Inibizione della proteina viscoelastica e reversibile dominante-negativo (DN)

Riepilogo

Qui presentiamo un protocollo per lo sviluppo di un sistema inducibile dominante-negativo, in cui tutta la proteina può essere inattivata in modo condizionale reversibilmente overexpressing una versione mutante dominante-negativo di esso.

Abstract

Inibizione della proteina di dominante-negativo (DN) è un metodo potente per manipolare la funzione della proteina e offre parecchi vantaggi sopra altri approcci basati sul genoma. Ad esempio, sebbene chimerici e Cre-LoxP strategie di targeting sono stati ampiamente utilizzate, le limitazioni intrinseche di queste strategie (cioè, l'attività del promotore che perde, espressione di Cre mosaico, ecc.) sono significativamente limitati loro applicazione. Inoltre, un'omissione completa di molti geni endogeni è embrionalmente letale, rendendo impossibile per studiare la funzione del gene nella vita postnatale. Per affrontare queste sfide, abbiamo apportato modifiche significative a un protocollo iniziale di ingegneria genetica e combinato una versione breve (transgenica) del gene Rb1 con una proteasi lisosomica procathepsin B (CB), per generare un modello murino di DN di Rb1 (CBRb). A causa della presenza di una proteasi lisosomiale, la proteina di fusione CB-RB1 intera e il suo complesso interagente vengono instradati per degradazione proteasome-mediata. Inoltre, la presenza di un elemento di induttore (rtTA) tetraciclina nel costrutto transgenico consente una regolazione viscoelastica e reversibile della proteina RB1. La presenza di un promotore di ROSA-CAG onnipresente nel modello del topo CBRb lo rende uno strumento utile per eseguire l'ablazione gene Rb1 transitorio e reversibile e fornire ai ricercatori una risorsa per comprendere la sua attività in praticamente qualsiasi tipo di cellula dove RB1 è espresso.

Introduzione

Maggior parte degli approcci puntando le ablazioni di gene e la proteina si basano su processi permanenti, che generalmente conducono alla completa eliminazione o troncamento del gene, sequenze di RNA o proteine di interesse (PDI). L'obiettivo generale di questo metodo è quello di progettare una proteina ricombinante per abolire la funzione della proteina endogena, selvaggio-tipo. Abbiamo rivisitato e rinnovato una strategia alternativa^1,2, che permette per l'ablazione temporanea di un PDI tramite inibizione di DN. Questo metodo funziona per multimerici e peptidi monomerici ma è più adatto per proteine che funzionano in un assembly multimerica.

Il metodo consiste di fondere la proteasi lisosomica CB per una subunità di un multimerico PDI (fusione di CB complessi). La risultante fusione CB complessa possa interagire con e proteoliticamente digerire la proteina endogena o deviare l'intero complesso di CB-POI per i lisosomi per essere degradati³. Inoltre, una combinazione di fusione CB complessa con la natura viscoelastica del sistema controllato tetraciclina attivazione trascrizionale (TetO) permette un'espressione inducibile e controllata del transgene in un modo reversibile². Anche se utile in molte circostanze, l'eliminazione completa dei geni o proteine in vivo può provocare mortalità^4,5,6. Allo stesso modo, tessuto-specifici, condizionale cancellazione di alcuni geni o proteine utilizzando il sistema Cre/Lox potrebbe non essere semplice, come, in definitiva, porterà alla perdita permanente di elementi critici genomico⁷. Pertanto, a seconda del gene o POI, nessuno di questi approcci sarà efficace nel fornire un utile modello per studi successivi, particolarmente dei geni o proteine studi funzionali in topi ritardo postnatali e adulti.

Per aggirare i problemi connessi con questo tipo di approccio e di fornire prova di principio sull'efficacia del metodo proposto, abbiamo scelto di testare il metodo presentato qui generando una versione di DN condizionale della proteina 1 di Retinoblastoma (RB1). Diverse opzioni sono state proposte^8,9,10 per abolire la funzione di RB1 endogeno; Tuttavia, tutti loro ha affrontato alcune delle stesse limitazioni discusse sopra: l'eliminazione permanente di germline di RB1 è embrionalmente letale, e coerente con il suo ruolo di soppressore del tumore, permanente eliminazione condizionale RB1 porta a una varietà di tumori¹¹. Anche se una versione di DN di RB1 non sembra verificarsi naturalmente, un'alternativa migliore alle strategie attualmente disponibili dovrebbe consentire un'inattivazione temporaneamente controllata di RB1 endogeno e fornire un meccanismo alternativo per ripristinare alla fine suo funzione. La base per tale costrutto è stato descritto più di due decenni fa¹. Tuttavia, a causa di limiti tecnologici, mancava un meccanismo di attivazione del controllo del transgene, risposta e specificità tissutale. Questo studio è il primo a combinare l'eleganza di doxiciclina (Dox)-sistema trascrizionale dipendente con un costrutto transgenico ingegnerizzato di proteine di proteasi lisosomica CB e Rb1 . Il modello di mouse CBRb risultante permette per un temporaneamente regolamentato RB1 Dox-mediata regola². Il vantaggio dell'utilizzo di tali un approccio basato sul proteoma per studiare la funzione del gene è che possa essere adottata per ogni gene di interesse, con informazioni minime sulla sua attività.

La strategia proposta del transgene DN offre molti vantaggi rispetto ai metodi tradizionali. In primo luogo, l'inibizione della proteina di DN conduce a solo un'ablazione parziale attività proteica, preservando in tal modo un'espressione endogena residua. Tale risultato è altamente desiderabile in situazioni dove un'eliminazione completa dell'attività della proteina conduce alla mortalità embrionale, limitando notevolmente qualsiasi indagine per studiare la funzione del gene in un mouse dal vivo. In secondo luogo, la presenza del sistema TetO consente l'attivazione di transgene solo in presenza di un antibiotico, che consente un controllo efficace e reversibile dell'attività del transgene. Così, cessando la somministrazione di antibiotici, il sistema transgenico può essere disattivato, e una normale espressione di RB1 è tornato a posto. In terzo luogo, la specificità dell'espressione del transgene può variare secondo il promotore della scelta. Mentre abbiamo scelto il promotore di ROSA-CAG onnipresente per prova-de-principio, ponendo il transgene sotto un promotore tessuto-specifico rischia di limitare l'espressione del transgene indesiderati e facilitare gli studi sull'applicazione terapeutica di questo transgene metodologia.

Protocollo

Generazione di esperimenti associati con lo studio e cura degli animali il topo transgenico CBRb e tutti sono stati approvati dalla Creighton University istituzionale animale cura ed uso Committee (IACUC) ed eseguita dai loro orientamenti.

1. transgenici CB-Myc₆-Rb1 costrutto

Nota: La clonazione del CBRb in un vettore di pTet_Splice è stato fatto in un processo a più fasi (Figura 1A e 1B).

1. Eseguire la prima fase di clonazione nel pCS2 + CB-Myc6 vettoriale.
   1. Per creare il CBRb transgene costrutto, amplificare un frammento di cDNA di Rb1 1583-bp-lungo (528 aminoacidi corrispondente alla regione dell'amminoacido 369 – 896) della proteina RB1 utilizzando il primer seguente set: per EcoRI +RB 1243F, utilizzare GGGGAATTCA TTAAATTCAGCAAGTGATCAACCTTCe per XbaI + EcoRV +RB 2826R, utilizzare CCCTCTAGATATCTATTTGGACTCTCCTGGGAGATGTTTACTTCC.
   2. Clone del frammento generato (1546 bp) tra i siti di restrizione EcoR1 e XbaI del pCS2 + CB-Myc6 vettoriale come descritto in precedenza^1,12.
      Nota: Il costrutto di CB-Myc6 1012-bp-lungo (337 aminoacidi) fuso per il frammento di Rb1 è provocato da una proteina di circa 865 aminoacidi (circa 108 kDa), che è leggermente più piccola della proteina endogena di RB1 (~ 110 kDa) (Figura 1 Un), con un tag di₆ CB-Myc all'estremità N-terminale e Rb1 al C-terminale.
2. Eseguire la seconda fase subcloning nel vettore pTet-Splice.
   1. Per amplificare il frammento di fusione CB-RB-Myc6 e di ottenere il Tet-promotore, amplificare la cassetta, composto da CB-myc6-Rb1 utilizzando primers contenenti il EcoRV (XbaI + EcoRV + RB 2826R) e SalI siti: per SalI +CBF, utilizzare CCAGTCGACAGGATGTGGTGGTCCTTGATCCTTC.
   2. Subclone il frammento generato (2567 bp) nel vettore pTet-Splice, tra i siti di restrizione di SalI ed EcoRV , in tale maniera che il transgene TetO-DN-CB-myc6-Rb1 intero, compreso l'introne SV40 e il PolyA segnale, possono essere isolati tramite una singola digestione con NotI (Figura 1B).
      Nota: Il frammento di NotI è stato utilizzato per generare i finanziatori transgenici.

2. in Vitro test del Transgene TetO-DN-CB-myc6-Rb1

1. DOX-regolazione: Linea di cellule NIH3T3
   Nota: Se non diversamente specificato, tutti i volumi sono stati regolati per una piastra a 6 pozzetti.
   1. Crescere le cellule NIH3T3 seguendo le specifiche del fornitore, mediante il supporto di cultura cellulare consigliato contenente 10% siero bovino fetale a 37 ° C con 10% CO₂.
   2. Cotransfect le cellule con pTet-Splice e vettori pCMV-Tet3G (dal passaggio 1) per 24 h. seguono i passaggi indicati sotto per cotransfection.
      1. Mescolare 2 – 4 µ l del reagente/pozzo trasfezione basata sui lipidi e 1 mL di Dulbecco incompleta (senza siero) per volta Eagle Medium (DMEM) per 5 min a temperatura ambiente. Per un piatto di 12 o 24 pozzetti, utilizzare rispettivamente 250 o 500 µ l di terreno di coltura e regolare il volume di reagente di transfezione di conseguenza.
      2. Aggiungere il reagente di transfezione-DMEM µ g 2 – 3 del plasmide DNA/pozzetto e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente.
      3. Aggiungere il mix contenente DNA e il reagente di transfezione in DMEM in ciascun pozzetto. Dopo 3 – 4 h di incubazione, aggiungere 1 mL di completa per i media (in modo che il volume finale è di 2 mL/pozzetto). Mantenere le aliquote di Dox stock (1 mg/mL) e aggiungere 2 µ l in ciascuno dei pozzi (+ Dox). Incubare le cellule a 37 ° C con 5% CO₂.
         Nota: Campioni di controllo dovrebbero consistere di cotransfected cellule non trattate con Dox (-Dox), come pure le cellule NIH3T3 transfected solo con il vettore di transactivator pCMV-Tet3G e trattati con Dox per un periodo di 24 ore. Per pCMV-Tet3G, concentrazioni di 0,1 – 1 µ g/mL Dox dovrebbe essere sufficiente per indurre l'espressione del transgene.
2. Testare la reversibilità del costrutto utilizzando la linea di cellule HEK293.
   1. Per testare la reversibilità del transgene TetO-DN-CB-myc6-Rb1 , cellule HEK293 dell'Aquila minimo essenziale medio (EMEM) seguendo le specifiche del fornitore e cotransfect con vettori sia pTet-Splice e pCMV-Tet3G per 24 h, come descritto sopra (punto 2.1.2).
   2. Per l'inattivazione del transgene, rimuovere i supporti contenenti Dox dopo 24 h, lavare le cellule 2 x-3 x con tamponato fosfato salino (PBS) ed incubare loro nei media Dox-liberi per altre 24 h.
      Nota: Al Dox-rimozione, l'inattivazione del transgene e l'espressione della proteina normale deve essere ripreso entro tale periodo di 24 ore.
3. Per valutare la funzionalità del costrutto TetO-DN-CB-myc6-Rb1 nel promuovere la proliferazione delle cellule non programmata, eseguire le analisi funzionali utilizzando una linea cellulare di HEI-OC1, come descritto di seguito.
   1. Cellule di HEI-OC1 cultura nel 10% DMEM sotto permissiva condizioni (33 ° C con 10% CO₂). Per gli studi di proliferazione cellulare, contare le celle utilizzando un contatore di cellule e le cellule di HEI-OC1 piastra 10.000 su una piastra a 96 pozzetti in un volume di 200 µ l. Incubare le cellule durante la notte.
   2. Il giorno seguente, eseguire un cotransfection transitoria di vettori pTet-Splice e pCMV-Tet3G utilizzando un reagente di transfezione basata sui lipidi (vedere i passaggi 2.1.2). In un pozzo separato, eseguire pmR-ZsGreen1 transfezione at2-µ g utilizzando il reagente di transfezione basata sui lipidi (passaggi 2.1.2) per calcolare il tasso di transfezione. Utilizzare cellule trasfettate con non come controlli.
   3. Rilevare la presenza di fluorescenza verde sotto un microscopio a fluorescenza (eccitazione = 485 nm, emissione = 530 nm) per il transfettate cellule 24 h dopo la trasfezione. Registrare la presenza o l'assenza di fluorescenza verde e calcolare il tasso di transfezione come il numero totale di cellule GFP-positive (cellule trasfettate) sopra le cellule identificate con DAPI (cellule totali).
      Nota: Abbiamo stimato un tasso di transfezione di ~ 70%.
   4. Per indurre l'espressione del transgene, aggiungere 1 µ g/mL Dox a un subset di cellule trasfettate utilizzando il sottoinsieme di altri come controllo (-Dox). Utilizzare le cellule non trattate di HEI-OC1 come controlli aggiuntivi.
   5. Per valutare la proliferazione delle cellule, utilizzare un kit di proliferazione delle cellule secondo il protocollo del produttore.
      1. In breve, 48 ore dopo la trasfezione, rimuovere il terreno di coltura cellulare e aggiungere 100 µ l di soluzione colorante-associazione 1x in ciascun pozzetto della micropiastra. Incubare per 1 h a 37 ° C.
      2. Da allora in poi, misurare l'intensità della fluorescenza di ciascun campione utilizzando un lettore di micropiastre di fluorescenza (eccitazione = 485 nm, emissione = 530 nm).
   6. Per valutare ulteriormente la proliferazione delle cellule mediante immunocitochimica, piastra le cellule di HEI-OC1 un vetro di copertura in un piatto di 12-pozzetti e incubare per una notte a 37 ° C.
      1. Il giorno seguente, cotransfect con la pTet-Splice e pCMV-Tet3G ed eseguire il trattamento di Dox (+ Dox). Utilizzare cellule untransfected come controlli. Cellule di HEI-OC1 processo per d'etichettatura Ki-67.
      2. Fissare le cellule con paraformaldeide al 4% (PFA) in PBS, pH 7.4, per 10 min a temperatura ambiente. Lavare le cellule 3 x con PBS ghiacciata e incubare le cellule a 0,25% detergente non ionico in PBS per 10 min.
      3. Lavare le cellule ancora una volta, 3 x in PBS per 5 min e blocco utilizzando il 10% di siero in una camera umidificata per 1 h a temperatura ambiente.
      4. Incubare le cellule in 500 µ l di anticorpo primario Ki-67 (diluizione 1: 200) per 3 ore a temperatura ambiente o durante la notte a 4 ° C.
      5. Lavare le cellule 3 x per 5 minuti con PBS. Dopo di che, incubare le cellule con l'anticorpo secondario per 1 h a temperatura ambiente al buio.
      6. Rimuovere la soluzione di anticorpo secondario e lavare le cellule 3 x con PBS per 5 minuti ciascuno, al buio.
      7. Per l'etichettatura falloidina, incubare le cellule HEI-OC1 falloidina 1: 200 per 30 min. Per etichettare i nuclei delle cellule, incubare le cellule con 5 µ g/mL DAPI per 10 min a temperatura ambiente.
         Nota: Assicurarsi che il coniugato di tintura falloidina è diverso l'anticorpo secondario coniugato.

3. generazione del CBRb⁺/ROSA-CAG-rtTA⁺ (CBRb) topi transgenici e nei test di Vivo dell'approccio DN-CBRb

1. Al momento della conferma del regolamento Dox efficace del transgene TetO-DN-CB-myc6-Rb1 , purificare il frammento di NotI e li microinject in zigoti del mouse, che sono successivamente trasferite in pseudo-gravide.
   Nota: Queste procedure sono state effettuate presso l'University of Nebraska Medical Center (UNMC) Mouse Genome ingegneria Core impianto.
2. Dopo la consegna, genotipo i cuccioli utilizzando un primer impostare specifici per la regione di fusione CB-Rb1 : per CBRb F, 5' CTGTGGCATTGAATCAGAAATTGTGGCTGG 3 ′ e per R CBRB, uso 3 ′ 5 ′ GTACTTCTGCTATATGTGGCCATTACAACC.
   Nota: Il formato del prodotto PCR osservata su gel di agarosio è 401 bp (regione CB 60-bp + 341-bp Rb1 region (tabella 1). Sono stati identificati dieci linee di fondatore indipendente, basata sulla presenza del transgene TetO-DN-CB-myc6-Rb1 . In cinque di queste linee, progenie ha ereditato il transgene, che ha confermato la trasmissione nella linea germinale del transgene. Una delle linee transgeniche è stato infine utilizzata per stabilire e mantenere la linea e generare animali da esperimento TetO-DN-CB-myc6-Rb1 per ulteriori studi.
3. Per generare topi DN-CBRb sperimentali della razza topi adulti TetO-DN-CB-myc6-Rb1 alla linea ROSA-CAG-rtTA tetraciclina induttore (Stock #006965) (in alternativa, razza di una linea di induttore tTA). Genotipo la prole di questa croce utilizzando il seguente set di primer: per R rtTA-WT, utilizzare GGAGCGGGAGAAATGGATATG; per rtTA mutante R, utilizzare GCGAGGAGTTTGTCCTCAACC; e per rtTA comune, utilizzare AAAGTCGCTCTGAGTTGTTAT. Le dimensioni del prodotto PCR sono 340 bp (mutante), 340 bp e 650 bp (eterozigoti) e 650 bp (selvaggio-tipo).
4. Generare una curva dose-risposta della proteina RB1 dopo il trattamento di Dox per determinare il tempo e la lunghezza del trattamento Dox necessario per suscitare un'espressione del transgene.
   Nota: In questo esperimento, western blot e qRT-PCR sono stati usati per valutare il transgene tessuto-specifica attivazione e RB1 espressione.
5. Eseguire ibridazione in situ di fluorescenza (pesce) per confermare l'inserimento genomica del transgene.
   Nota: Questo è stato effettuato presso il centro di genomica applicata dell'ospedale for Sick Children (Toronto, Canada). ELISA o western blotting (usando anticorpo proteina-specifico) può essere utilizzato per valutare l'attivazione del transgene, tessuto-specificità e cambiamenti nei livelli del PDI endogeno. Per il costrutto di DN-CB-myc6-Rb1 , abbiamo utilizzato un anticorpo anti-RB1.

Risultati

In genere, una mutazione di DN la progettazione richiede una notevole quantità di informazioni sulla struttura e funzione del PDI. Al contrario, la strategia di DN presentata qui è particolarmente utile quando le informazioni strutturali e funzionali per il PDI sono limitate. Se il PDI è una proteina multimerica, una fusione di una subunità di una proteasi lisosomica dominante può inibire il multimer assemblato e, potenzialmente, altri ligandi attraverso una combinazione di proteolis...

Discussione

Per aggirare le limitazioni associate tradizionali strategie transgeniche, abbiamo cercato di generare un modello di topo in cui un PDI endogeno può essere inattivato in modo condizionale overexpressing una forma mutante di DN di esso in maniera spatiotemporal. Per abolire la funzione di PDI endogeni, diverse opzioni sono state proposte^15,16,17. Abbiamo modificato un precedente strategia genetica¹ combin...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM	GIBCO-BRL	11965-084
Minimum Essential Medium Eagle, MEME	Sigma	M8042
Fetal bovine serum	Sigma	F2442
Lipofectamine	DharmaFECT	T-2010-03
Sal I	Roche	11745622
EcoRV-HF	New England BioLabs	R3195S
NotI	Roche	13090730
CaspaTag	Millipore	APT523
DAPI	Sigma	D9542
Staurosporine	Sigma	S4400
CyQuant NF cell proliferation kit	Invitrogen	C35007
Retinoblastoma 1 antibody	Abcam	Ab6075
c-Myc antibody	Sigma	M5546
b-actin	Sigma	A5316
Ki-67	Thermofisher scientific	MA5-14520
Phallodin	Thermofisher scientific	A12379
Fluorescence microplate reader	FLUOstar OPTIMA, BMG Labtech
Epifluorescence microscope	NikonEclipse80i
The TetO-DN-CB-myc6-Rb1 (DN-CBRb) mouse line is available from the Jackson Laboratory as JAX#032011.