유도할 수 있는 고 가역 지배-네거티브 (DN) 단백질 억제

요약

여기 선물이 있는 어떤 단백질 수 수 조건부로 비활성화 역 그것의 지배적인 부정적인 돌연변이 버전 overexpressing에 의해 지배 부정적인 유도할 수 있는 시스템을 개발 하는 프로토콜.

초록

지배적인 네거티브 (DN) 단백질 억제 단백질 기능을 조작 하는 강력한 방법 이며, 다른 게놈 기반 접근을 통해 여러 가지 이점을 제공 합니다. 예를 들어 비록 공상 Cre LoxP 타겟팅 전략을 널리 사용 되어 왔습니다, (즉, 새 발기인 활동, 모자이크 Cre 식, 등) 이러한 전략의 본질적인 한계 크게 제한 하 고 그들의 응용 프로그램입니다. 또한, 많은 내 생 유전자의 완전 한 삭제는 embryonically, 출생 후 생활에 유전자 기능을 연구 하는 게 불가능 한 만드는 치명적인입니다. 이러한 과제를 해결 하기 위해 우리는 초기 유전 공학 프로토콜 중요 한 변경 있고 Rb1 유전자의 짧은 (유전자 변형) 버전 lysosomal 효소와 결합 하 여 procathepsin B (CB), Rb1의 DN 마우스 모델 생성 (CBRb). Lysosomal 효소의 존재로 인해 전체 CB RB1 융합 단백질 및 그 상호 작용 복잡 한 프로테아좀 중재 저하에 라우팅됩니다. 또한, 유전자 변형 구문에서 항생물질 유도 (rtTA) 요소 있으면 RB1 단백질의 유도할 수 있는 고 가역 규칙을 수 있습니다. CBRb 마우스 모델에서 유비 쿼터 스로 사 CAG 발기인의 존재 하기가 일시적이 고 가역 Rb1 유전자 제거 수행 하 고 거의 모든 세포 유형에 있는 그것의 활동을 이해 하기 위한 연구는 리소스를 제공 하는 유용한 도구 RB1 표현 된다.

서문

일반적으로 완전 한 제거 또는 유전자, RNA 시퀀스, 또는 관심사 (POI)의 단백질의 자르기 이어질 영구 프로세스에 의존 하는 유전자 및 단백질 제거를 목표로 대부분 접근. 이 방법의 전반적인 목표는 내 생, 야생-타입 단백질의 기능을 폐지 하 고 재조합 단백질 하입니다. 우리가 재검토 하 고 개편 한 대체 전략^1,2, DN 억제를 통해 POI의 임시 제거를 허용. 이 방법은 multimeric와 단위체 펩 티 드에 대 한 작동 하지만 단백질 multimeric 어셈블리에 기능을 위해 가장 적합 한.

메서드를 융합 하는 lysosomal 효소 CB multimeric POI (CB 퓨전 복잡 한)의 소 단위를 이루어져 있다. 복잡 한 결과 CB 퓨전 수 상호 작용 및 proteolytically 생 단백질 소화 또는 전체 CB POI 복잡 한 수 저하³리소좀을 전환. 또한, 유도할 수 있는 자연 항생물질 제어 transcriptional 활성화 (TetO) 시스템의 복잡 한 CB 융해의 함께 가역 패션²transgene의 제어 하 고 유도할 수 있는 표현에 대 한 수 있습니다. 많은 경우에 유용 하지만 치^4,,56유전자 또는 vivo에서 단백질의 완전 한 삭제 될 수 있습니다. 궁극적으로, 중요 한 게놈 요소⁷의 영구 손실 이어질 것입니다, 마찬가지로, 일부 유전자 또는 단백질 Cre/Lox 체계를 사용 하 여 조직 관련, 조건부 삭제 간단 되지 않을 수 있습니다. 따라서, 유전자 또는 POI에 따라 이러한 접근의 후속 연구에 대 한 유용한 모델을 제공 효과가 있을 것입니다 특히 유전자 또는 단백질의 기능 연구 늦은 출생 후와 성인 쥐에.

이러한 접근법과 관련 된 문제를 회피 하 고 제공 증거의 원칙에 제안된 된 방법의 효과 선택 했습니다 Retinoblastoma 1 (RB1) 단백질의 조건부 DN 버전을 생성 하 여 여기에 제시 된 메서드를 테스트 하려면. 몇 가지 옵션이 제안된^8,,910 생 RB1;의 기능을 폐지 하 고 있다 그러나, 그들의 모두 위에서 설명한 동일한 제한 사항 중 일부에 직면: RB1의 영구적인 생식 삭제 embryonically 치명적인 이며, 종양¹¹의 다양 한 종양 억제기 역할, 영구 RB1 조건부 삭제 리드. RB1의 DN 버전 자연스럽 게 발생 하지 않는, 비록 현재 사용할 수 있는 전략에 대 한 더 나은 대안 생 RB1의 일시적으로 제어 비활성화에 대 한 허용 해야 하 고 결국 복원 하는 대체 메커니즘을 제공의 기능입니다. 이러한 구문으로 2 년간 전 설명 했다¹. 그러나, 기술적 제한으로 인해 그것은 메커니즘 제어 transgene 활성화, 응답, 및 조직 특이성을 부족. 이 연구는 먼저 doxycycline (Dox)의 우아함과 결합-lysosomal 효소 CB 및 Rb1 단백질의 조작된 유전자 변형 구문으로 종속 transcriptional 시스템. 결과 CBRb 마우스 모델 일시적으로 규제 Dox 중재 RB1 허용 규정². 이러한 프로테옴 기반 접근을 사용 하 여 유전자 기능을 연구 하의 장점은 어떤 유전자의, 그것의 활동에 대 한 최소한의 정보에 대 한 채택 될 수 있다.

제안 된 DN transgene 전략 전통적인 접근에 많은 이점이 있습니다. 첫째, DN 단백질 억제 단백질 활동, 따라서 잔여 생 식 보존에 부분 절제를 리드. 이러한 결과 단백질 활동의 완전 한 제거 라이브 마우스에서 유전자 기능 연구에 어떤 조사를 크게 제한 하는 배아 치 사 율을 리드 하는 상황에서 매우 바람직합니다. 둘째, TetO 시스템의 존재는 transgene 활동의 효율적이 고 가역 제어할 수 있는 항생제, 존재만 transgene 활성화를 수 있습니다. 따라서, 항생제 관리를 중단 하 여 유전자 변형 시스템을 비활성화할 수 있습니다, 하 고는 정상적인 RB1 식이 다시 자리에에서 키를 누릅니다. 셋째, transgene 식의 특이성의 선택의 발기인에 따라 달라질 수 있습니다. 우리는 증거의 원칙에 대 한 유비 쿼터 스로 사 CAG 발기인 선택, 조직 관련 발기인 아래 transgene 삽입 가능성이 높습니다 원치 않는 transgene 식 제한이 transgene의 치료 응용 프로그램에 대 한 연구를 촉진 하 입니다.

프로토콜

유전자 변형 CBRb 마우스와 모든 동물 보호 및 연구와 관련 된 실험의 세대 Creighton 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인 되었고 그들의 지침에 의해 수행.

1. 유전자 변형 CB-Myc₆-Rb1 구문

참고: CBRb의 pTet_Splice 벡터에 클로닝 다단계 과정 (그림 1A 및 1B)에서 이루어졌다.

1. PCS2 + CB Myc6 벡터에 첫 번째 단계 복제를 수행 합니다.
   1. CBRb transgene 구문 생성, 1583-혈압-긴 Rb1 cDNA 조각 (528 아미노산 아미노산 지역 369-896에 해당) 다음 뇌관을 사용 하 여 RB1 단백질의 증폭을 설정: EcoRI +RB 1243F, 사용 GGGGAATTCA TTAAATTCAGCAAGTGATCAACCTTC, 및 XbaI + EcoRV +RB 2826R, CCCTCTAGATATCTATTTGGACTCTCCTGGGAGATGTTTACTTCC를 사용 하 여.
   2. 복제는 pCS2 + 앞에서 설명한^1,12CB Myc6 벡터의 EcoR1 및 XbaI 제한 사이트 사이 (1546 bp) 생성.
      참고: 1012-혈압-긴 CB Myc6 구문 (337 아미노산) Rb1 조각에 융합 결과 생 RB1 단백질 (~ 110 kDa) 보다 약간 작은 약 865 아미노산 (약 108 kDa), 단백질 (그림 1 ), N-말단과 C-말단에서 Rb1 에서 CB Myc₆ 태그.
2. 두 번째 단계 subcloning pTet 스플라이스 벡터에 수행 합니다.
   1. CB-RB-Myc6 퓨전 단편을 증폭 하 고 Tet 발기인을 얻기 위해 증폭 CB-myc6-Rb1 EcoRV (XbaI + EcoRV + 2826R RB)와 사리 사이트를 포함 하는 뇌관을 사용 하 여 구성 된 카세트: 사리 +CBf, CCAGTCGACAGGATGTGGTGGTCCTTGATCCTTC를 사용 합니다.
   2. PTet 스플라이스 벡터 사리 및 EcoRV 금지 사이트 같은 사이 생성 된 조각 (2567 bp) subclone 전체 TetO-DN-c B-myc6-Rb1 transgene, SV40 intron 등은 PolyA 신호 하는 방법 노트 (그림 1B)와 단일 소화를 통해 격리 될 수 있습니다.
      참고: 노트 조각 생성 유전자 변형 funders 하 사용 되었다.

2. 체 외 TetO-DN-c B-myc6-Rb1 Transgene의 테스트에서

1. Dox 레 귤 레이 션: NIH3T3 세포 선
   참고: 달리 명시 하지 않는 한 모든 볼륨 6 잘 플레이트에 대 한 조정 되었습니다.
   1. 10% CO₂와 37 ° C에서 10% 태아 둔감 한 혈 청을 포함 하는 권장된 셀 문화 미디어를 사용 하 여 공급 업체의 사양에 따라 NIH3T3 세포 성장.
   2. PTet 스플라이스 셀 cotransfect 및 pCMV Tet3G 벡터 (1 단계)에서 24 h. cotransfection에 대 한 아래에 언급 된 단계를 따르십시오.
      1. 2-4 µ L의 지질에 기초를 둔 transfection 시 약/잘 믹스 1 mL의 (혈 청) 없이 불완전 한 Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM) 실 온에서 5 분. 12 또는 24 잘 플레이트에 대 한 문화 미디어의 250 또는 500 µ L를 각각 사용 하 고 transfection 시 볼륨을 조절 합니다.
      2. Transfection 시 약-DMEM에 플라스 미드 DNA/잘의 2-3 µ g을 추가 하 고 실 온에서 20 분 동안 품 어.
      3. DNA와 DMEM transfection 시 약 각 잘을 포함 하는 믹스를 추가 합니다. 외피의 3-4 h, 후 (되도록 마지막 볼륨 2 mL/음) 완전 한 미디어의 1 mL를 추가 합니다. Dox 주식 (1 mg/mL)의 aliquots를 유지 하 고 웰 스 (+ Dox)의 각각에서 2 µ L를 추가. 5% CO₂와 37 ° C에서 세포를 품 어.
         참고: 컨트롤 샘플 Dox 치료 하지 않을 cotransfected 세포를 이루어져 있어야 한다 (-Dox), 뿐만 아니라 NIH3T3 세포 transactivator pCMV-Tet3G 벡터 만으로 페 고 Dox 24 시간 기간에 대 한 치료. PCMV-Tet3G, 농도 대 한 0.1-1 µ g/mL Dox transgene 표현을 유도 충분 해야 한다.
2. HEK293 세포 선을 사용 하 여 구성의 반전 기능을 테스트 합니다.
   1. TetO-DN-c B-myc6-Rb1 transgene의 가역, 문화 HEK293 세포에서이 글의 최소 필수 매체 (EMEM) 공급 업체의 사양에 따라 테스트 및 설명 하는 대로 24 h pTet 스플라이스 및 pCMV Tet3G 벡터와 cotransfect (2.1.2 단계) 위의.
   2. Transgene 비활성화에 대 한 24 시간 후 Dox 포함 된 미디어를 제거 하 고 씻어 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)와 셀 2 x-3 x Dox 무료 미디어 추가 24 h에 대 한 그들을 품 어.
      참고: Dox 제거 시 transgene 비활성화 및 일반 단백질 표정 그 24 시간 기간 내에 재개 한다.
3. 예약 되지 않은 세포 증식 촉진 TetO-DN-c B-myc6-Rb1 구조물의 기능을 평가 하기 위해 아래 설명 된 대로 헤이 OC1 셀 라인을 사용 하 여 기능 분석을 수행 합니다.
   1. 문화 헤이 OC1 셀 10% 허용 아래 DMEM 조건 (10% CO₂33 ° C). 세포 증식 연구, 96 잘 접시 200 µ L 볼륨에서에 셀 카운터 및 접시 10000 헤이 OC1 셀을 사용 하 여 셀을 계산. 셀을 밤새 품 어.
   2. 다음 날에 수행 pTet 스플라이스 및 pCMV Tet3G 벡터 지질에 기초를 둔 transfection 시 약의 과도 cotransfection (단계 2.1.2 참조). 에 별도 잘 pmR ZsGreen1 transfection at2-µ g을 transfection 계산 지질에 기초를 둔 transfection 시 약 (2.1.2 단계)을 사용 하 여 수행 합니다. 비 페 세포를 사용 하 여 컨트롤.
   3. 형광 현미경에서 녹색 형광의 존재를 감지 (여기 = 485 nm, 방출 = 530 nm) transfection 후 24 h 대는 transfected 세포. 녹색 형광의 유무를 기록 하 고 계산 transfection GFP-긍정적인 세포 (transfected 세포)의 총 수로 DAPI (전체 세포)으로 표시 하는 셀에.
      참고: 우리 ~ 70%의 transfection 속도 추정.
   4. Transgene 식 유도, 추가 1 µ g/mL Dox transfected 세포의 부분 집합에 다른 하위 집합을 사용 하 여 제어 하는 동안 (-Dox). 치료 헤이 OC1 세포를 사용 하 여 추가 컨트롤.
   5. 제조업체의 프로토콜에 따라 셀 확산 키트를 사용 하 여 세포 증식을 평가.
      1. 간단히, transfection, 후 48 h 세포 배양 매체를 제거 하 고는 미 판의 각 음에 염료 바인딩 솔루션 x 1의 100 µ L를 추가 합니다. 1 h 37 ° c.에 품 어
      2. 그 후, 형광 microplate 리더를 사용 하 여 각 샘플의 형광 강도 측정 (여기 = 485 nm, 방출 = 530 nm).
   6. 추가 평가 하 immunocytochemistry를 사용 하 여 세포 증식, 접시는 12-잘 접시 커버 유리에 헤이 OC1 셀 고 37 ° c.에서 밤새 품 어
      1. 다음 날, pTet 스플라이스와 pCMV-Tet3G cotransfect 하 고 Dox 처리 (+ Dox)을 수행 합니다. Untransfected 세포를 사용 하 여 컨트롤. 기-67 라벨에 대 한 프로세스 헤이 OC1 셀.
      2. PBS, pH 7.4, 실 온에서 10 분에에서 4 %paraformaldehyde (PFA)와 셀을 수정 합니다. 3 세포를 씻어 얼음 처럼 차가운 PBS 가진 x 10 분에 대 한 PBS에 0.25% 비 이온 세제에 셀을 품 어 고.
      3. 세포를 씻어 다시, 3 x 5 분, 그리고 실 온에서 1 h 습도 챔버에 10% 혈 청을 사용 하 여 블록에 대 한 PBS에.
      4. 실 온에서 3 시간 기-67 1 차 항 체 (1: 200 희석)의 500 µ L에서 세포를 품 어 또는 4 ° c.에서 하룻밤
      5. 3 세포를 씻어 PBS 가진 5 분 x. 그 후, 어둠 속에서 실 온에서 1 h에 대 한 이차 항 체와 세포를 품 어.
      6. 이차 항 체 솔루션을 제거 하 고 세척 셀 3 어둠 속에서 각 5 분 PBS와 x.
      7. Phalloidin 라벨에 대 한 헤이 OC1 셀 30 분 1: 200 phalloidin에 품 어. 세포의 핵을, 실 온에서 10 분 동안 5 µ g/mL DAPI 셀을 품 어.
         참고: Phalloidin 염료 공액 다른 이차 항 체 공액 인지 확인 합니다.

3. CBRb⁺/ROSA-CAG-rtTA⁺ (CBRb)의 세대 유전자 변형 마우스 Vivo DN-CBRb 접근의 테스트에서

1. TetO-DN-c B-myc6-Rb1 transgene의 효과적인 Dox 규제의 확인, 노트 조각 정화 하 고 마우스 zygotes, 의사 임신 여성으로 전송 나중에 그들을 microinject.
   참고: 이 절차는 네브라스카 대학 의료 센터 (UNMC) 마우스 게놈 엔지니어링 핵심 시설에서 실행 되었다.
2. 배달, 유전자 형 새끼는 뇌관을 사용 하 여 설정 CB Rb1 퓨전 지역 후: CBRb F 5' 3 ' CTGTGGCATTGAATCAGAAATTGTGGCTGG, 사용 하 고 CBRB R 5 ' GTACTTCTGCTATATGTGGCCATTACAACC 3 사용.
   참고: 관찰 하는 agarose 젤에 PCR 제품 크기는 401 혈압 (60-bp CB 지역 + 341-bp Rb1 지역 (표 1). 10 개의 독립 설립자 라인 TetO-DN-c B-myc6-Rb1 transgene의 존재에 따라, 확인 되었다. 이 라인의 5, 자손은 transgene의 생식 전송 확인 transgene 상속. 유전자 변형 라인 중 하나는 궁극적으로 설정 하 고 라인을 유지 하 고 추가 연구에 대 한 실험 TetO-DN-c B-myc6-Rb1 동물을 생성 하 사용 되었다.
3. 실험 DN-CBRb 쥐 생성 하 로 사-CAG-rtTA 항생물질 유도 선 (사진 #006965) (또는, 온 유도 선 품종)에 성인 TetO-DN-c B-myc6-Rb1 생쥐를 사육 한다. 유전자 교차 하는 다음 뇌관 세트를 사용 하 여이의 자손: rtTA WT R 사용 GGAGCGGGAGAAATGGATATG; rtTA 돌연변이 연구, 사용 GCGAGGAGTTTGTCCTCAACC; 그리고 일반적인 rtTA, AAAGTCGCTCTGAGTTGTTAT를 사용. PCR 제품의 크기는 340 bp (돌연변이), 340 혈압과 650 혈압 (heterozygote), 그리고 650 bp (야생-타입).
4. RB1 단백질 Dox 처리 시간과 Dox 처리 transgene 식을 유도 하는 데 필요한의 길이 확인 하려면 다음의 복용량 응답 곡선을 생성 합니다.
   참고: 이 실험에서 서쪽 오 점와 qRT-PCR 조직 관련 transgene 활성화 및 RB1 식을 평가 하기 위해 사용 되었다.
5. 형광 제자리에서 교 잡 (물고기)는 transgene의 게놈 삽입 확인을 수행 합니다.
   참고: 이 실행 되었다 센터에서 병원의 적용 유전체학에 대 한 아픈 어린이 (토론토, 캐나다). ELISA 또는 서 부 럽 (단백질 특정 항 체를 사용 하 여) transgene 활성화, 조직 특이성, 그리고 생 POI의 수준에서 변화를 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다. DN-c B-myc6-Rb1 구문 안티 RB1 항 체를 사용 했습니다.

결과

일반적으로, 상당한 양의 구조에 대 한 정보 및 POI의 기능 필요 DN 돌연변이 설계 합니다. 반면, 여기에 제시 된 DN 전략은 POI에 대 한 구조 및 기능 정보는 제한 하는 경우 특히 유용 합니다. 조립된 multimer 및, 잠재적으로, 생 subunits의 베이스와의 subcellular 전환의 조합을 통해 다른 ligands lysosomal 효소를 한 소 단위의 융합 POI multimeric 단백질 인 경우에, 억제 지배적 수는 multimer...

토론

우회 전통적인 유전자 변형 전략와 관련 된 한계, 우리는 내 생 포 수 수 조건부로 비활성화 spatiotemporal 방식에서 그것의 DN 돌연변이 형태를 overexpressing에 의해 마우스 모델을 생성 하고자 했다. 내 생 Poi의 기능을 폐지 하 고 몇 가지 옵션이 제안된^15,,1617되었습니다. 우리 그 식의 표현에 영향을 미치는 돌연변이 펩 티 드를 생?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM	GIBCO-BRL	11965-084
Minimum Essential Medium Eagle, MEME	Sigma	M8042
Fetal bovine serum	Sigma	F2442
Lipofectamine	DharmaFECT	T-2010-03
Sal I	Roche	11745622
EcoRV-HF	New England BioLabs	R3195S
NotI	Roche	13090730
CaspaTag	Millipore	APT523
DAPI	Sigma	D9542
Staurosporine	Sigma	S4400
CyQuant NF cell proliferation kit	Invitrogen	C35007
Retinoblastoma 1 antibody	Abcam	Ab6075
c-Myc antibody	Sigma	M5546
b-actin	Sigma	A5316
Ki-67	Thermofisher scientific	MA5-14520
Phallodin	Thermofisher scientific	A12379
Fluorescence microplate reader	FLUOstar OPTIMA, BMG Labtech
Epifluorescence microscope	NikonEclipse80i
The TetO-DN-CB-myc6-Rb1 (DN-CBRb) mouse line is available from the Jackson Laboratory as JAX#032011.