JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Мы описываем всеобъемлющий и практический протокол для флуоресценции восстановления после Фотообесцвечивание экспериментов с живой клетки. Хотя протокол был использован для измерения мобильности Жёлтый флуоресцентный протеин тегами p62 в aggresome-индуцированной структуры, он может применяться для различных систем микроскопии и флуоресцентных белков.

Аннотация

Флуоресценции восстановления после Фотообесцвечивание (FRAP) микроскопии технику, которая может использоваться для количественной оценки подвижности белков в живых клеток. В типичном эксперименте FRAP установившегося флуоресценции наблюдается при повторных изображений с низкой интенсивности лазерного света. Впоследствии флуоресцентных молекул быстро и необратимо зрением через кратковременного воздействия высокой интенсивности лазерного света. Информация о мобильности белок получается путем мониторинга восстановления флуоресценции. Мы использовали FRAP для определения мобильности p62 в искусственных структур (ОВНМ) aggresome как в мышиных макрофаги после стимуляции с липополисахарида (LPS). Потому что многие существующие протоколы FRAP являются либо неполными, либо сложные, нашей целью было обеспечить всеобъемлющий, практический и простой шаг за шагом протокол для FRAP экспериментов с живой клетки. Здесь мы описываем transfection RAW264.7 макрофагов с желтый флуоресцентный белок p62 (рекламы ЯФП p62), индукции ALIS, подвергая клетки ПЛАСТИНОК и шаг за шагом метод для сбора целлюлоз и postbleach FRAP изображений и анализа данных. Наконец мы обсудим важные факторы, которые следует учитывать при проведении FRAP эксперимент.

Введение

Флуоресценции восстановления после того, как Фотообесцвечивание (FRAP) является методом микроскопии, который может использоваться для количественного определения динамики белков в живой клетки1,2. Популярность FRAP возросла из-за широкой коммерческой доступности лазерного сканирования конфокальные микроскопы с высоким разрешением, скорость и чувствительность, и «Радуга» из генетически закодирована флуоресцентных белков, таких как Зеленый флуоресцентный белок (ГПУП) и желтый флуоресцентный белок (рекламы ЯФП)3. Генетически закодированный флуоресцентные белки сплавлены к протеину интереса для субцеллюлярные локализация протеина интереса. В типичном эксперименте FRAP установившегося флуоресценции в регионе приобретения интереса (ROI) в ячейке наблюдается через повторяющиеся изображения что ROI с низкой интенсивности лазерного света. Впоследствии флуоресцентных молекул быстро и необратимо нарушена в стандартное подмножество приобретения ROI, далее именуемые как отбеливатель ROI, путем кратковременного воздействия высокой интенсивности лазерного света. Как новые небеленой белки пополнить отбеленной белки с течением времени, скорость и интенсивность флуоресценции восстановления в отбеливатель ROI предоставляет сведения о белка мобильности (рис. 1)4.

Наша заинтересованность в определении подвижности убиквитин p62 связывания белка (также известный как sequestosome-1) в aggresome как искусственных структурах (ОВНМ) в мышиных RAW264.7 макрофаги после стимуляции с липополисахарида (LPS) привели нас пересмотреть FRAP литература. К сожалению многие из существующих протоколов FRAP являются неполными или чрезмерно сложной в5,6,,78,9. Некоторые не представить подробную информацию о параметрах лазер, луч путь конфигурации и изображения приобретения параметры5,6,,78,9. Другие опущены ключевые детали относительно анализа данных, таких как вопрос о отбеливатель ROI дрейф6,9 или как рассчитать важные восстановления параметров, включая мобильные дроби (fM), неподвижные фракция (Яf) и половина время восстановления (½t)5,7. И наоборот, другие делается слишком большой упор на сложных математических формул, используемых для вычисления Mf, яfи t1/25,6,8,9. Таким образом наша цель – обеспечить всеобъемлющий, практический и простой шаг за шагом протокол для FRAP экспериментов с живой клетки.

протокол

1. RAW264.7 макрофагов Transfection

  1. Культура 100000 RAW264.7 клеток (Таблица материалов) в полной питательной среды (Дульбекко изменение Eagle среднего (DMEM)) (Таблица материалов) содержащий 4,5 г/Л глюкозы с 10% плода бычьим сывороточным (Таблица материалов ) и пенициллин/стрептомицина (Таблица материалов) на необработанной 35-мм стекло дно блюда (Таблица материалов) и место блюда в 37 °C/5% CO2 инкубатора. На следующий день transfect клетки, с помощью polyethylenimine 1 мг/мл (PEI) (Таблица материалов).
  2. Mix 1,5 мкг рекламы ЯФП p62 с 8 мкл PEI в 166 мкл DMEM сыворотки бесплатно (базовый средний без плода бычьим сывороточным и пенициллин/стрептомицина).
  3. Пусть смесь сложных трансфекции сидеть при комнатной температуре в течение 15 минут перед добавлением в смесь в каждой пластинке.
  4. Добавьте комплексов в существующих средних с клетки и рок плита осторожно.
  5. Место пластину в 37 ° C /5% CO2 инкубатора на ночь.
  6. Следующим утром, аспирационная среднего от пластину, затем ополосните раз с полной средой. Добавить 2 мл полного среднего к пластине и позволяют клеткам восстанавливаться до следующего дня.

2. индукция ALIS с липополисахарида (LPS)

  1. На следующий день, аспирационная среднего из пластин, то добавьте 1 mL полного среднего содержащий 10 нг/мл ПЛАСТИНОК (Таблица материалов). Разрешить пластины для инкубации для 5 h в 37 °C/5% CO2 инкубатора.
  2. После лечения LPS аспирационная носитель, а затем добавьте 1 mL холодной, стерильные Tyrode буфера, содержащий 145 мм NaCl, 5 мм хлористого калия, глюкозы 10 мм, CaCl 1,5 мм2, 1,0 мм MgCl2и 10 мм HEPES (рН 7,4) для полоскания пластину.
  3. Аспирационная буфера, а затем добавьте 1 mL холодной, стерильные Tyrode буфера с 10 мкг/мл Нокодазол (Таблица материалов). Разрешить пластины для инкубации на 4 ° C на 15-20 мин до FRAP томографии и анализа.
    Примечание: Использование Tyrode в буфер, содержащий HEPES как буферизация соединения позволяет для изображений должны быть выполнены при комнатной температуре. Нокодазол была использована для уменьшения ALIS движение микротрубочек. Культура средних содержит бикарбонат как буферизации соединения, требующие CO2 в буфер. В противном случае, бикарбонат содержащихся в средних изменения рН в отсутствие CO2.

3. Установка Конфокальный микроскоп и выбора области интереса

  1. Лазерная выбор и настройка путь луча
    1. Используйте любой подходящий конфокального микроскопа (Таблица материалов) с целью или Дзэн программного обеспечения (Таблица материалов) или любого подходящего программного обеспечения обработки изображений.
    2. Выберите линии 514 Нм аргон/2 лазера, как рекламы ЯФП имеет пик возбуждения в 512 Нм и пик выбросов на 527 Нм. Нажмите кнопку получить , а затем нажмите кнопку лазера . В окне управления лазерным, нажмите аргон/2 458, 477, 488, 514 Нм, нажмите кнопку Standby . После ожидания ~ 3 мин для лазера, чтобы согреться, нажмите на (рис. 2).
    3. Установите мощность лазера линии лазера аргон/2 514 Нм до 100% (8.6 A). Нажмите кнопку получить , а затем нажмите кнопку лазера . В окне управления лазерным введите 100 в поле вывод [%] , затем нажмите кнопку Enter (рис. 2).
    4. Установите передачи линии лазера аргон/2 514 Нм до 5%. Нажмите кнопку приобрести , а затем каналы . В окне Проверки управления нажмите кнопку каналов , затем нажмите квадратный белый флажок слева от текста 514 Нм в столбце активные линии для того чтобы активировать 514 Нм лазерной линии. Введите 5 в области передачи [%] 514 Нм лазерной линии (Рисунок 2D).
    5. Установите в положение HFT 458/514/561 первичного дихроичных пучка сплиттер (Хаупт Farb Teiler (HFT)), таким образом, что эти полосы отклоняются для образца для возбуждения. Нажмите кнопку получить , затем кнопку Config . В окне Настройки управления нажмите кнопку Кнопка Режим канала , затем Один трек . HFT , нажмите кнопку выберите HFT 458/514/561 из раскрывающегося меню (рис. 2B).
    6. Установите первый splitter вторичных дихроичных луча (1 Neben Farb Teiler (NFT1)) зеркало позицию, которая будет отвлекать 100% света для второй вторичных дихроичных пучка сплиттер (Neben Farb Teiler 2 (NFT2)). Нажмите кнопку получить , затем кнопку Config . В окне Настройки управления нажмите кнопку Кнопка Режим канала , затем Один трек . NFT1 , нажмите кнопку выбрать зеркало из раскрывающегося меню (рис. 2B).
    7. Установите второй вторичный дихроичных пучка сплиттер (NFT2) в положение NFT 515 обеспечить что волн < 515 нм будут отражены и длин волн > 515 нм будет передаваться. Нажмите кнопку получить , затем кнопку Config . В окне Настройки управления нажмите кнопку Кнопка Режим канала , затем Один трек . NFT2 , нажмите кнопку выберите NFT 515 из раскрывающегося меню (рис. 2B).
    8. Установите фильтр выбросов длинный пас (LP) (EF) LP 530, так что волны > 530 Нм будет передаваться на фотоумножителе трубу (ПЛТ, детектор). Нажмите кнопку получить , затем кнопку Config . В окне Настройки управления нажмите кнопку Кнопка Режим канала , затем Один трек . Нажмите кнопку Фильтр выбросов , а затем выберите LP 530 из раскрывающегося меню (рис. 2B).
    9. Выберите канал 3. Нажмите кнопку получить , затем кнопку Config . В окне Настройки управления нажмите кнопку Кнопка Режим канала , затем Один трек . Нажмите на квадрат белой коробке слева от кнопки Ch3 .
  2. Приобретение настройки изображения
    1. Выберите план-Апохромат 63 x / 1,40 масло цель (Таблица материалов). Просмотр образца через окуляр микроскопа и место ALIS в центре поля зрения. Нажмите кнопку получить , а затем микро . В окне Управления микроскопом , нажмите на Цель, а затем выберите план-Апохромат 63 x / 1,40 масло цель из раскрывающегося меню.
    2. Установите размер кадра, 512 x 512 пикселей, скорость сканирования до 8и данных глубиной до 12 бит. Нажмите кнопку получить , нажмите кнопку Сканировать . В окне Проверки управления нажмите кнопку режим и кнопку рамку , а затем нажмите на кнопку 512 . 8 ввод в поле Скорость сканирования , нажмите клавишу Enter, а затем нажмите на кнопку 12 бит (рис. 2C).
    3. Установите в среднем сканирования 1 и оптический зум 3. Нажмите кнопку « получить », а затем нажмите кнопку « Сканировать ». В окне Проверки элемента управления нажмите кнопку со стрелкой вниз среднее число поля сканирования, а затем выберите 1 из раскрывающегося меню. Введите в поле оптический зум 3 , а затем нажмите клавишу Enter (рис. 2C).
    4. Установите обскуры 1.95 просторных единиц и детектор получить до 582 (чуть ниже насыщения). Нажмите кнопку получить , нажмите кнопку Сканировать . В окне Проверки элемента управления нажмите кнопку « каналы », введите в поле обскуры 196 , нажмите Enter. Введите в поле получить детектор 582 , а затем нажмите клавишу Enter (рис. 2D).
    5. Убедитесь, что линия лазера аргон/2 514 Нм до 100% мощности (8.6 A). Нажмите кнопку получить , затем кнопку лазера . В меню Управления лазерным значение в поле вывода [%] должно быть 100 (рис. 2).
    6. Убедитесь, что линия лазера аргон/2 514 Нм для передачи 5%. Нажмите кнопку получить , нажмите кнопку Сканировать . В окне Проверки элемента управления значение в поле передачи [%] для 514 Нм лазерной линии должна быть 5 (рис. 2D).
    7. Создайте квадратная ROI (приобретение ROI), имеющий размеры 150 x 150 пикселей (194.62мкм). Нажмите кнопку получить , затем Редактировать ROI . В меню Редактировать ROI , щелкните значок прямоугольник, а затем щелкните и перетащите в окне изображения для создания квадрат, который имеет размеры 150 x 150 пикселей (194.6 µm2) (рис. 1A).
      Примечание: Приобретение ROI включает в себя (ALIS интерес, (b) площадью флуоресценции, которая не является ALIS (управления ROI) и по крайней мере 20 x 20 пикселей (3,3 мкм2) и (c) площадью мало, чтобы без флуоресцирования (фон ROI), по крайней мере 20 x 20 пикселей (3,3 мкм 2) (рис. 1A). Важно включить элемент управления ROI в приобретении ROI, так что Фотообесцвечивание, которые могут произойти с повторных изображений может контролироваться. Приобретение ROI, который определяется здесь будет только область, которая будет проверяться. Повторные лазерного сканирования в рамках приобретения ROI только будет ограничивать Фотообесцвечивание ROI а не, например, Фотообесцвечивание всю ячейку или несколько ячеек, и количество пикселей, собранных на ПЛТ (детектор) будет больше, чем количество Пиксели, собранные на ПЛТ (детектор) после сканирования всю ячейку или несколько ячеек.
    8. Настройка временных рядов такие что приобретение ROI сканируется 35 раз, один раз каждые 30 s. Нажмите кнопку « получить », а затем кнопку Временных рядов . В окне Управления серии времени нажмите кнопки ручной старт серии и руководство остановить серии . 35 , введите в поле серии остановку вручную, нажмите клавишу Enter , а затем нажмите кнопку задержки цикла 30.0 sec (Рисунок 2E).
    9. Установите регулятор отбеливатель, таким образом, что Фотообесцвечивание будет происходить после сканирования номер 5, собирать 5 целлюлоз изображений приобретения ROI. Нажмите кнопку получить , затем кнопку Редактировать отбеливателем . В окне Управления, Bleach щелкните белый квадрат рядом с отбеливателем после номер сканирует. Введите 5 в поле номер сканирования, а затем нажмите клавишу Enter (рис. 2F).
      Примечание: Целлюлоз и postbleach изображения должны быть приобретены на одинаковой оптической глубине.
    10. Создание циркуляр образный отбеливатель ROI в ALIS, которая имеет диаметр 10-пиксель (площадь = 0,8 мкм2). Нажмите приобрести | Редактировать Отбеливатель | Определение регионов. В окне Bleach регионов щелкните значок круга . Щелкните и перетащите в окне изображения, чтобы создать круг, диаметр которого 10 пикселей (площадь = 0,8 мкм2) (рис. 2F).
    11. Установите итераций до 300. Нажмите кнопку получить , затем кнопку Редактировать отбеливателем . В окне Управления, Bleach введите 300 в поле итерации, а затем нажмите клавишу Enter (рис. 2F).
    12. Установите аргон/2 514-Нм лазерной линии на 100% мощности (8.6 A) и 100% передачи во время отбеливателя. Нажмите кнопку получить , затем кнопку Редактировать отбеливателем . В окне Управления, Bleach , щелкните белый квадрат слева от 514 Нм. В поле передачи [%] введите 100 для линии лазера 514 Нм, а затем нажмите кнопку Enter (рис. 2F).
      Примечание: Количество итераций необходимо определить эмпирически. Это будет варьироваться в зависимости от Флюорофор, размер структуры, которая будет беленой и лазера.
  3. Сбор данных
    1. Запустите эксперимент FRAP. Собирать первые 5 целлюлоз изображений и первый postbleach, а затем рассчитать отбеливатель глубины по следующему уравнению.
      figure-protocol-14404
      Если глубина отбеливатель < 90, остановить эксперимент и отбросить данные, как глубина отбеливатель не было достаточно. Когда глубина отбеливатель ≥90, сбор данных для анализа с обработки изображений программы и программу электронных таблиц (Таблицы материалы).
      Примечание: Когда дрейф ALIS ≥3 мкм, остановить эксперимент и отбросить данные, как эта сумма смещения изображения не могут быть исправлены для анализа с программное обеспечение для обработки изображений (Таблица материалов). При дрейфе ALIS < 3 мкм, сбор данных для анализа данных с обработки изображений программы и программу электронных таблиц (Таблицы материалы).
    2. Сбор данных FRAP от 10 ALIS из 10 клеток с менее чем 3 мкм дрейфа ALIS. Далее передачи файлов теперь цель на персональный компьютер для анализа данных.
  4. Анализ данных в программу обработки изображений
    1. Правильное изображение дрейфа, выравнивание или сопоставления (т.е. регистрации) стека времени серии изображений приобретения ROI. Чтобы сделать это, откройте каждый файл теперь цель с помощью программы обработки изображений (Таблица материалов), затем выберите плагины | Регистрация | StackReg | Перевод. Далее, выберите плагины | Регистрация | StackReg | Твердого тела10.
    2. Set-up ROI менеджер для измерения интенсивности сигнала в отбеливатель ROI. Выберите анализировать | Инструменты | Менеджер по ROI. Выберите инструмент « овал », а затем нарисовать круг в отбеливатель ROI с диаметром 10 пикселей, а затем нажмите кнопку Добавить .
    3. Set-up ROI менеджер для измерения интенсивности сигнала в элементе управления ROI. В ROI менеджер, выберите инструмент « прямоугольник », нарисовать квадрат 20 x 20 пикселей в регионе ROI управления, затем нажмите кнопку Добавить .
    4. Set-up ROI менеджер для измерения интенсивности сигнала на заднем плане ROI. В ROI менеджер, выберите инструмент « прямоугольник », нарисуйте квадрат 20 x 20 пикселей в регионе ROI фон, а затем нажмите кнопку Добавить .
    5. Переименуйте ROIs. После добавления ROIs анализируемым в Диспетчере ROI, переименуйте, их отбеливать ROI, управления ROIи Фон ROI на соответственно.
    6. Мера интенсивности сигнала в ROIs. Bleach ROI, управления ROIи ROI фона, выберите более | Multi мера. Убедитесь, что выбраны измерения всех 35 фрагментов и одну строку для каждого фрагмента . В окне Набор измерений убедитесь, что только означает значение серого выбран.
      Примечание: Это необработанные данные FRAP (рис. 1Б).
    7. Вставьте результаты в программу электронных таблиц (Таблицы материалы). Копирование отбеливатель ROI, управления ROI, и интенсивности сигнала фона ROI результаты, а затем вставить их в столбцы помечены Bleach ROI, управления ROIи Фон ROI, соответственно в программе электронных таблиц (Таблицы материалы).
  5. Анализ данных в программу электронных таблиц
    1. Фон исправить интенсивности сигнала в отбеливатель ROI и управления ROI (рис. 1A, C). Используйте инструмент Вставка функции в программе электронных таблиц (Таблицы материалы) для вычитания значения в столбце надписью Фон ROI от значений в столбце помечены Bleach ROI. Вычитание значения в столбце надписью Фон ROI от значений в столбце под названием Управления ROI. Пометьте эти новые столбцы Исправлены Bleach ROI и ROI управления исправлениями.
    2. Нормализации сигнала в отбеливатель ROI на фоне исправлены сигнал в элементе управления ROI (рис. 1A, D). Используйте функцию вставки в программу электронных таблиц (Таблицы материалы) для разделения значений в столбце помечены Исправлены Bleach ROI значения в столбце помечены Исправлен управления ROI. Обозначить этот новый столбец Нормированный ROI исправлены отбеливателем.
    3. Нормализовать сигнал в столбце Нормированный ROI исправлены отбеливателя в среднем 5 целлюлоз значений в отбеливатель ROI (рис. 1A, E). Вычисление среднего значения 5 целлюлоз в отбеливатель ROI. Далее разделите значения в столбце, обозначены в среднем 5 целлюлоз значений в отбеливатель ROI Нормированный ROI исправлены отбеливателем . Обозначить этот новый столбец Нормированный исправлены Prebleach средняя Bleach ROI.
  6. Мобильная часть и половину времени восстановления от кривой установлены данных
    1. Кривой fit нормализованные и исправлениями отбеливатель ROI данных с помощью программы обработки изображений (Таблица материалов). В программе обработки изображений обработки (Таблица материалов), выберите анализ | Инструменты | Кривой установки. Копия postbleach нормированные и исправлены отбеливатель ROI значения и соответствующие значения времени, затем вставить их в окне Слесарь кривой . Экспоненциальная восстановления от Кривой слесарь раскрывающегося меню, выберите подходят.
    2. Рассчитать Mf от параметров функции восстановления, которая предоставляет значения для: «,» медленно восстанавливающийся фракция; «b», скорость восстановления; и «c», быстро диффундирующих дроби. Рассчитать Mf , подключив значения для «» и «c» в уравнение Mf = + c. вычислить If с помощью уравнения яf = 1 - Мf. Рассчитать t½ , заменив значение для «b» в уравнение figure-protocol-20814 затем решения для t1/2. 11

Результаты

Показанный здесь являются результатом типичного эксперимент, в котором мы использовали FRAP для изучения степени мобильности p62 в ALIS в RAW264.7 клетках, обработанных с ПЛАСТИНОК для 3-5 h12. Рисунок 3 A показывает необработанные данные, полученные от отбеливателя, контролировать и фон ROI после того, как стек изображений были согласованы исправить для небольших количествах (< ~ 3 мкм) изображения дрейфа ALIS. Рекламы ЯФП p62 флуоресценции в этом Алиса в prebleach и postbleach показан на рисунке 3E и дополнительного видео 1. Рисунок 3 B показывает эти данные после фон коррекции. Рисунок 3 C показывает эти данные после исправления для флуоресценции в элементе управления ROI. Рисунок 3 D показывает эти данные нормированы среднее флуоресценции 5 целлюлоз значения в отбеливатель ROI. Степень отбеливания было достаточно в этом эксперименте (отбеливатель глубина = 91,94). Рекламы ЯФП p62 флуоресценции в этом ALIS восстановлены медленно, как t1/2 = 128,27 s (2,14 мин). Рекламы ЯФП p62 был не очень мобильный белка в этом эксперименте, как Mf = 21,97 и яf = 78.03.

figure-results-1502
Рисунок 1 : Схема RAW264.7 клеток и шаги для анализа изображений после FRAP изображения были согласованы для коррекции изображения дрейф ALIS. (A) схема RAW264.7 ячейки с изображением несколько ALIS и отбеливатель, управления и трансформирования фон в пределах приобретение ROI. (B) идеализированной изображением сырья FRAP данные получены в отбеливателя, управления и фон ROIs панели а. (C) идеализированной граф необработанных данных FRAP, были исправлены фон. (D) идеализированной граф фон исправлены FRAP данные были нормализованы по флуоресценции в элементе управления ROI. (E) идеализированной граф нормализованные и фон исправлены данные FRAP, нормализовались для целлюлоз флуоресценции в отбеливатель ROI. Сокращения: Con = контроль; BG = фон. Эта цифра была изменена от Рабю и Элленберга4. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-2767
Рисунок 2: Изображения пользовательского интерфейса в цель программного обеспечения (таблица материалов) для выбора лазер, луч путь конфигурации и параметров получения изображений для экспериментов FRAP. (A) лазерной контролировать экране лазерные линии аргон/2, вывода и трубки тока используется. (B) конфигурации управления экрана показаны пучка сплиттер и выбросов фильтрации параметров используется. (C) сканирования управления экрана показаны параметры, используемые для захвата изображений. (D) проверка управления экране обскуры, детектор усиление, смещение усилитель, усилитель выгоды и параметры передачи для аргона/2 514 Нм лазерной линии. (E) временных рядов управления экрана показаны параметры серии времени. (F) дезинфицирующие средства управления экрана показаны prebleach и postbleach используемые параметры. Сокращения: HFT = Хаупт Farb Teiler (первичный дихроичных пучка сплиттер); NT1 = Neben Farb Teiler 1 (первый средней дихроичных пучка сплиттер); NT2 = Neben Farb Teiler 2 (второй вторичный дихроичных пучка сплиттер); EF = фильтр выбросов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-4290
Рисунок 3 : Представитель FRAP эксперимент для изучения рекламы ЯФП p62 динамика в ALIS в клетках RAW264.7. (A) Raw флуоресценции интенсивность данных для отбеливатель, управления и фона ROI. (B) данные, приведенные в группе A после того, как дезинфицирующие средства и управления ROI были исправлены для флуоресценции в фоновом режиме ROI. (C) данные, приведенные в панели A и B после нормализации интенсивности флуоресценции в отбеливатель ROI для счета для флуоресценции в фон исправлены управления ROI. (D) по данным в панели A-C после нормализации интенсивности флуоресценции в нормализованные и фон исправлены отбеливатель ROI для среднего значения первых 5 целлюлоз в отбеливатель ROI. Mf = 21,97, яf = 78.03,1/2 t = 128,27 с (2,14 мин) и отбеливатель глубина = 91,94. (E) изображение Алиса в prebleach (1,5 мин) и postbleach (0, 6 и 16 min). Шкалы бар = 5 мкм и действительна для всех панелей. Сокращения: Con = контроль; BG = фон; Корр = исправлено; Норма. = нормализованы; СР = среднее. Эта цифра была изменена с Cabe et al.12пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-5825
Дополнительные видео 1: типичный Алиса в RAW264.7 макрофагов, до и после Фотообесцвечивание. Рекламы ЯФП p62 флуоресценции медленно восстанавливаться после photobleach; Следовательно p62 является не очень мобильный белок. Для этого эксперимента, Mf = 25.62, яf = 74,38, т1/2 = 442.79 s (7.38 мин) и отбеливатель глубина = 90,19. Шкалы бар = 5 мкм. Это видео был изменен с Cabe et al.12пожалуйста нажмите здесь для просмотра этого видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)

Обсуждение

Мы предлагаем всеобъемлющий, практический и простой шаг за шагом протокол для FRAP экспериментов с живой клетки. Здесь протокол был использован для измерения мобильности рекламы ЯФП p62 в ALIS в RAW264.7 макрофагов, но он может быть применен к многие из лазерного конфокального микроскопа системы сканирования и генетически закодированный флуоресцентных белков, которые теперь доступны. Для любой системы, микроскопия экспериментальные эксперименты имеют решающее значение для определения оптимальных параметров FRAP, включая приобретение, отбеливатель и управления ROI размеров, интенсивности лазера для Фотообесцвечивание и приобретение целлюлоз и postbleach изображения. Это разумно ожидать оптимальные параметры FRAP отличаются для каждой генетически закодированный флуоресцентный белок и ячейки строки.

Важные факторы, которые следует учитывать при проведении эксперимента FRAP a обеспечение подходящих отбеливатель глубины, (b) использование краткого отбеливания шаг, (c) позволяет достаточно времени postbleach наблюдать полное восстановление функции, эффективность (d) Фотообесцвечивание, (e). цитотоксичность неоднократные FRAP, и (f) включение элемента управления для флуоресценции потери из-за повторяющихся изображений. Мы рекомендуем что отбеливатель глубины, которая может быть рассчитана по формуле, в разделе 3.3.1, ≥9013. Когда это отбеливатель глубина < 90, степень postbleach флуоресценции восстановления будет нельзя недооценивать и значения яf, Mfи t1/2 будет неверным. Хотя продолжительность и интенсивность лазерных импульсов, вызывая отбеливатель может варьироваться между FRAP эксперименты, важно, что Фотообесцвечивание шаг быть краткими и значительно быстрее, чем функцию восстановления флуоресценции. Если это не так, то значительное количество флуоресцирования восстановления может произойти во время отбеливания шаг. С временем длинные отбеливатель, флуоресценции восстановления во время отбеливания шага не будет оцениваться, и это приведет к неправильным измерениям яf, Mf, иt1/2. Кроме того, чтобы получить правильные значения для яf, Mf, ит1/2, приобретение ROI должны соблюдаться postbleach до тех пор, пока уровень флюоресценции в отбеливатель ROI достиг плато. Например, в наших экспериментах FRAP, там был никакой разницы между If, Mfи t1/2 значения когда мы наблюдали рекламы ЯФП p62 флуоресценции в отбеливатель ROI 32.2 мин postbleach по сравнению с когда мы наблюдали рекламы ЯФП p62 в отбеливатель ROI для 15.1 мин postbleach; Таким образом мы пришли к выводу, что функции восстановления достигли плато 15.1 мин postbleach12. Что касается эффективности Фотообесцвечивание Фотообесцвечивание увеличивается с площади оптический зум фактор14. Таким образом использование высоким оптическим зум-объективы благоприятна для быстрого Фотообесцвечивание, но может привести к нежелательным Фотообесцвечивание во время приобретения; последний можно объяснить для визуализации элемент управления ROI. Неоднократно Фотообесцвечивание является следует избегать, поскольку это может привести к генерации цитотоксических реактивнооксигенных видов (ров). Однако степень ROS поколения из-за воздействия высокой интенсивности лазерного ниже для генетически закодированный флуоресцентных белков, чем для химических флуорофоров (например, флуоресцентные антитела)15, и генерируется рос более склонны реагировать в пределах генетически закодированный флуоресцентного белка, чем с другими молекулами в ячейки4. Помимо увеличение вероятности генерирования цитотоксических ROS неоднократно Фотообесцвечивание — следует избегать, поскольку это трудно контролировать. Наконец хотя низкий лазерной передачи используется для получения всех изображений не отбеливатель, некоторые Фотообесцвечивание неизбежно произойдет, который должен контролироваться. Возможные элементы для этого включают в себя мониторинг флуоресценции в элементе управления ROI в рамках приобретения ROI, получение изображений управления в соседней ячейке небеленой и выполнение контроля эксперименты с одинаковыми параметрами для тех, которые используются в Фотообесцвечивание эксперименты, но без Фотообесцвечивание событие.

Раскрытие информации

Авторы имеют никакого конфликта интересов раскрыть.

Благодарности

Мы благодарим д-р Сет Робия Университет Лойолы за его ценные комментарии на этой рукописи. Эта работа была поддержана NIH Грант 1R01NS073967-01A1 для Joanna C. Bakowska.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Dulbecco's Modified Eagle MediumHycloneSH30022.01High Glucose (4.5 g/L)
Fetal bovine serumGemini Bio-Products100-106
Glass bottom dishesMatTekP35G-1.5-14-C35 mm
ImageJ softwareNational Institutes of HealthN.A.
Lipopolysaccharide (LPS)SigmaL4391
NocodazoleSigmaM1404
Penicillin-streptomycin solutionCorning30-002-Cl100×
Plan-Apochromat 63×/1.40 Oil objectiveCarl Zeiss MicroImaging, Inc4407629904000000
Polyethylenimine (PEI)Polysciences23966-1linear (MW 25,000)
RAW 264.7 murine macrophagesATCCTIB-71
Zeiss confocal microscopeCarl Zeiss MicroImaging, IncLSM 510

Ссылки

  1. Axelrod, D., Koppel, D. E., Schlessinger, J., Elson, E., Webb, W. W. Mobility measurement by analysis of fluorescence photobleaching recovery kinetics. Biophysical Journal. 16 (9), 1055-1069 (1976).
  2. Peters, R., Peters, J., Tews, K. H., Bahr, W. A microfluorimetric study of translational diffusion in erythrocyte membranes. Biochimica et Biophysica Acta. 367 (3), 282-294 (1974).
  3. Patterson, G., Day, R. N., Piston, D. Fluorescent protein spectra. Journal of Cell Science. 114, 837-838 (2001).
  4. Rabut, G., Ellenberg, J. Photobleaching techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells: FRAP, iFRAP, and FLIP. Live Cell Imaging: A Laboratory Manual (1st ed). , 101-126 (2004).
  5. Fritzsche, M., Charras, G. Dissecting protein reaction dynamics in living cells by fluorescence recovery after photobleaching. Nature Protocols. 10 (5), 660-680 (2015).
  6. Goodwin, J. S., Kentworthy, A. K. Photobleaching approaches to investigate diffusional mobility and trafficking of Ras in living cells. Methods. 37 (2), 154-164 (2005).
  7. Hildick, K. L., Gonzàlez-Gonzàlez, I. M., Jaskolski, F., Henley, J. M. Lateral diffusion and exocytosis of membrane proteins in cultured neurons assessed using fluorescence recovery and fluorescence-loss photobleaching. Journal of Visualized Experiments. (60), e3747 (2012).
  8. Nissim-Rafinia, M., Meshorer, E. Photobleaching assays (FRAP & FLIP) to measure chromatin protein dynamics in living embryonic stem cells. Journal of Visualized Experiments. (52), e2696 (2011).
  9. Zheng, C., Petralia, R. S., Wang, Y., Kachar, B. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) of fluorescence tagged proteins in dendritic spines of cultured hippocampal neurons. Journal of Visualized Experiments. (50), e2568 (2011).
  10. Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).
  11. Ishikawa-Ankerhold, H. C., Ankerhold, R., Drummen, G. P. Advanced fluorescence microscopy techniques--FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM. Molecules. 17 (4), 4047-4132 (2012).
  12. Cabe, M., Rademacher, D. J., Karlsson, A. B., Cherukuri, S., Bakowska, J. C. PB1 and UBA domains of p62 are essential for aggresome-like induced structure formation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 503 (4), 2306-2311 (2018).
  13. Brown, E. B., Wu, E. S., Zipfel, W., Webb, W. W. Measurement of molecular diffusion in solution by multiphoton fluorescence photobleaching recovery. Biophysical Journal. 77 (5), 2837-2849 (1999).
  14. Centonze, V., Pawley, J. Tutorial on practical confocal microscopy and the use of the confocal test specimen. Handbook of biological confocal microscopy. , 549-570 (1995).
  15. Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues. Physiological Reviews. 90 (3), 1103-1163 (2010).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

145FRAPp62sequestosome 1aggresome

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены