JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы представляем протокол развивать систему индуцибельной Доминант отрицательных, в котором любой белок может быть условно инактивированная обратимо экспрессирующих черепашки версии Доминант отрицательные.

Аннотация

Доминант отрицательные (DN) белок является мощный способ манипулировать функции протеина и предлагает несколько преимуществ над другими подходы, основанные на геном. Например хотя химерных и Cre-LoxP ориентации стратегий широко использовались, встроенные ограничения этих стратегий (т.е., протекающая промоутер активность, мозаика Cre выражения и т.д.) значительно ограничили их приложения. Кроме того полное исключение много эндогенные генов embryonically смертельной, что делает невозможным для изучения функции гена в послеродовой период жизни. Для решения этих проблем, мы внесли значительные изменения в начале протокол генной инженерии и короткая (трансгенных) версия Rb1 гена в сочетании с лизосомальных протеазы procathepsin B (CB), чтобы создать модель мыши DN Rb1 (НАСВВП). Благодаря наличию лизосомальных протеазы весь CB-RB1 синтез белка и его взаимодействующих комплекса маршрутизируются протеасом опосредованной деградации. Кроме того присутствие элемента индуктором (rtTA) тетрациклина в трансгенных конструкция позволяет индуцибельной и обратимым регулирование RB1 белка. Наличие повсеместно Роза-CAG промоутер в мышиной модели НАСВВП делает его полезным инструментом для выполнения переходных и обратимым Rb1 гена абляции и исследователи ресурс для понимания ее деятельности в практически любой тип клеток, где выражается RB1.

Введение

Большинство подходов, направленных на генов и белков аблаций полагаются на постоянные процессы, которые обычно приводят к полной ликвидации или усечение гена, РНК последовательности или протеин интереса (POI). Общая цель этого метода является инженер рекомбинантных белков отменить функцию эндогенные, одичал тип протеина. У нас пересмотреть и обновленный альтернативная стратегия1,2, который позволяет для временного абляции POI через ингибитирование DN. Этот метод работает для multimeric и мономерных пептидов, но лучше всего подходит для белков, которые функционируют в сборке multimeric.

Этот метод состоит из фьюзинга лизосомальных протеазы CB для субблока multimeric Пои (CB фьюжн комплекс). Результирующая CB фьюжн комплекс может взаимодействовать с и proteolytically дайджест эндогенного белка или отвлекать весь комплекс CB-Пои для Лизосома деградированных3. Кроме того сочетание CB фьюжн комплекс с индуцибельной характер системы контролируемой тетрациклин transcriptional активации (Тето) позволяет выражение индуцибельной и контролируемых трансген в реверсивные мода2. Хотя полезно во многих случаях, полное исключение генов или белков в естественных условиях может привести к летальность4,5,6. Аналогичным образом ткани конкретным, условного удаления некоторых генов или белки, с использованием системы Cre/Lox не может быть простым, как это в конечном счете, приведет к постоянной потере критических геномной элементы7. Таким образом, в зависимости от гена или POI, ни один из этих подходов будет эффективным в предоставлении полезной моделью для последующих исследований, особенно генов или белки функциональных исследований в конце послеродового и взрослых мышей.

Чтобы обойти проблемы, связанные с такими подходами и обеспечить доказательство принципа эффективности предложенного метода, мы выбрали для тестирования метода, представленные здесь, создавая условный DN версию белка ретинобластомы 1 (RB1). Несколько вариантов были предлагаемые8,9,10 отменить функцию эндогенного RB1; Однако, все они сталкиваются некоторые из те же ограничения, обсуждавшиеся выше: исключить постоянное микрофлорой RB1 embryonically смертельной, и, в соответствии с его опухоль подавитель роль, постоянного RB1 условного удаления приводит к различных опухолей11. Даже несмотря на то, что версия DN RB1, как представляется, не происходят естественно, лучшей альтернативы для имеющихся в настоящее время стратегии позволяют временно контролируемых инактивации эндогенного RB1 и предоставить альтернативный механизм в конечном итоге восстановить ее функция. Основой для такой конструкции был описан более двух десятилетий назад1. Однако из-за технологических ограничений, это не механизм для активации управления трансген, ответ и специфика ткани. Это исследование является первым, чтобы совместить элегантность доксициклин (Dox)-зависимых транскрипционный анализ системы с конструкцией инженерии трансгенных лизосомальных протеазы CB и Rb1 белков. Полученная в результате модель мыши НАСВВП позволяет временно регулируемых Dox опосредованной RB1 правила2. Преимущество использования такого подхода, основанного на протеома для изучения функции гена является, что он может быть принят для любого гена интереса, с минимальной информации о своей деятельности.

Предлагаемая стратегия трансген DN имеет много преимуществ над традиционными подходами. Во-первых DN белка ингибирование приводит к только частичное абляции активности белка, таким образом, сохраняя остаточного эндогенного выражение. Такой результат является весьма желательным в ситуациях, где полная ликвидация деятельности белка приводит к эмбриональной летальность, значительно ограничивает любое расследование для изучения функции гена в живой мыши. Во-вторых наличие системы Тето позволяет трансген активации только в присутствии антибиотик, который позволяет для эффективной и обратимым контроль деятельности трансген. Таким образом путем прекращения антибиотиков, трансгенных система может быть отключена, и нормальное выражение RB1 обратно на место. В-третьих специфика трансген выражение может варьироваться в зависимости от промоутера выбора. В то время как мы выбрали вездесущие Роза-CAG промоутер для доказательства в принципе, поместив трансген под ткани конкретной промоутера, скорее всего ограничить нежелательные трансген выражение и облегчения исследования терапевтического применения этой трансген методология.

протокол

Поколение трансгенные мыши НАСВВП и ухода за животными и эксперименты, связанные с исследованием были одобрены Крейтон университета институциональный уход за животными и использования Комитет (IACUC) и осуществляется их руководящих принципов.

1. трансгенных CB-Myc6-Rb1 конструкции

Примечание: Клонирование НАСВВП в pTet_Splice вектор было сделано в рамках многоэтапного процесса (рис. 1A и 1B).

  1. Выполните первый этап клонирования в pCS2 + CB-Myc6 вектора.
    1. Чтобы создать конструкцию НАСВВП трансген, усиливают фрагмент cDNA Rb1 1583-ВР Лонг (528 аминокислоты, соответствует аминокислота региона 369-896) белка RB1, используя следующие грунтовка: для EcoRI +РБ 1243F, используйте GGGGAATTCA TTAAATTCAGCAAGTGATCAACCTTCи XbaI + EcoRV +РБ 2826R, используйте CCCTCTAGATATCTATTTGGACTCTCCTGGGAGATGTTTACTTCC.
    2. Клон фрагмент создан (1546 bp) между EcoR1 и XbaI места ограничения pCS2 + вектор CB-Myc6 как описано в1,12.
      Примечание: 1012-ВР долго CB-Myc6 конструкцию (337 аминокислоты) снаряжен Rb1 -фрагмент привели в протеине примерно 865 аминокислот (около 108 кДа), который является немного меньше, чем эндогенного белка RB1 (~ 110 кДа) (рис. 1 ), С тегом6 CB-Myc на N-конечная и Rb1 в C-terminus.
  2. Выполните второй этап subcloning в pTet-Splice вектор.
    1. Усилить фрагмент слияния CB-RB-Myc6 и получить тет промоутер, усиливают кассеты, состоящий из CB-myc6-Rb1 с праймерами, содержащий EcoRV (XbaI + EcoRV + РБ 2826R) и Сали сайты: для Сали +CBF, Использование CCAGTCGACAGGATGTGGTGGTCCTTGATCCTTC.
    2. Subclone созданный фрагмент (2567 bp) в pTet-Splice вектор, между Сали и EcoRV места ограничения, таким образом, что весь Тето-DN-CB-myc6-Rb1 трансген, включая SV40 Интрон и поля сигнала, могут быть изолированы посредством одного пищеварение с персо (рис. 1Б).
      Примечание: Ноти фрагмент был использован для создания трансгенных спонсоров.

2. в Vitro тестирование Тето DN-CB-myc6-Rb1 трансген

  1. DOX положение: Линия клетки NIH3T3
    Примечание: Если не указано иное, все тома были скорректированы для 6-ну плиты.
    1. Растут NIH3T3 клетки после спецификации поставщика, используя рекомендованные клетки культуры носителя, содержащего 10% плода бычьим сывороточным при 37 ° C с 10% CO2.
    2. Cotransfect клетки с pTet соединитель и векторов pCMV-Tet3G (из шага 1) за 24 ч. Выполните шаги, указанные ниже для cotransfection.
      1. Смешайте 2 – 4 мкл Реагента/скважины на основе липидов transfection и 1 мл из неполной (без сыворотки) Дульбекко изменение Eagle среднего (DMEM) за 5 мин при комнатной температуре. Для 12 - или 24-ну плиты используйте 250 или 500 мкл культуры средств массовой информации, соответственно и отрегулируйте громкость реагент трансфекции соответственно.
      2. Добавить 2-3 мкг плазмидной ДНК/хорошо трансфекции реагент DMEM и проинкубируйте втечение 20 мин при комнатной температуре.
      3. Добавьте смесь, содержащую ДНК и трансфекции реагента в среде DMEM для каждой скважины. После 3-4 ч инкубации добавьте 1 mL полной СМИ (так что окончательный объем 2 мл/хорошо). Держите аликвоты Dox акций (1 мг/мл) и добавить 2 мкл в каждом из скважины (+ Dox). Инкубируйте клетки при 37 ° C с 5% CO2.
        Примечание: Примеры элементов управления должен состоять из cotransfected клеток, не получавших Dox (-Dox), а также NIH3T3 клетки transfected только с transactivator pCMV-Tet3G вектора и относиться с Dox в течение 24 ч. Для pCMV-Tet3G, концентрации 0,1-1 мкг/мл Dox должно быть достаточно, чтобы побудить трансген выражение.
  2. Протестируйте обратимости конструкции, используя линии клетки HEK293.
    1. Для тестирования обратимости Тето-DN-CB-myc6-Rb1 трансген, культуры HEK293 клетки в орла минимум основных средних (EMEM) после спецификации производителя и cotransfect с pTet соединитель и pCMV-Tet3G векторов на 24 часа, как описано выше (шаг 2.1.2).
    2. Для дезактивации трансген удалите Dox содержащих СМИ после 24 ч, мыть x-3 x 2 клетки с-фосфатный буфер (PBS) и инкубировать их в Dox свободных СМИ на дополнительные 24 часа.
      Примечание: Dox-удаления трансген инактивации и регулярные белков должна быть возобновлена в течение этого периода 24 h.
  3. Чтобы оценить функциональность Тето-DN-CB-myc6-Rb1 конструкции в содействии незапланированные пролиферации, выполняют функциональный анализ с использованием клеток линии HEI-OC1, как описано ниже.
    1. Культура клетки HEI-OC1 в 10% DMEM под разрешительной условия (33 ° C с 10% CO2). Для исследования распространения клеток подсчитать ячейки, используя счетчик соматических клеток и пластины 10000 HEI-OC1 клетки на 96-луночных тарелку в объеме 200 мкл. Инкубируйте клетки на ночь.
    2. На следующий день, выполняют временные cotransfection pTet соединения и pCMV-Tet3G векторов с использованием реагентов на основе липидов трансфекции (см. шаги 2.1.2). В отдельной скважины выполняют pmR-ZsGreen1 трансфекции at2-мкг с помощью трансфекции липидных реагента (шаги 2.1.2) для расчета ставки transfection. Использование не transfected клеток как элементы управления.
    3. Определить наличие зеленой флуоресценцией под флуоресцентным микроскопом (возбуждения = 485 Нм, выбросов = 530 Нм) для transfected клеток 24 ч после transfection. Запись наличие или отсутствие зеленого флуоресценции и рассчитать ставку трансфекции как общее количество GFP-положительных клеток (transfected клеток) над клетки, помечены DAPI (всего клетки).
      Примечание: Мы оценили трансфекции ставка ~ 70%.
    4. Чтобы побудить трансген выражение, добавить 1 мкг/мл Dox подмножество transfected клеток при использовании других подмножества как управления (-Dox). Использование необработанной HEI-OC1 клетки как дополнительные элементы управления.
    5. Чтобы оценить пролиферации клеток, используйте комплект распространения клеток согласно протоколу производителя.
      1. В краткой 48 ч после трансфекции, удалите средство культуры клеток и 100 мкл 1 x краска привязки решения к каждой скважины микроплиты. Инкубировать 1 час при температуре 37 ° C.
      2. После этого, измеряют интенсивность флуоресценции каждого образца с помощью Считыватель микропланшетов флуоресцирования (возбуждения = 485 Нм, выбросов = 530 Нм).
    6. Для дальнейшей оценки пролиферации клеток с помощью immunocytochemistry, пластина HEI-OC1 клетки на покрытие стекла в пластине 12-Ну и Инкубируйте на ночь на 37 ° C.
      1. На следующий день cotransfect с pTet соединения и pCMV-Tet3G и выполнять Dox лечения (+ Dox). Используйте untransfected клетки как элементы управления. Процесс вуза-OC1 клетки для маркировки Ki-67.
      2. Исправьте клетки с параформальдегида 4% (PFA) в PBS, рН 7,4, за 10 мин при комнатной температуре. Вымыть клетки 3 x с ледяной PBS и инкубации клеток в 0,25% неионные моющего средства в PBS на 10 мин.
      3. Вымыть клетки снова, 3 x в PBS на 5 мин и блока с помощью 10% сыворотки в камере увлажненные за 1 ч при комнатной температуре.
      4. Инкубировать клетки в 500 мкл основное антитело Ki-67 (разбавления 1: 200) для 3 ч при комнатной температуре или на ночь при 4 ° C.
      5. Вымыть клетки 3 x 5 мин с PBS. После этого инкубации клеток с вторичное антитело за 1 ч при комнатной температуре в темноте.
      6. Удаление решения вторичного антитела и вымыть клетки 3 x с PBS для 5 мин в темноте.
      7. Фаллоидин маркировки, Инкубируйте HEI-OC1 клеток в 1: 200 Фаллоидин за 30 мин. Чтобы пометить ядер клеток, инкубации клеток с 5 мкг/мл DAPI 10 мин при комнатной температуре.
        Примечание: Убедитесь, что краска конъюгата Фаллоидин отличается от вторичного антитела конъюгата.

3. поколение /ROSA-CAG-rtTA НАСВВП++ (НАСВВП) трансгенных мышей и Vivo тестирование DN-НАСВВП подход

  1. После подтверждения эффективного регулирования Dox Тето-DN-CB-myc6-Rb1 трансген очищают Ноти фрагмент и microinject их в мыши зигот, которые позже переносятся в псевдо-беременных самок.
    Примечание: Эти процедуры были проведены в университете штата Небраска медицинский центр (UNMC) мыши генома инженерных Core объекта.
  2. После родов, генотип, установить щенков, используя праймер для региона фьюжн CB-Rb1 : для НАСВВП F, используйте 5' CTGTGGCATTGAATCAGAAATTGTGGCTGG 3′, а для НАСВВП R, 5′ GTACTTCTGCTATATGTGGCCATTACAACC 3′.
    Примечание: Размер продукта PCR, наблюдается на геле агарозы-401 bp (60-ВР CB регион + 341-ВР Rb1 региона (таблица 1). Были определены десять независимых основатель линии, основанный на присутствие трансген Тето-DN-CB-myc6-Rb1 . В пяти из этих линий потомства унаследовал трансген, который подтвердил передачу микрофлорой трансген. В конечном итоге один из трансгенных линий использовался для установления и поддержания линии и создания экспериментальных животных Тето-DN-CB-myc6-Rb1 для дальнейших исследований.
  3. Порода взрослых Тето-DN-CB-myc6-Rb1 мышей линии индуктором тетрациклин Роза-CAG-rtTA (фондовой #006965) (в качестве альтернативы, порода к линии индуктором tTA) для создания экспериментальной DN-НАСВВП мышей. Генотип потомство это крест используя следующий набор грунтовка: для rtTA-WT-R, используйте GGAGCGGGAGAAATGGATATG; для rtTA мутант R используйте GCGAGGAGTTTGTCCTCAACC; и для rtTA общем, используйте AAAGTCGCTCTGAGTTGTTAT. Размеры продукта ПЦР – 340 340 bp (мутанты), bp и 650 bp (гетерозиготности) и 650 bp (одичал тип).
  4. Создание кривой доза ответ после лечения Dox определить время и длительность лечения Dox необходимо выявить трансген выражения протеина RB1.
    Примечание: В этом эксперименте Западная помарка и qRT-PCR были использованы для оценки ткани конкретных трансген активации и RB1 выражение.
  5. Выполняют флуоресценции в situ гибридизация (рыбы) для подтверждения геномной вставки трансген.
    Примечание: Это была проведена в центре применяется геномики госпиталя для больных детей (Торонто, Канада). ELISA или Западный blotting (с помощью белка специфические антитела) может использоваться для оценки активации трансген, ткани специфика и изменения уровня эндогенного POI. Для построения DN-CB-myc6-Rb1 мы использовали антитела анти RB1.

Результаты

Как правило проектирование DN мутация требуется значительное количество информации о структуре и функции POI. В отличие от DN стратегия, представленная здесь особенно полезна, когда структурной и функциональной информации для POI ограничен. Если Пои multimeric белок, слияние о...

Обсуждение

Чтобы обойти ограничения, связанные с традиционными трансгенных стратегии, мы стремились создать модель мыши, в котором эндогенного POI могут быть условно инактивированная экспрессирующих DN мутантные формы его на основе пространственно-временных. Чтобы отменить функцию эндогенного POI...

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

PCS2 + CB-Myc6 вектор был подарок от Хорвитц Маршалл (Вашингтонский университет, Сиэтл, Вашингтон, США). ХЕЙ-OC1 клетки были любезно предоставлены Fedrico Kalinec (Дэвид Геффен школа медицины, Калифорнийского университета, Лос-Анджелес, Калифорния, США). Техническая поддержка была оказана UNMC мыши генома инженерных ядро (К.Б. Gurumurthy, Дон Хармс, Rolen Quadros) и Крейтон университета комплексной биомедицинских изображений объекта (Richard Hallworth, Джон Billheimer). UNMC мыши генома инженерных была поддержана институционального развития Award (IDea) от NIH/NIGMS, предоставьте номер P20 GM103471. Интегрированный биомедицинских изображений объекта было поддержано Крейтон университета Школа медицины и грантов, GM103427 и GM110768 от NIH/NIGMS. Объект был построен при поддержке грантов от национального центра для исследования ресурсов (RR016469) и NIGMS (GM103427). Мыши линии, созданные в этом исследовании были сохранены на Крейтон университета животных ресурсов Фонда, инфраструктура которой была улучшена посредством гранта NIH/NCRR G20RR024001. Эта работа получила в прошлом поддержка через низ/NCRR 5P20RR018788-/ низ/NIGMS 8P20GM103471 КОБРЕ предоставить (Shelley д. Смит), NIH/ORIP R21OD019745-01A1 (Ш.М.Р-S.) и возникающих исследовательский грант от фонда здравоохранения слушания (для S. таранг). Содержание этого исследования является исключительно ответственности авторов и не обязательно отражают официальную точку зрения национальных институтов здоровья.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEMGIBCO-BRL11965-084
Minimum Essential Medium Eagle, MEME Sigma M8042
Fetal bovine serumSigma F2442 
Lipofectamine DharmaFECTT-2010-03
Sal IRoche11745622
EcoRV-HFNew England BioLabsR3195S
NotIRoche13090730
CaspaTag MilliporeAPT523
DAPISigma D9542
StaurosporineSigma S4400
CyQuant NF cell proliferation kit InvitrogenC35007
Retinoblastoma 1 antibodyAbcamAb6075
c-Myc antibodySigma M5546
b-actinSigma A5316
Ki-67 Thermofisher scientificMA5-14520
PhallodinThermofisher scientificA12379
Fluorescence microplate readerFLUOstar OPTIMA, BMG Labtech
Epifluorescence microscope NikonEclipse80i
The TetO-DN-CB-myc6-Rb1 (DN-CBRb) mouse line is available from the Jackson Laboratory as JAX#032011. 

Ссылки

  1. Li, F. Q., et al. Preferential MyoD homodimer formation demonstrated by a general method of dominant negative mutation employing fusion with a lysosomal protease. Journal of Cell Biology. 135 (4), 1043-1057 (1996).
  2. Tarang, S., et al. Generation of a retinoblastoma (rb)1-inducible dominant-negative (DN) mouse model. Frontiers Cellular Neuroscience. 9 (52), (2015).
  3. Kominami, E., et al. The selective role of cathepsins B and D in the lysosomal degradation of endogenous and exogenous proteins. FEBS Letters. 287 (1-2), 189-192 (1991).
  4. Cortellino, S., et al. Defective ciliogenesis, embryonic lethality and severe impairment of the sonic hedgehog pathway caused by inactivation of the mouse complex A intraflagellar transport gene Ift122/Wdr10, partially overlapping with the DNA repair gene Med1/Mbd4. Developmental Biology. 325 (1), 225-237 (2009).
  5. Ferreira, C., et al. Early embryonic lethality of H ferritin gene deletion in mice. Journal of Biological Chemistry. 275 (5), 3021-3024 (2000).
  6. Lee, E. Y., et al. Mice deficient for rb are nonviable and show defects in neurogenesis and haematopoiesis. Nature. 359 (6393), 288-294 (1992).
  7. Turlo, K. A., et al. When cre-mediated recombination in mice does not result in protein loss. Genetics. 186 (3), 959-967 (2010).
  8. Weber, T., et al. Rapid cell-cycle reentry and cell death after acute inactivation of the retinoblastoma gene product in postnatal cochlear hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (2), 781-785 (2008).
  9. Zhang, J., et al. The first knockout mouse model of retinoblastoma. Cell Cycle. 3 (7), 952-959 (2004).
  10. Zhao, H., et al. Deletions of retinoblastoma 1 (Rb1) and its repressing target S phase kinase-associated protein 2 (Skp2) are synthetic lethal in mouse embryogenesis. Journal of Biological Chemistry. 291 (19), 10201-10209 (2016).
  11. Yamasaki, L., et al. Loss of E2F-1 reduces tumorigenesis and extends the lifespan of Rb1(+/-) mice. Nature Genetics. 18 (4), 360-364 (1998).
  12. Li, F. Q., et al. Selection of a dominant negative retinoblastoma protein (RB) inhibiting satellite myoblast differentiation implies an indirect interaction between MyoD and RB. Molecular and Cellular Biology. 20 (14), 5129-5139 (2000).
  13. Pitkanen, K., et al. Expression of the human retinoblastoma gene product in mouse fibroblasts: Effects on cell proliferation and susceptibility to transformation. Experimental Cell Research. 207 (1), 99-106 (1993).
  14. Chano, T., et al. Neuromuscular abundance of RB1CC1 contributes to the non-proliferating enlarged cell phenotype through both RB1 maintenance and TSC1 degradation. International Journal of Molecular Medicine. 18 (3), 425-432 (2006).
  15. Kole, R., et al. RNA therapeutics: Beyond RNA interference and antisense oligonucleotides. Nature Reviews Drug Discovery. 11 (2), 125-140 (2012).
  16. Yamamoto, A., et al. The ons and offs of inducible transgenic technology: A review. Neurobiology of Disease. 8 (6), 923-932 (2001).
  17. Houdebine, L. M., et al. Transgenic animal models in biomedical research. Methods in Molecular Biology. 360, 163-202 (2007).
  18. Brehm, A., et al. Retinoblastoma protein recruits histone deacetylase to repress transcription. Nature. 391 (6667), 597-601 (1998).
  19. Lu, Z., et al. E2F-HDAC complexes negatively regulate the tumor suppressor gene ARHI in breast cancer. Oncogene. 25 (2), 230-239 (2006).
  20. Magnaghi-Jaulin, L., et al. Retinoblastoma protein represses transcription by recruiting a histone deacetylase. Nature. 391 (6667), 601-605 (1998).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

143preprocathepsin CB

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены