에 의해 확산. 실험 기간 동안 인구의 샘플 비 진화 냉동된 화석 레코드를 만들기 위해 주기적으로 저온 유지 됩니다. 박테리아 인구 진화 하 접근의 다양 한 숫자를 사용할 수 있지만 두 가지 가장 일반적인 방법 적합성 분석 실험, 그들의 먼 조상과 전체 게놈 시퀀싱, 즉 경쟁 진화 박테리아의 능력을 측정 하는 그 드라이브 적응 유전자 변화를 식별 하는 데 사용. 선구적인 작업 리처드 Lenski와 동료^7,8, 다음 실험 진화에 표준 접근 복제 인구 수가 상대적으로 적은 도전 하고있다 (일반적으로 < 10)에 새로운 적응을 환경 문제, 새로운 탄소 소스, 온도, 또는 육 식 살 균 소 등입니다.

항생제 내성 박테리아에의 한 감염 저항 높은 만큼 환자 조직에 치명적인 수준 항생제 농도 증가 하는 것은 큰 문제가 된다. 임상 세균이 임계값 항생제 농도, 임상 중단점 이상 항생제의 과다 복용에 저항을 진화 하는 것을 허용 하는 무슨에 따라서 관심이. 이 실험적으로 연구 하는 방법? 세균성 인구 수가 적은 항생제의 높은 복용량으로 도전, Lenski 스타일에서 실험, 그리고 가장 가능성이 결과 경우 항생제 멸종을 모든 인구를 몰 것 이다. 같은 시간에 사용 되는 항생제의 복용량은 부모의 긴장의 최소 억제 농도 (MIC) 아래 낮은 경우 다음 가능성이 크다 세균성 인구 저항, 임상 관련 레벨을 진화 할 것 이다 특히 저항 큰 비용을 수행합니다. 이러한 두 가지 시나리오 사이의 한 타협 "진화 구조" 실험^9,,1011을 사용 하는 것입니다. 이 방법에서는, 문화는 매우 큰 수 (일반적으로 > 40) 증가 시간이 지남에, 일반적으로 항생제 농도 두 배로 모든 주¹²항생제의 복용과 함께 도전 이다. 이 실험의 특징은 어떤 인구 증가 저항을 진화 하지 않는 멸종 구동 될 것입니다. 이 방법으로 도전 대부분 인구, 구동 하지만 작은 진화 하는 저항의 높은 수준으로 유지 됩니다. 이 문서에서 우리는이 실험 설계를 사용 하 여 저항의 진화에 다중 플라스 미드 기여를 조사 하는 방법을 보여줍니다.

박테리아는 두 가지 주요 노선, 염색체 돌연변이, 그리고 모바일 유전 요소, 주로 플라스 미드¹³의 인수를 통해 항생제에 저항을 취득. 플라스 미드 활용^14,15박테리아 사이의 저항 유전자를 옮길 수 있기 때문에 항생제 내성의 진화에 중요 한 역할을 재생 합니다. 플라스 미드의 크기와 생물학에 따라 두 그룹으로 나눌 수 있습니다: "작은", 세균성 세포 및 "큰" 높은 사본 수, 낮은 복사 번호^16,17. 항생제 내성의 진화에 큰 플라스 미드의 역할 그들은 저항 및 멀티 저항 박테리아¹⁵중 보급의 핵심 드라이버는 conjugative 플라스 미드를 포함 하기 때문에 광범위 하 게 문서화 되었습니다. 작은 다중 플라스 미드 박테리아^17,18, 매우 일반적인 있으며 그들은 종종 항생제 저항 유전자¹⁹에 대 한 코드. 그러나, 항생제 내성의 진화에서 작은 다중 플라스 미드의 역할에 공부 되었습니다 했다.

최근 작품에서 우리는 다중 플라스 미드가 그들은 유전자 돌연변이 속도 셀¹²당 더 높은 유전자 복사본 수를 증가 하 여 수행 하는 유전자의 진화를 가속 수 제안. 그것은 다중 플라스 미드 3 세대에 대 한 저항을 부여 하는 가장-1 돌연변이의 외관의 속도 가속 표시 했다 E. 콜라이 긴장 MG1655 및 β-lactamase 유전자 즐_편-1 실험 모델을 사용 하 여 cephalosporin ceftazidime입니다. 이러한 결과 표시 다중 플라스 미드 항생제 내성의 진화에 중요 한 역할을 재생 있습니다.

여기, 우리는 우리가 개발 하는 방법에 대 한 자세한 설명을 제시 다중 플라스 미드 중재 항생제 내성의 진화를 조사. 이 메서드는 세 가지 다른 단계: 연구는 다중 플라스 미드 또는 호스트 박테리아의 염색체에 유전자의 첫 번째, 삽입. 둘째, 선택적인 압력에 적응 하는 다른 긴장의 잠재력을 평가 하기 위해 실험 진화 (진화 구조)의 사용. 그리고 세 번째, 분자 기초 플라스 미드 중재 진화 DNA 시퀀싱 및 부모의 유전자 형에서 개별적으로 의심된 돌연변이 재구성을 사용 하 여 기본을 결정.

마지막으로, 여기에 설명 된 프로토콜 항생제 내성의 진화를 조사 하도록 설계 되었습니다, 비록 한 주장할 수 있다이 방법은 어떤 multicopy에 돌연변이 의해 취득 하는 혁신의 진화를 분석 하 일반적으로 도움이 될 수 있습니다. 플라스 미드로 인코딩된 유전자입니다.

프로토콜

1. 항생제 저항 유전자를 인코딩 실험 시스템의 건설

참고: 여기 대장균 MG1655 플라스 미드 또는 염색체 인코딩 항생제 저항 유전자의 받는 사람 부담으로 사용 되었다. 항생제 저항 유전자는 염색체 또는 그렇지 않으면 isogenic 스트레인 (그림 1)에서 다중 플라스 미드에 인코딩됩니다.

1. Λ 페이지 통합 사이트 (attB)²⁰ MG1655의 염색체의 항생제 저항 유전자를 삽입
   1. 증폭 PCR에 의해 염색체 attB 사이트의 양쪽에서 500 bp 긴 지역. Oligonucleotides YbhC-F를 사용 하 여 (5'-CCTGTACCGTACAGAGTAAT-3')와 attB-R (5'-GCCCGCCACCCTCCGGGCCGGTATAAAAAAGCAGGCTTCA-3')는 왼쪽된 상 동 지역 및 attB-F에 대 한 (5'-AGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTATACTAACTTGAGCGAAA-3') 및 YbhB/R (5'- TGGCGATAATATTTCACCGC-3') 적당 한. 뇌관 Tem1-pBAD-F를 사용 하 여 구_편-1 저항 유전자 증폭 (5'-TGAAGCCTGCTTTTTTATACCGGCCCGGAGGGTGGCGGGC-3')와 Tem1-pBAD-R (5'-TTTCGCTCAAGTTAGTATAAGGAGCGGGCGCTAGGGCGCT-3'). 약 20 뇌관 디자인 bp (5' 끝) 시퀀스 complementarity 조각에 융합 하는 것을 보여주는.
   2. 퓨즈 (를 포함 하 여 그것의 발기인 지구) 항생제 저항 유전자 PCR 제품을 상 동 지역에서 30 분 동안 50 ° C 등온선 어셈블리²¹를 사용 하 여.
   3. Electroporate MG1655 세포 포함 플라스 미드 pKOBEG.
      참고: pKOBEG는 λ를 포함 하는 열에 민감한 벡터 이다 빨간 기계, 염색체와 PCR 제품²²사이의 homology 기반 유전자 교류를 추진.
      1. 1.1.2 단계²³ 에서 제품의 1 µ L를 사용 하 여 4 ° C에서 2 mm 큐 벳에 electrocompetent 셀의 40 µ L 및 2.5 kV. Resuspend LB 국물 + 0.2 %arabinose λ의 식을 유지 하기의 1 mL에 빨간 기계 세포.
      2. Microfuge 관에 총 볼륨을 전송 하 고 염색체에 삽입 하 여 저항 마커의 phenotypic 표정 수 있도록 강렬한 떨고 (200 rpm 궤도 셰이 커에)와 30 ° C (pKOBEG에 대 한 허용 온도)에서 2 h를 품 어.
      3. LB agar 항생제 저항 유전자 (암 피 실린 또는 carbenicillin 즐_편-1대 100 mg/l)에 대 한 선택 하려면 적절 한 항생제를 포함 하는 셀 접시
   4. 100 µ L 한 페 트리 접시에 접시와 볼륨의 나머지 부분을 아래로 회전, 신선한 파운드 국물의 100 µ L에서 resuspend 다른 배양 접시에 접시. 42 ° c.에서 밤새 품 어
      참고:이 온도 pKOBEG의 복제에 대 한 관대 한 비. 이러한 조건에서 성장할 수 식민지 pKOBEG 잃게됩니다와 attB 사이트에 통합 하는 저항 유전자를 발표할 예정 이다 (편의상이 긴장 이라고 불릴 것 이다 MG1655:가 리사 에 여기에서).
   5. 페니와 함께 접시의 식민지를 복제 하 여 pKOBEG의 손실에 대 한 테스트 (어떤 pKOBEG에 대 한 항생제 저항 마커 포함).
      참고: 30 º C의 허용 온도에서 페니 격판덮개에 성장의 부족은 플라스 미드의 부재의 지표.
   6. 클론을 확인, PCR 증폭 외부 뇌관 YbhC Extern을 사용 하 여 건설 (5'-TTTGTGACCAGAAGACCGCA-3') 및 YbhB Extern (5'-CTCATCAGTAACGATCTGCG-3'), 젤 전기 이동 법을 통해 amplicon 시퀀스의 정확한 크기를 확인 합니다 삽입 된 유전자의 순서가 정확한 확인을 정화 제품.
2. 다중 플라스 미드에 항생제 저항 유전자를 삽입 합니다.
   참고: 때문에 매우 높은 복사 번호와 플라스 미드 세균성 호스트 피트 니스에 큰 감소를 부과 하는 경향이, 좋습니다 복제, p3655 등의 자연의 기원과 다중 플라스 미드의 사용 (pSU18T-pBADgfp2, ColE1 형 원산지 복제²⁴)입니다. 이 플라스 미드는 일반적으로 약의 적당 한 복사 번호를 제시 셀 당 15-20 복사본.
   1. PCR (발기인 지역 포함) 선택의 항생제 저항 유전자를 증폭 하 고 PCR 제품 phosphorylate 플라스 미드 PCR 증폭 중추에 선:
      1. PCR 증폭 항생제 저항 유전자; 즐_편-1 사용 뇌관 Tem1-pBAD-F (5'-TGAAGCCTGCTTTTTTATACCGGCCCGGAGGGTGGCGGGC-3')와 Tem1-pBAD-R (5'-TTTCGCTCAAGTTAGTATAAGGAGCGGGCGCTAGGGCGCT-3').
      2. 정제 제품 제조업체의 지침에 따라 T4 polynucleotide 키를 사용 하 여 phosphorylate
      3. PCR 증폭 높은 중 합 효소와 oligonucleotides pBAD-F를 사용 하 여 플라스 미드 백본 (5'-CGTTGATCGGCACGTAAGAG-3')와 pBAD-R (5'-AAACGACGGCCAGTGCCAAG-3').
      4. T4-리가 사용 하 여 두 PCR 파편을 위하여 제조 업체의 지침에 따라.
   2. Electroporate, 앞에서 설명한, 결 찰 제품 및 항생제 저항 유전자 (암 피 실린 또는 100 mg/L에서 carbenicillin에 대 한 적절 한 항생제 선택의 1 µ L의 최대 electrocompetent 대장균 DH5-α 세포의 40 µ L 즐_편-1)에 대 한 및 플라스 미드 백본.
      참고: arabinose 여기로 LB 보충 필요는 없습니다.
   3. 독자의 선택의 상업적인 소형 예비 키트를 사용 하 여 플라스 미드를 추출:
      1. 실 온에서 12000 x g에서 centrifuging 여 하룻밤 문화의 5 mL을 수확. Resuspend 물의 resuspension 솔루션의 250 µ L에서 세포와 섞어 잘. 세포의 용 해 솔루션의 250 µ L을 추가 하 고 잘 혼합. 중화의 350 µ L을 추가 하 고 잘 혼합.
      2. DNA 바인딩 열 키트, 1 분 동안 원심 분리기에서 제공 하는 상쾌한을 전송 하 고 삭제를 통해 흐름. 세척 솔루션, 1 분간 centrifuging와 각 세척에서 flowthrough 삭제의 500 µ L 열 두 번 씻는 다. 잔여 세척 버퍼를 제거 하려면 1 추가 분에 대 한 빈 열 원심
      3. 깨끗 한 튜브는 열을 놓고 elute 순화 된 DNA를 막에 매우 순수한 물 50 µ L를 추가 합니다. 1-2 분 원심 하 고 흐름을 통해 순화 된 플라스 미드를 포함 하는 수집. 생어 시퀀스 삽입된 시퀀스 외부에서 뇌관을 사용 하 여 순서 올바른지 확인 없는 돌연변이 진화 실험 전에 저항 유전자에 존재 하는 플라스 미드의 유전자.
   4. 일단 순서 확인 electroporate 대장균 MG1655 피로, 위에서 설명한 대로 플라스 미드.
      참고:이 변형 생성 MG1655/바지.

2. 실험적 진화 항생제 저항 (그림 1) 진화 구조 접근

1. 파운드 플레이트에 연구 긴장 밖으로 행진: MG1655::가 리사 와 MG1655/바지 플러스 취약 부모의 스트레인, MG1655.
   참고: 플라스 미드 바지 이어야 한다 MG1655, 안정 그래서 파운드 접시에 항생제를 추가할 필요가 없습니다. 변이 대장균 에 요금은 충분히 낮은 그래서 그것이 각 단계에서 플라스 미드 시퀀스를 확인 하는 데 필요한 건축 확인 합니다.
2. 각 잘에서 파운드의 200 µ L 96 잘 접시를 준비 하 고 (한 접시 스트레인 당) 독립적인 스에서 각 스트레인의 48 고립 된 식민지를 예방. 37 ° C와 200 rpm에서 하룻밤 접시를 품 어. 이러한 설립자 인구의 냉동된 재고 유지.
   참고: 방지 하 고 96 잘 접시에서 문화 교차 오염에 대 한 제어, intercalating 96 잘 접시에 걸쳐 박테리아 없는 매체와 접종된 웰 스에 의해 바둑판 플레이트 설계를 사용 합니다. 이 플레이트 설계를 사용 하 여 전체 실험 진화 중.
3. 접종 2 µ L 새로운 96 잘 접시에 창시자 인구와 플레이트의 각 우물에서 연구에서 항생제의 하위 전공으로 각 잘에서 파운드의 198 µ L로 하 여 진화 구조 실험을 시작 합니다. 진화 구조 접근에 대 한 3 개의 긴장의 각각에 대 한 파운드에서 항생제의 ¼ 또는 최소 억제 농도 (MIC, 결정 이전²⁵)의 1/8 시작 하 고 매일 항생제의 농도 두 번. 인구의 저항 돌연변이²⁶취득 기회를 최대화 하기 위해이 방법을 사용 합니다. 37 ° C와 20 h 200 rpm에서 번호판을 품 어.
   참고: 창시자 인구의 하룻밤 OD를 측정 합니다. 긴장 가운데 OD에 큰 차이가 있다면 잘 당 세포의 동일한 번호와 함께 실험을 시작 하는 초기 inoculum을 수정 합니다.
4. 매일, 야간 문화 후 각 모집단의 OD를 측정 하 고 2.3, 더블 전날 보다 항생제의 농도 가진 새로운 96 잘 접시에에서 설명 된 대로, 문화의 전송을 수행. 플레이트 20 h 37 ° c와 200 rpm을 품 어.
   참고: 1: 100 희석 요인이 하루 약 6-7 세대 생산.
5. 동시에, 2.3 및 2.4, 하지만 항생제의 부재에 설명 된 대로 동일한 조건에서 각 변형의 컨트롤 인구를 전파 합니다.
   참고: 제어 인구 항생제와 박테리아 실험 조건에 적응을 돕는 일반적인 돌연변이의 존재 때문에 발생 하는 돌연변이 사이 차별 도움이 됩니다. 병렬 돌연변이 항생제의 부재에서 발생 하는 박테리아 실험 조건에 적응 하도록 돕는 것 항생제 내성에 관련이 없습니다.
6. 600의 파장에서 흡 광도 측정 하 여 살아남은 인구 수 매일 추적 플레이트 리더를 사용 하 여 문화권의 nm (OD).
   참고: 광학 밀도 값 0.1 나타냅니다 인구의 멸종 보다 낮은. 그림 2 생존 곡선의 예를 참조 하십시오.
7. (3-5 일 마다) 모든 인구를 주기적으로 냉동된 재고 유지.
8. [RStudio (버전 0.99.486)에 "생존" 패키지] 로그-순위 테스트를 사용 하 여 항생제¹²의 농도 증가 따라 시간이 지남에 다른 긴장의 인구의 생존에 통계적 차이 확인 하.
   참고:이 실험 경우 다중 plasmids 약효는 특정 항생제 및 유전자 연구에 대 한 항생제 내성의 진화를 결정 합니다.

3. 분자 기초 항 생 저항 (그림 1)의 진화의

1. 인구와 클론의 대표 번호에서 전체 DNA 추출 긴장 및 치료 수행. 부모 긴장을 포함 (MG1655, MG1655::가 리사 와 MG1655/바지) 실험 기간 동안 축적 하는 돌연변이 검출 하기 수 있기를.
   참고: DNA 추출 키트의 예에 대 한 자료의 표를 참조. 각 키트에는 다른 프로토콜; 제조업체 지침을 따릅니다.
2. 계량 DNA 품질 및 농도. DNA 품질 및 농도 확인 하기 위해 다른 방법이 있다. 260 nm/280 nm의 흡 광도 260 nm/230 nm의 비율을 측정 하는 품질을 결정 합니다. 형광, DNA 바인딩 염료를 사용 하 여 제조업체의 지침에 따라 DNA 농도 측정 하 고 거기 확인을 agarose 젤 전기 이동 법이 DNA 저하 또는 RNA 오염.
3. 전체 인구 및 개별 샘플에서 사용 하 여 깊은 DNA 시퀀싱 항생제 내성의 유전 기초 조사를 복제 합니다.
   참고: 우리는 인간 유전학, 옥스포드, 영국에 대 한 모든 시퀀싱 Wellcome 신뢰 센터에서 실시. 자세한 내용은 참조 산 밀란 외. 2016¹².
4. Breseq 0.26.1 파이프라인^27,28 를 사용 하 여 다형성 모드를 사용 하 여 인구에 있는 돌연변이의 주파수를 견적 하는 돌연변이 검출. 실험 기간 동안 축적 된 돌연변이 검출 하기 위하여 부모의 게놈을 다른 진화 게놈 비교 합니다.
5. 비교 그 인구 제어 인구에 있는 동시에 축적 된 돌연변이 돌연변이 박테리아 일반적인 실험 조건 (적응을 돕는 사이 분화 하는 항생제의 농도 증가에서 진화 그 제어 인구에서 발견) 그 항 생 저항 (항생제 압력을 복종 하는 인구에 독점적으로 그)에 관련 된.
   참고: 병렬 돌연변이의 수 이므로 일반적으로 낮은 치료 사이 다른 병렬 변이 쉽게 평가 될 수 있다. 그것은 꽤 찾을 가능성이 연구 항생제 저항 유전자에 돌연변이 제외 하 고 다른 돌연변이 염색체에 항 생 저항, porins 또는 경과 시스템¹²같은 돌연변이와 관련 된.
6. 이 프로토콜의 섹션 1에서 동일한 방법을 사용 하 여 부모의 긴장에서 항생제 저항 유전자에 돌연변이 재구성 합니다. 1.1와 1.2 (를 사용 하 여 진화 유전자 PCR 템플릿으로) 부모의 배경에서 새로운 돌연변이 소개 하는 프로토콜의 포인트에 따라. 항생제 저항 phenotypes 돌연변이의 역할을 확인 하는 이러한 새로운 건축의 분석.

결과

우리의 이전 작품에서 진화 β-lactamase 유전자 즐_편-1 제 3 세대 cephalosporin ceftazidime¹² 에 저항을 부여 쪽으로 조사 되었다. 이 유전자는 돌연변이 즐_편-1 편-1은 ceftazidime²⁹등 cephalosporins의 활동의 범위를 확장할 수 있습니다 편-1 ceftazidime에 저항을 부여 하지 않습니다, 하지만 때문에 선정 되었다. Β-lactamases 등 ?...

토론

우리는 분자 생물학, 실험 진화 및 다중 플라스 미드 박테리아에 항생제 내성의 진화에서의 역할을 조사 하도록 깊은 DNA 시퀀싱을 결합 하 여 새로운 프로토콜을 제시. 이 프로토콜은 다양 한 분야에서 기술을, 비록 그것을 개발 하는 데 필요한 모든 방법을 간단 하 고 일반 미생물학 실험실에서 수행할 수 있습니다. 프로토콜의 가장 중요 한 단계는 아마 모델 시스템 긴장의 건설과 실험 진화 후 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Thermocycler	BioRad	C1000
Electroporator	BiorRad	1652660
Electroporation cuvettes	Sigma-Aldrich	Z706078
NanoDrop 2000/2000c	Thermo Fisher Scientific	ND-2000	Determine DNA quality measuring the ratios of absorbance 260nm/280nm and 260nm/230nm
Incubator	Memmert	UF1060
Incubator (shaker)	Cole-Parmer Ltd	SI500
Electrophoresis power supply	BioRad	1645070	Agarose gel electrophoresis
Electrophoresis chamber	BioRad	1704405	Agarose gel electrophoresis
Pippettes	Biohit	725020, 725050, 725060, 725070
Multi-channel pippetes	Biohit	728220, 728230, 728240
Plate reader Synergy HTX	BioTek	BTS1LF
Inoculating loops	Sigma-Aldrich	I8388
96-well plates	Falcon	351172
LB	BD Difco	DF0446-17-3
LB agar	Fisher scientific	BP1425-500
Phusion Polymerase	Thermo Fisher Scientific	F533S
Gibson Assembly	New England Biolabs	E2611S
Resctriction enzymes	Fermentas FastDigest
Antibiotics	Sigma-Aldrich
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27104	Plasmid extraction kit
Wizard Genomic DNA Purification Kit	Promega	A1120	gDNA extraction kit
DNeasy Blood & Tissue Kits	Qiagen	69506	gDNA extraction kit
Electroporation cuvettes	Sigma-Aldrich	Z706078
Petri dishes	Sigma-Aldrich	D9054
Cryotubes	ClearLine	390701
96-well plates (-80ºC storage)	Thermo Fisher Scientific	249945
QuantiFluor dsDNA System	Promega	E2670	Quantification of DNA concentartion
Agarose	BioRad	1613100	Agarose gel electrophoresis
50x TAE buffer	BioRad	1610743	Agarose gel electrophoresis
T4 Polynucleotide Kinase	Thermo Fisher Scientific	EK0031
T4 DNA Ligase	Thermo Fisher Scientific	EL0014