Контроль клеточной адгезии с помощью методов гидрогелевого паттернинга для применения в тракционной силовой микроскопии

Резюме

Почти УФ-литография и микроскопия силы тяги объединяются для измерения клеточных сил на микроструктурированных гидрогелях. Целенаправленное светоиндуцированное высвобождение отдельных клеток позволяет проводить большое количество измерений на одном и том же образце.

Аннотация

Тракционная силовая микроскопия (TFM) является основным методом, используемым в механобиологии для измерения клеточных сил. Обычно это используется для клеток, придерживающихся плоских мягких подложек, которые деформируются под тягой клеток (2D-TFM). TFM полагается на использование линейных упругих материалов, таких как полидиметилсилоксан (PDMS) или полиакриламид (PA). Для 2D-TFM на PA трудность достижения высокой пропускной способности обусловлена главным образом большой изменчивостью форм и тяг ячеек, что требует стандартизации. Мы представляем протокол для быстрого и эффективного изготовления микроструктурированных гидрогелей ПА для исследований 2D-TFM. Микрошарики впервые создаются с помощью фотолитографии без маски с использованием почти ультрафиолетового света, где белки внеклеточного матрикса связываются только с микроструктурированными областями, в то время как остальная часть поверхности остается неадгезионной для клеток. Микроструктурирование белков внеклеточного матрикса происходит из-за присутствия активных альдегидных групп, в результате чего адгезивные области различной формы вмещают либо отдельные клетки, либо группы клеток. Для измерений TFM мы используем гидрогели ПА различной упругости путем изменения количества акриламида и бис-акриламида и отслеживания смещения встроенных флуоресцентных шариков для реконструкции полей тяги клеток с помощью регуляризированной цитометрии тяги преобразования Фурье (FTTC).

Для дальнейшего достижения точной регистрации клеточных сил мы описываем использование контролируемой дозы узорчатого света для высвобождения клеточных тяг в определенных областях для отдельных клеток или групп клеток. Мы называем этот метод локальной УФ-подсветкой тяговой силовой микроскопии (LUVI-TFM). При ферментативной обработке все клетки отделяются от образца одновременно, тогда как при LUVI-TFM силы тяги клеток в разных областях образца могут регистрироваться последовательно. Мы демонстрируем применимость этого протокола (i) для изучения сил тяги клеток как функции контролируемой адгезии к подложке и (ii) для достижения большего числа экспериментальных наблюдений из одного и того же образца.

Введение

При взаимодействии со своей внеклеточной средой адгезивные клетки оказывают силы, которые в основном опосредованы фокальными спайками на основе интегрина, соединяющими внеклеточный матрикс (ECM) с актиновым цитоскелетом. Фокальные спайки представляют собой многопротеиновые сборки, которые сосредоточены вокруг связывания интегринов с ECM-белками, такими как фибронектин и коллаген. Кластеризация интегрина и рост очаговых спаек имеют решающее значение не только для установления механически стабильного соединения, но и для рекрутирования других белков фокальной адгезии, в том числе активирующих путь RhoA для регуляции клеточной сократимости1. RhoA-зависимая сократимость актинового цитоскелета позволяет клеткам распространяться и мигрировать на лежащем в основе ECM, а также ощущать его ^{жесткость2}. Распределение сил тяги сильно зависит от площади и формы распространения клеток, которые зависят от свойств матрицы и, следовательно, влияют на организацию цитоскелета, в конечном итоге образуя замкнутую петлю обратной связи между матричной механикой и цитоскелетной ^{организацией3,4}.

Методы поверхностного микроструктурирования позволяют определенно контролировать форму клеток путем создания областей микронного размера, представляющих адгезивные белки ECM; в зависимости от размера этих областей, одиночных клеток или групп клеток, которые прилипают к микрошаблону5. Белки ECM могут быть структурированы на стеклянных подложках с помощью различных подходов, таких как микроконтактная печать, фотоструктурирование или лазерное ^{моделирование6}. Использование ультрафиолетового света (λ = 185 или 375 нм) в сочетании со стратегиями поверхностного противообрастания обеспечивает гибкость для проектирования различных форм и размеров и иммобилизации нескольких типов белков с высокой точностью вблизи краев ^{поверхности7,8}. Области, покрытые химическими веществами, отталкивающими белок, такими как полиэтиленгликоль (ПЭГ), защищены либо хромовой фотомаской, либо системой литографии на основе цифрового зеркального устройства (МДД). Узоры в масках позволяют подвергать воздействию ультрафиолетового света областей, которые затем будут структурированы белками ECM. Структурирование поверхностей гидрогеля белками ECM требует стадии переноса для удаления белков со стеклянной поверхности и сшивания их с узорами. Альтернативно, рисунок на мягких материалах может быть достигнут путем предварительного покрытия фотомаски репеллентным белком, а затем сжигания незамаскированных областей с использованием глубокого ультрафиолетового освещения. Поскольку глубокий УФ-излучение генерирует озон и делает поверхность реакционноспособной для связывания белка, незамаскированные области покрываются белками ECM и, наконец, гель полимеризуется непосредственно поверх незамаскированных ^{областей9,10}.

Узорчатые гидрогели могут быть использованы для выполнения TFM, метода, который измеряет клеточные силы на границе раздела ячейка-материал11. В 2D-TFM используется плоская поверхность толстой полимерной пленки, в которую встроены маркерные шарики для отслеживания деформаций12,13,14,15. Чтобы извлечь векторы смещения, необходимо объединить два изображения, одно из деформированного состояния и одно эталонное изображение без деформаций. Затем два изображения сопоставляются друг с другом с помощью обработки изображений. При высокой плотности маркеров это обычно делается с помощью велоциметрии изображения частиц (PIV), которая является хорошо зарекомендовавшим себя методом реконструкции гидродинамического потока. При низкой плотности маркеров и в 3D-TFM это обычно делается с помощью велоциметрии слежения за частицами (PTV), которая включает в себя специфические особенности набора экспериментальных данных. Примером более дешевой в вычислительном отношении альтернативы является оптический поток, такой как алгоритм Канаде-Лукаса-Томази (KLT)¹⁶. В случае гидрогелевых подложек флуоресцентные шарики обычно встраиваются с высокой плотностью во время полимеризации материала, а изображения регистрируются до и после высвобождения клеток при ферментативной отслойке. Ферментативная отслойка адгезивных клеток, например, путем трипсинизации, приводит к одновременному высвобождению клеточных тракций из всех клеток на гидрогелях, что затрудняет получение подробного анализа из большого числа клеток.

Здесь мы представляем протокол приготовления микроструктурированных гидрогелей для контроля формы и локализации клеток и метод эффективного измерения сил тяги в последовательности с использованием ультрафиолета для отделения отдельных клеток от субстрата. Для измерения силы тяги мы представляем методику получения двухслойных гидрогелей ПА, где флуоресцентные шарики встраиваются только в верхний слой, что увеличивает их плотность и уменьшает их вертикальное распространение. Сочетание УФ-опосредованного высвобождения клеточных сил тяги с микроструктурированием позволяет получить пространственный контроль над отслоением клеток (например, отдельных клеток, не влияя на адгезию других клеток в интересующей области), при условии наличия достаточного расстояния между узорчатыми клетками. Затем клеточная тяга реконструируется с использованием наиболее эффективного и надежного метода для 2D-TFM, а именно цитометрии тяги с преобразованием Фурье (FTTC) с регуляризацией17,18.

протокол

1. Приготовление метакрилированных покровов

ПРИМЕЧАНИЕ: Стеклянные крышки метакрилируются, чтобы ковалентно связывать гидрогели ПА и, следовательно, предотвращать их отслоение во время инкубации с клетками. Стеклянные крышки микроскопа используются для достижения высокого качества изображения.

1. Чтобы приготовить раствор объемом 300 мл, возьмите чистый стеклянный стакан объемом 400 мл и поместите его внутрь вытяжного шкафа.
2. Добавьте в стакан 10 мл двойной дистиллированной воды (_ddH2O). Добавьте 18,75 мл уксусной кислоты (≥99,8% про-анализа, годовых), 18,75 мл 3-(триметоксисилил)пропилметакрилата и 252,5 мл этанола (≥99,8% годовых) с помощью серологической пипетки. Вылейте раствор в кристаллизующуюся посуду.
3. Очистите 24 мм круглые стеклянные крышки с помощью прецизионных салфеток. Поместите крышки в изготовленную на заказ стойку из политетрафторэтилена.
4. Погрузить стойку в раствор и инкубировать в течение 15 мин при комнатной температуре (RT).
5. Возьмите стойку и промойте все крышки этанолом (99,8% годовых). Высушите крышки под потоком воздуха.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Метакрилированные крышки могут храниться до 1 месяца в RT.

2. Микроструктурирование белков внеклеточного матрикса на стеклянных покровах

ПРИМЕЧАНИЕ: Стеклянные покровы сначала покрываются слоем молекул, состоящим из белка и клеточного репеллента. Затем этот слой удаляется с использованием метода фотоструктурирования, чтобы обеспечить последующее осаждение белков внеклеточного матрикса в микроструктурированных областях.

1. Возьмите круглый стеклянный покров диаметром 15 мм и поместите его на чашку Петри. Используйте алмазную ручку, чтобы отметить верхнюю сторону крышки. Затем приступают к очистке с помощью кислородно-плазменной обработки при 0,4 мбар и 200 Вт в течение 2 мин.
2. Пипетка 100 мкл 0,01% раствора поли-L-лизина на поверхности каждого покровного листа. Инкубировать в течение 30 мин на RT. Промыть крышки 10 мМ 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновой кислотой (HEPES) рН 8,5. Удалите лишнюю жидкость, но держите поверхность влажной.
3. Пипетка 100 мкл 50 мг/мл поли(этиленгликоля) метилового эфира сукцинимидиловой валериановой кислоты (mPEG-SVA) в 10 мМ HEPES pH 8,5 на поверхности каждого покровного листа. Инкубировать в течение 1 ч на RT. Промойте крышки с 10 мМ HEPES pH 8,5 и высушите под потоком воздуха.
4. Добавьте 2 мкл УФ-чувствительного фотоинициатора (например, PLPP-геля) с последующим 40 мкл этанола (≥99,8% годовых) на поверхность. Чтобы получить однородное распределение геля и этанола по поверхности, осторожно наклоните чашку Петри вперед и назад. Подождите 5 мин, пока раствор полимеризуется.
5. Поместите одну крышку внутрь 35-миллиметровой чашки Петри с отверстием 20 мм внизу. Это позволяет лазерному лучу, идущему снизу, непосредственно достигать поверхности стекла.
6. Включите микроскоп и модуль светового рисунка (работа с этим устройством разрешена только после введения безопасности от сотрудников по безопасности лазера). Откалибруйте УФ-А лазер на 20-кратном воздушном объективе. Поместите образец с фотоинициатором на сцену. Отрегулируйте фокусировку на поверхности стекла и включите элемент управления фокусировкой. Загрузите и заблокируйте предварительно нарисованный узор.
   1. Подготовьте шаблон с помощью графического программного обеспечения, такого как Inkscape. Убедитесь, что размер файла шаблона не превышает размеры DMD (1824 x 1140 пикселей, что соответствует 552 x 325 мкм на объективе 20 x (0,28 мкм/px)).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать размер DMD (1824 x 1140 пикселей) в качестве размера файла шаблона, так как это гарантирует отсутствие ошибок во время создания шаблона. Например, не создавайте файл шаблона размером 1830 x 1130 пикселей.
   2. С целью переноса рисунка на полиакриламид, убедитесь, что рисунок выполнен только до 60%-70 % радиуса от центра стекла до края.
   3. Для формирования одной клетки используют диаметр 50-100 мкм с расстоянием 100 мкм между узорами и диаметром 150-300 мкм для группы клеток. Соответствующий размер паттерна сильно зависит от типичного размера клетки, и он должен быть достаточно большим, чтобы клетки могли прилипать.
7. Начните формирование с УФ-дозы 30 мДж/^мм2. Длительность паттернов зависит от количества паттернов. Создание одного узора занимает примерно 1 с.
8. После завершения этапа моделирования промойте поверхность фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS) три раза. Инкубируют образец со 100 мкл 25 мкг/мл фибронектина, растворенного в 1x PBS и 25 мкг/мл фибриногена Alexa488, конъюгированного в PBS в течение 1 ч при RT. Для других белков ECM найдите оптимальные концентрации, полностью покрывающие узорчатые области.
9. Промойте поверхность 1x PBS три раза. Убедитесь, что узорчатое стекло немедленно используется для переноса стекла в PA. Храните узорчатое стекло в PBS на RT во время приготовления гидрогеля.

3. Изготовление узорчатых полиакриламидных гидрогелей

ПРИМЕЧАНИЕ: Получают полиакриламидные гидрогели, включающие окисленный N-гидроксиэтилакриламид (HEA) для представления реакционноспособных альдегидных групп для ковалентного связывания матричных белков на поверхности. Кроме того, двухслойный подход к встраиванию флуоресцентных шариков только в верхний слой гидрогеля используется для улучшения регистрации смещения шариков во время экспериментов по микроскопии силы тяги.

1. Положите метакрилированные стеклянные крышки в чашку Петри.
2. Чтобы приготовить свежий окисленный раствор HEA, добавьте 9,55 мл двойной дистиллированной воды в 15-литровую центрифужную трубку. Затем добавляют 0,5 мл HEA и 42 мг натрия (мета)периодата, чтобы получить 10 мл раствора. Непрерывно перемешивайте раствор в темноте в течение 4 ч.
3. Смешайте акриламид, бис-акриламид и двойную дистиллированную воду согласно таблице 1, чтобы получить 10 мл запасного раствора гидрогеля (делают это под вытяжным кожухом, мономеры нейротоксичны). Дега и закрыть крышку герметичным уплотнением.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Стоковый раствор можно хранить в аликвотах до 1 года при температуре 4 °C. Всегда характеризуйте модуль Юнга гидрогеля перед использованием.
4. Приготовьте двухслойный гидрогель ПА (делайте это под вытяжным кожухом, мономеры нейротоксичны).
   1. Начните с нижнего слоя, осторожно перемешав 99,3 мкл исходного раствора, 0,5 мкл 1% персульфата аммония (APS) и 0,2 мкл тетраметилэтилендиамина (TEMED) в пробирке объемом 1,5 мл. Возьмите 10 мкл из раствора и пипеткой по каплям по центру метакрилированного покровного листа.
   2. Осторожно поместите на каплю круглую крышку длиной 15 мм и подождите 45 минут для полимеризации. Аккуратно отсоедините верхнюю крышку скальпелем.
   3. Для верхнего слоя аккуратно смешайте 93,3 мкЛоф с 1 мкл свежего окисленного раствора HEA, 5 мкл флуоресцентных шариков (что соответствует трем шарикам на квадратный микрон для бусин размером 200 нм), 0,5 мкл 1% APS и 0,2 мкл TEMED в пробирке размером 1,5 мл. Возьмите 5 мкл из раствора и пипеткой по каплям по центру уже полимеризованного нижнего слоя.
   4. Аккуратно поместите микроструктурированную крышку на каплю. Подождите 45 мин на RT, пока капля не полимеризуется. Убедитесь, что узорчатая сторона касается капли. Аккуратно отсоедините крышку скальпелем.
5. Приклейте 24-миллиметровые крышки к нижней части специально просверленных 6-скважинных пластин с использованием двухкомпонентного силиконового клея. Через 5 мин добавьте PBS в скважины.
6. Охарактеризуйте модуль Юнга образцов полиакриламидного гидрогеля с помощью атомно-силовой микроскопии (АСМ).
   1. Установите консольный шарообразный наконечник на держатель AFM.
   2. Откалибруйте каждую консоль, получив кривую силы-расстояния (заданное значение 3-4 В) на твердой подложке (например, стекле или слюде), экстраполируйте чувствительность консольного аппарата, втягивайтесь с поверхности и выполняйте тепловую настройку, чтобы получить постоянную пружину.
   3. Поместите калиброванные кантилеверы над образцом гидрогеля и приобретите силовые кривые в буфере PBS, используя следующие параметры: заданное значение силы 20-30 нН, приближение 5 или 10 мкм/с и скорость втягивания, размер рампы 5 мкм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Инвертированный оптический микроскоп, оснащенный воздушным объективом 40x и фильтром зеленого флуоресцентного белка (GFP), использовался для визуализации и нацеливания на ECM-микроструктурированные участки в образцах гидрогеля PA.
   4. Построение полученных кривых силы и расстояния с помощью программного обеспечения для анализа AFM.
   5. Найдите точку контакта и преобразуйте кривые силы и расстояния в кривые силы и отступа.
   6. Поместите отступную часть кривой с моделью Герца (или подходящую механическую модель в зависимости от геометрии наконечника), используя коэффициент Пуассона между 0,2 и 0,5.

4. Локальное высвобождение сил тяги клеток при лазерном освещении УФ-А (LUVI-TFM)

ПРИМЕЧАНИЕ: УФ-А лазер применяется для высвобождения сил тяги в клетках, локализованных в определенных областях гидрогелей. УФ-А лазер (т.е. λ = 375 нм твердотельный лазер, <15 мВт) является лазером класса 3В. Неэкранированный лазерный луч опасен для глаз и часто для кожи. Отраженный и рассеянный свет и излучение могут быть опасными. Кроме того, ультрафиолетовое излучение может вызвать рак кожи. Работа с приборами разрешена только после внедрения техники безопасности со стороны сотрудников по лазерной безопасности.

1. Аспирировать PBS из скважин.
2. Семена 3 х ¹⁰⁶ клеток на 6-луночную пластину в питательной среде. Для фибробластов используйте модифицированную орлиную среду (DMEM) Dulbecco с высоким содержанием глюкозы, содержащую L-глютамин и дополненную 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) и 1% пенициллином / стрептомицином. Инкубируйте клетки в течение ночи при 37 °C/5% _CO2. Промывайте образцы, чтобы удалить плавающие клетки перед началом микроскопии.
3. Включите инкубационную камеру микроскопа и подачу газа для получения температуры 37 °C и 5% _CO2 атмосферы.
4. Включите микроскоп и модуль лазерного моделирования. При необходимости повторно откалибруйте УФ-А лазер на 20-кратном воздушном объективе с помощью программного обеспечения Leonardo. Поместите на сцену изготовленную на заказ 6-луночную пластину с образцами. Отрегулируйте фокусировку на поверхности ПА.
5. Настройте рисунок освещения и отметьте интересующие ячейки. Перефокусировка на поверхности гидрогеля. Получите изображение клеток в канале brightfield. Переключитесь на канал Cy5 (дальне-красный фильтр, возбуждение 650 нм, излучение 670 нм) и сделайте снимок шариков в деформированном состоянии.
6. Переключитесь на лазерный канал. Включите лазер на 3 мин. В нашей конкретной установке это соответствовало световой дозе 6000 мДж/^мм2.
7. Переключитесь на канал Cy5 и получите изображение бусин в недеформированном состоянии.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для эксперимента с использованием эмбриональных фибробластов мыши подождите 15 минут после экспозиции, чтобы записать эталонное/недеформированное изображение (см. раздел Репрезентативные результаты ). Это может отличаться для других типов клеток. Повторите шаги 4.5–4.7 еще раз для другой интересующей ячейки.
8. Чтобы измерить повышенный окислительный стресс после ультрафиолетового излучения, используйте коммерчески доступный реагент (CellRox). CellRox является нефлуоресцентным в восстановленном состоянии и при окислении активными формами кислорода флуоресцирует с максимумом излучения ~ 665 нм.
9. Согласно предоставленному протоколу, добавляют 5 мкМ реагента в среду визуализации и инкубируют в течение 30 мин при 37 °C/5% _CO2. Затем промыть ячейки 3x теплым 1x PBS и заменить носитель изображений. Запишите сигнал Cy5 с помощью флуоресцентной визуализации до и после ультрафиолетового излучения, используя аналогичное воздействие света.

5. Обработка изображений, велоциметрия изображения частиц и расчет тяговых сил

ПРИМЕЧАНИЕ: Силы тяги клеток регистрируются путем анализа смещения флуоресцентных шариков и рассчитываются с использованием инструментов анализа изображений, основанных на велоциметрии изображения частиц.

1. Открытые флуоресцентные изображения бусин до (т.е. деформированные) и после лазерного (т.е. недеформированного) с использованием Фиджи. Объединение двух изображений в один стек (Image | Стеки | Изображения в стек).
2. Корректируйте боковой дрейф между двумя изображениями с помощью плагина StackReg (P. Thévenaz, Швейцарский федеральный технологический институт Лозанны). Изменение изображений на 8 бит (image | Тип | 8 бит) и повторное масштабирование до 1024 x 1024 пикселей (image | Масштаб). Сохранение в виде последовательности изображений (формат TIFF) с эталонным изображением всегда в начале.
3. Получение векторного поля смещения с помощью метода ^{кросс-корреляции19} из PIV-поля, реализованного в проекте OpenPIV.
   1. Убедитесь, что расслабленное (недеформированное) изображение и деформированное изображение покрыты окнами поиска размером _wR и _wD в пикселях. Для каждого окна поиска определите функцию перекрестной корреляции, используя следующую формулу:
      
      Здесь R(i,j) и D(i,j) описывают поля интенсивности двух изображений, усеченных до выбранного окна поиска и впоследствии зеркально заполненных. и описать их среднее значение. Размеры окон выбираются как _wR = 32 и _wD = 32, и между соседними окнами поиска используется перекрытие 70%.
   2. Для каждого окна поиска определите вектор смещения, оптимизирующий функцию перекрестной корреляции и назначьте центру положение окна поиска. Субпиксельная точность достигается с помощью гауссовского соответствия вокруг области максимумов, как ^{описано20}.
   3. Поиск и удаление неоднозначных векторов смещения. Векторы смещения, соответствующие окнам поиска, где отношение между двумя высшими локальными максимумами кросс-корреляционной функции ниже порога 1,5 рассматривается как неоднозначное21.
   4. Отбрасываемые векторы смещения, которые не проходят нормализованный медианный тест на остаточное пороговое значение ^1,522.
   5. (Необязательно) Исправьте оставшийся боковой дрейф, вычитая фиксированный вектор из всех смещений. Это делается потому, что смещение в выбранной области, удаленной от ячейки, исчезает.
   6. Интерполируйте полученное векторное поле смещения в регулярную сетку с интервалом 4 px от входных изображений с помощью кубической полиномиальной интерполяции. Отсутствующие точки данных заполняются с помощью плавной двумерной сплайн-экстраполяции. Вектор смещения в пикселях связан с локальной деформацией по соотношению пикселей изображения (0,33 мкм/px для 20-кратного воздушного объектива).
   7. (Необязательно) Зеркальная панель изображения для уменьшения звона артефактов при последующем анализе.
   8. Умножьте поле деформации на функцию окна Tukey, чтобы устранить эффект края за счет коррекции дрейфа, с параметром 0,2-0,3. В этом эксперименте представляет интерес микроструктурированная область, которая находится в центре FOV.
4. Реконструируйте тягу с помощью регуляризированной цитометрии тяги с преобразованием Фурье (FTTC)¹⁸. В качестве регуляризации мы используем простейший разумный выбор, а именно регуляризацию Тихонова (L2) ^0-го порядка23,24,25. Оптимальный параметр регуляризации λ выбирается таким образом, что он минимизирует функцию обобщенной перекрестной проверки (GCV), ^{определяемую26}:
   
   Здесь _τλ представляет собой сложенный вектор, содержащий компоненты x и y реконструированного поля тяги для заданного значения λ для всех режимов выборки Фурье, а G — линейный оператор, отображающий тяговые поля с соответствующим им полем смещения, как определено для FTTC. Сумма работает над векторными компонентами. _ui — компоненты x и y поля смещения для всех режимов выборки Фурье. GCV широко используется в области неправильно поставленных обратных задач и является хорошей альтернативой критерию L-кривой, часто используемому в TFM. Фильтр Ланцкоса используется для уменьшения артефактов, вводимых из-за ограниченного частотного пространства и повышения разрешения поля смещения. Расчет тяги зависит от модуля Юнга ПА (например, 11,3 кПа) и коэффициента Пуассона (например, для ПА в диапазоне от 0,2 до 0,5 в зависимости от концентрации сшивающегося).

Результаты

Гидрогели ПА полимеризовали на метакрилированных стеклянных покровах, которые представляют собой реакционноспособные группы для ковалентной связи ПА. Таким образом, при помещении гидрогелей в водный раствор предотвращали их отделение от субстрата (рис. 1А-Д). Для получения высокой плотности фидуциальных маркеров вблизи поверхности гидрогеля мы разработали препарат двухслойного гидрогеля ПА. Нижний слой, без каких-либо флуоресцентных шариков, полимеризовали на метакрилированном покровном листе. Впоследствии другой слой, содержащий бусины, полимеризовали поверх нижнего слоя (рис. 1Е-Н), заменив необходимость седиментации, которая часто используется для достижения распределения шариков в одной фокальной плоскости и увеличения плотности шарика. Для достижения контроля над формой клеток во время измерений TFM мы произвели микроструктуры PA путем прямого переноса микроструктур с фибронектиновым рисунком из стеклянного покровного листа в предварительно полимеризованный PA (рисунок 1F-F'). Добавление 1% нетрадиционного сшивателя (окисленного HEA) в верхний слой гидрогеля раствора обеспечивает альдегидные группы, которые ковалентно связываются с аминными группами фибронектина.

Мы подготовили гидрогели ПА толщиной около 60 мкм и замкнутые флуоресцентные шарики в верхнем слое, близком к поверхности гидрогеля. Этот тип гидрогеля является подходящей подложкой для визуализации клеточных тяг с помощью инвертированных микроскопов и достаточно толстым (минимальная толщина для выполнения TFM, как сообщается, составляет 20-30 мкм)¹⁸ , чтобы предотвратить любое воздействие стеклянной подложки. Локализация флуоресцентных шариков была получена с помощью конфокальной микроскопии (рисунок 1I). Чтобы визуализировать перенос белка на гидрогеле, мы использовали флуоресцентно меченые белки ECM и визуализировали их с помощью эпифлуоресцентной микроскопии (рисунок 1J). Мы подготовили микроструктурированные круги фибронектина диаметром 100 мкм (левая сторона) и 50 мкм (правая сторона), чтобы обеспечить адгезию групп клеток или отдельных клеток, как показано на наложении ярких полевых изображений адгезивных клеток, и флуоресцентно меченых фидуциальных шариков и микропаттернов фибронектина. На другом образце адгезионный ответ отдельных клеток на микроструктурированный фибронектин был подтвержден непрямой иммунофлуоресцентной микроскопией для изображения локализации белков фокальной адгезии, таких как паксиллин (рисунок 1K).

Как белковое покрытие ECM, так и жесткость гидрогеля являются важнейшими параметрами для клеточной адгезии26. Чтобы охарактеризовать механические свойства наших гидрогелей ПА, мы провели эксперименты с наноиндентированием с помощью ^AFM27 в сочетании с эпифлуоресцентным микроскопом. Гидрогелевые субстраты трех различных жесткостей были подготовлены и испытаны с помощью нашей установки (рисунок 2 и таблица 1). Шарообразные кантилеверы AFM циклически приближались и втягивались из неструктурированных гидрогелей PA и фибриногена, конъюгированных с Alexa488-микроструктурированными областями, при записи кривых силы-расстояния. Впоследствии, оценка контактных точек и применение модели Герца позволили оценить модуль Юнга (E) каждого образца. Микроструктурирование ECM не изменило модуль Юнга, который оставался сопоставимым с каждым из неструктурированных гидрогелей PA.

Для измерения тяговых сил, оказываемых адгезивными ячейками на подложку, мы разработали экспериментальную установку для TFM на эталонной основе, выполненную на широкоугольном эпифлуоресцентном микроскопе, оснащенном ближним УФ-лазерным модулем (UV-A 6000 мДж /^мм2) для высвобождения клеточных тяг (рисунок 3A). Поскольку освещение лазерного луча можно пространственно-временно контролировать, можно не только выборочно подвергать воздействию одну клетку или кластер клеток высокой дозой лазера, но также, что более важно, разрушительный промежуточный этап удаления клеток из всего образца с использованием пищеварительного фермента, такого как трипсин, больше не нужен. Освещение клеток такой высокой дозой лазера индуцировало повышенный окислительный стресс, приводящий к гибели клеток (рисунок 3B). Гибель клеток приводила к высвобождению тяги из подложки, о чем свидетельствует смещение шарика (проиллюстрировано на рисунке 3А). Мы объединили ультрафиолетовое освещение с модулем светового рисунка для селективного освещения микронных областей гидрогелей ПА (рисунок 3B-C). Таким образом, можно освободить тяги микроструктурированных кластеров клеток (рисунок 3C, F) или одиночных клеток (рисунок 3B). Важно отметить, что в наших масштабах механические свойства гидрогелей с узором ECM не были существенно затронуты воздействием ультрафиолета (рисунок 2C). Увеличение окислительного стресса показано на рисунке 3D,E. Тяговые силы были реконструированы с использованием регуляризированного FTTC с параметром регуляризации, выбранным обобщенной перекрестной валидацией (рисунок 3B, F). Высвобождение сил для одиночных клеток происходило в течение 15 мин, и результат ПРИМЕНЕНИЯ LUVI-TFM сопоставим с TFM на основе трипсина (рисунок 3G-H).

Рисунок 1: Схема получения узорчатого фибронектина-субстрата для ТФМ. (А) Раствор для нижнего слоя пипетируют на метакрилированной поверхности. (B) На каплю осторожно помещается меньшая чистая крышка. (C) Время гелеобразования составляет 45 мин. (D) Верхний крышка отслояется. Нижний слой готов. (E) Раствор для верхнего слоя пипетируется на гидрогеле. (F) Узорчатый покров аккуратно помещается на каплю. (Ф') Микроструктурирование адгезивных белков на стекле производится безмассочной вблизи УФ-литографии, а затем переносится из стекла в гидрогель ПА. Свободные аминные группы адгезивных белков, например, фибронектин, связываются ковалентно с альдегидными группами на поверхности ПА. (G) Время гелеобразования составляет 45 мин. (H) Верхний закрывающийся отсоединяется. Узорчатый гидрогель ПА готов. (I) 3D-изображение конфокальной микрофотографии xyz, показывающей высокую плотность фидуциальных бусин вблизи поверхности. (J) Микрофотография флуоресцентно меченого фибронектина (пурпурного) на поверхности ПА со встроенными флуоресцентными шариками (зеленый), наложенными ярким полевым изображением клеток. (K) Непрямая иммунофлуоресцентная микроскопическая визуализация одной клетки, придерживающейся микрошарики фибронектина в форме круга (100 мкм). Ядро (синий), паксиллин (красный). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Характеристика механических свойств образца с помощью AFM. (A) Экспериментальная установка наноиндентации AFM. Шарообразный консоль используется для зондирования микрошариков ECM до или после УФ-обработки, а также неструктурированных областей двухслойных ПА (5% акриламида, 0,3% бис-акриламида). (B) Репрезентативная сила в сравнении с кривой отступа для микрошаблона ECM (черный). Подгонка Герца (красный) используется для расчета модуля Юнга (E) образца. (C) Механические измерения для неструктурированных двухслойных областей ПА (без ECM), микрошарики ECM и микроструктуры ECM после воздействия УФ-А. Бары показывают среднее значение ± S.E.M. (тест Брауна-Форсайта и Уэлча ANOVA). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3. Локальное УФ-А освещение TFM (LUVI-TFM) позволяет измерять силу тяги локально внутри большого поля зрения. (А) Схема локального УФ-А освещения ТФМ. Клетки обрабатывают высокой дозой УФ-А лазера для получения недеформированного (эталонного) изображения. (B) Яркое изображение одной ячейки перед УФ-А лазерным освещением. Середина: яркое изображение одной ячейки после лазерного освещения УФ-А. Справа: тяговая сила одного MEF, прилипшего к гидрогелю ПА с фибронектиновым покрытием (E = 5,74 кПа), освещенному пучком ультрафиолетового излучения диаметром 50 мкм (красная пунктирная линия). (C) Слева: Регистрация сил вытяжения кластера эмбриональных фибробластов мыши (MEF), прилипших к микроструктурированному фибронектину (круг, диаметр 100 мкм). Кластер был освещен ультрафиолетовым световым пучком диаметром 200 мкм (красная пунктирная линия). Справа: Регистрация сил тяги кластера эмбриональных фибробластов мыши (MEF), придерживающихся микроструктурированного фибронектина (круг, диаметр 300 мкм). Кластер был освещен ультрафиолетовым световым пучком диаметром 300 мкм (красная пунктирная линия). Шкала бара = 200 мкм. (D,E) Увеличение окислительного стресса в клетках, обозначенное повышенной интенсивностью сигнала Cy5 после высокой дозы лазера УФ-А, обнаруженного флуоресцентной микроскопией. Окислительный стресс приводит к гибели клеток. Шкала = 200 мкм. (F) Слева: тепловая карта напряжения от кластера эмбриональных фибробластов мыши (MEF), придерживающихся микроструктурированного фибронектина (круг, диаметр 100 мкм). Справа: тепловая карта напряжения от кластера эмбриональных фибробластов мыши (MEF), придерживающихся микроструктурированного фибронектина (круг, диаметр 300 мкм). (G) MeF-клетки, придерживающиеся микроструктур 100 мкм фибронектина, медленно высвобождают свои тракции после воздействия УФ-А. Полное высвобождение достигается через 15 мин (затем эталонное изображение было сделано через 15 мин после экспозиции). (H) Сравнение с обычным трипсином на основе TFM для клеток MEF, придерживающихся паттернов-фибронектина диаметром 300 мкм. Результат УФ-А освещения (6000 мДж/^мм2) с последующим 15-минутным ожиданием существенно отличается от обычной обработки трипсином (т.е. 0,05% в течение 20 мин). На столбиках показано среднее значение S.E.M. ( t-тест двуххвостого студента, ****P < 0,0001, * P < 0,05, ns P ≤0,5). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Акриламид (%)	Бис-акриламид (%)	Акриламид из 40 % стокового раствора (мл)	Бис-акриламид из 2 % стокового раствора (мл)	Вода (мл)	Модуль Юнга (кПа)
4	0.1	1	0.5	8.5	5,74 ± 0,53
5	0.15	1.25	0.75	8	9,69 ± 0,68
5	0.3	1.25	1.5	7.25	11,33 ± 1,06

Таблица 1: Смеси растворов гидрогеля и результирующая эластичность

Все данные депонируются в репозитории данных открытого доступа Общества Макса Планка (Эдмонд) и могут быть доступны по следующему адресу: https://edmond.mpdl.mpg.de/imeji/collection/JTu8PlWqpbymN9Qf

Обсуждение

В этом протоколе мы описываем получение микроструктурированных гидрогелей ПА, содержащих флуоресцентные шарики, которые используются в качестве фидуциальных маркеров для исследований TFM. Наш подход основан на трех этапах: 1) получение двухслойных гидрогелей ПА; 2) микроструктурирование белков ECM и перенос их на поверхность гидрогеля; 3) использование узорчатого ближнего УФ-света для TFM. Экспериментальная установка для анализа тяги клеток к подложке требует использования линейных упругих материалов с известными значениями жесткости для расчета сил, связанных со смещением флуоресцентных ^{шариков26}. Гидрогели PA просты в приготовлении, жесткость может быть легко настроена, и они обычно используются для измерения жесткости и ^TFM18,28. Однако для получения воспроизводимого времени полимеризации и однородной полимеризации всего гидрогеля следует обратить внимание на условия хранения и время хранения реагентов, например, APS следует хранить в осушителе, чтобы избежать потери своей активности; TEMED должен быть защищен от прямого света. Использование окисленного HEA позволяет ковалентное связывание матричных белков на поверхности гидрогеля, что может быть выгодно для достижения образования полного и стабильного белкового слоя. Окисленный раствор HEA следует готовить свежим каждый раз, когда изготавливаются гидрогели ПА. Двухслойный гидрогель ПА предлагает три основных преимущества: 1) он обеспечивает альтернативный способ воспроизводимого получения однородного распределения фидуциальных шариков вблизи поверхности гидрогеля без необходимости делать гель чрезвычайно тонким (т.е. <20 мкм). Контроль толщины гидрогеля имеет решающее значение для получения точных измерений с помощью TFM. Когда эластичная подложка слишком тонкая, сильные адгезивные клетки, такие как фибробласты, могут ощущать и механически реагировать на лежащую в основе жесткую стеклянную ^{подложку29,30}. Толстые гидрогели усложняют получение изображения для силовой реконструкции. Более того, многие микроскопы не будут иметь достаточного пространства для их размещения, учитывая дополнительную толщину стеклянной подложки, используемой для прикрепления гидрогеля, если не используются ультратонкие микроскопические слайды. 2) В двухслойном гидрогеле ПА однородное распределение фидуциальных шариков вблизи поверхности гидрогеля ПА достигается без использования центрифуги, а путем простой инкубации точных количеств растворов гидрогеля и флуоресцентных шариков. Высокая плотность шариков имеет значительное преимущество при выполнении анализа PIV, поскольку она увеличивает разрешение тяговых сил и отношение сигнал/шум без необходимости конфокальной микроскопии. 3) Ограничение шариков тонким слоем, близким к интерфейсу клеточного материала, позволяет визуализировать тяговые силы с помощью эпифлуоресцентных микроскопов, а также конфокальных микроскопов. При приготовлении гидрогеля пользователь должен убедиться, что он прочно прилипает к нижнему стеклу, прежде чем приступать к последующим этапам протокола. Мы рекомендуем соблюдать время инкубации, указанное для полимеризации слоев гидрогеля, так как может быть трудно удалить стекло поверх поверхности, не повредив поверхность гидрогеля.

Наиболее известными методами измерения упругих свойств являются AFM, наноиндентирование, испытания на растяжение и реометрия. Однако наноиндентирование вызывает очень высокие нагрузки на материалы, которые могут влиять на определение упругих свойств. Испытания на растяжение и реометрия, с другой стороны, являются макроскопическими методами измерения, тогда как клетки взаимодействуют в микроскопическом ^{масштабе31,32}. AFM позволяет проводить измерения на микроуровне с уменьшенными штаммами в физиологических условиях. На надежность измерений ОВМ может отрицательно сказаться, если отсутствуют экспериментальные детали (например, сила отступа и скорость) или регистрируется недостаточно ^{данных27}. Huth et al. описывает алгоритм извлечения модулей Юнга из данных AFM, который подчеркивает сохранение деталей измерения ^{постоянными27}. Этот алгоритм предлагает точное и надежное определение модулей Юнга и использовался для наших экспериментов. Кроме того, мы измерили много кривых на образцах, изготовленных в разные дни, и получили очень похожие результаты (вариация средних значений около 1-2 кПа). Это показывает, что жесткость наших гелей может быть надежно предсказана.

В этом протоколе мы используем модуль фотоструктурирования для создания микроструктурированных областей на стекле, которые затем переносятся на поверхности гидрогеля. Микроструктурирование, показанное в этом протоколе, основано на безмасочной литографии без маски DMD (цифровое микрозеркальное устройство) (λ = 375 нм)⁷. МДД состоит из большого количества микрозеркал на чипе. Один пиксель соответствует одному микрозеркалу. Файл пиксельного изображения шаблона с компьютера проецируется через DMD и фокусируется на поверхности с помощью объектива. Для микроструктурирования белков сфокусированный лазерный свет используется для расщепления репеллентных полимерных кистей с помощью фотоинициатора. После этого открытые области заполняются белками ECM. Этот метод абляции без маски предлагает большую гибкость в разработке новых шаблонов, поскольку он не полагается на использование фотомаски. Разработка и применение шаблона очень просты, так как это занимает всего несколько минут с использованием бесплатного программного обеспечения, такого как Inkscape. Тем не менее, количество образцов и образцов, полученных за короткий промежуток времени, является основным недостатком, поскольку этот метод может быть использован только для моделирования одной подложки каждый раз. Модуль фотоструктурирования использует почти УФ-твердотельный лазерный источник, который излучает несколько милливатт. Неэкранированный лазерный луч опасен для глаз и кожи. Отраженный и рассеянный свет и излучение также могут быть опасными. Управление должно сопровождаться инструкцией по технике безопасности от лазерных офицеров. Наиболее важным шагом в протоколе при использовании модуля фотоструктурирования является обеспечение того, чтобы во время микроструктурирования и абляции лазер правильно фокусировался на поверхности. Постоянная доза освещения (интенсивность, умноженная на время) ультрафиолетового света во время моделирования зависит от того, как лазер сфокусирован на поверхности. Слабая интенсивность на поверхности из-за плохой фокусировки может привести к нарушению переноса ECM на поверхность гидрогеля, что приведет к тому, что клетки не будут прикреплены к гидрогелю.

В экспериментах TFM после первоначальной визуализации адгезивных клеток и фидуциальных маркеров клетки высвобождаются из гидрогеля ПА путем лечения трипсином для записи их расслабленного состояния. Недостатком выполнения этого шага является обработка образца на стадии микроскопии. Без перфузионной камеры открытие крышки тарелки, аспирация среды, промывка и пипетка раствора трипсина представляют собой проблему для начинающих и опытных пользователей. Фактически, эти процедуры являются основным источником дрейфа в осях xyz , что приводит к потере положения и фокуса. Наш протокол локального УФ-освещения делает TFM более доступной техникой для начинающих. Следует отметить, что мы использовали коммерчески доступный модуль фотоструктурирования на основе микроскопии, но в принципе можно было использовать любую систему освещения UV-A, в конечном итоге в сочетании с маской для защиты областей подложек, где силы тяги клеток не должны регистрироваться. Воздействие на клетки значительной дозы низковолнового видимого света (например, фиолетового света, который возбуждает излучение DAPI) приведет к увеличению окислительного стресса, что может привести к фототоксичности и гибели клеток. Поэтому данная методика может применяться даже в эпифлуоресцентном микроскопе без модуля УФ-лазера. Однако, поскольку интенсивность намного слабее, в этом случае будет намного легче выполнить TFM с ферментативным лечением.

С LUVI-TFM можно использовать один и тот же образец для нескольких измерений из-за локальной отслойки отдельных клеток или небольших групп клеток. Однако следует обратить внимание на отбор клеток для отсоединения, чтобы избежать регистрации сил от соседних клеток. Таким образом, для одноклеточных измерений при отсутствии микроструктур следует избегать переполненных областей; для измерений на одиночных микроструктурированных ячейках узоры должны быть спроектированы таким образом, чтобы расстояние между одиночными структурами по меньшей мере в два раза превышало диаметр узорчатой области. Мы также рекомендуем не использовать клетки из соседних паттернов последовательно, а скорее отбирать их из отдаленных областей на подложке. Наше измерение хорошо проводится на эпифлуоресцентном микроскопе, оснащенном функцией управления фокусировкой и линзой 40 x air NA = 0,9, где рабочее расстояние объектива достаточно велико, а быстрое движение от одного колодца к другому очень настраивается. Целевое отделение клеток для применения TFM эффективно для измерения клеточной силы одной клетки или целого кластера малых клеток (например, до 300 мкм в диаметре). Используя нашу установку, мы наблюдали округление и отслоение клеток для УФ-обработки одиночных клеток (рисунок 3A), тогда как отслоение редко происходило для кластеров мелких клеток. Это может привести к недооценке сил тяги клеток. Для больших кластеров клеток рекомендуется ферментативное отделение, так как пользователи должны использовать 20-кратный воздушный объектив для изображения всего кластера, и необходима функция управления фокусировкой. Поскольку глубина фокусировки 20-кратного воздушного объектива намного больше, управляемость не будет такой критической, как при более высоком увеличении объектива. Пользователь должен убедиться, что фокус правильно настроен для абляции клеток, так как доза освещения зависит от лазерного фокуса на поверхности. Хотя мы знаем о возможных ограничениях в использовании LUVI-TFM в клеточных коллективах из-за возможных механических взаимодействий с соседними необработанными клетками, этот аспект может оказаться полезным для исследований механики экструзии целевых клеток, например, из эпителиальных монослоев.

В заключение, благодаря нашему подходу TFM в сочетании со светоиндуцированным высвобождением микроструктурированных клеток, мы обеспечиваем надежный и высокопроизводительный протокол для измерения сил адгезии клеток. Универсальность этого метода может быть дополнительно использована с использованием микроскопии и настройки визуализации, направленной на улучшение разрешения и чувствительности.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate	#440159	Sigma Aldrich
Acetic acid	#33209	Honeywell
Acrylamide 40 %	#1610140	Bio-Rad	CAUTION : toxic, work under a fume hood
AFM cantilever	#CP-CONT-BSG-A-G	NanoAndMore	5 μm spherical tip
AFM system	#NanoWizard3	JPK	Coupled to optical microscope equipped with 40x air objective and GFP filter
Ammonium persulfate	#A3678	Sigma
Bis-acrylamide 2 %	#1610142	Bio-Rad	CAUTION : toxic, work under a fume hood
Camera sCMOS	#C11440-42U30	Hamamatsu
Camera sCMOS	#ANDORZYLA4.2	Oxford Instrument
CellRox	#C10422	Thermo Fisher
Custom incubator chamber		EMBLEM
Dental glue	#1300 100	Picodent
DMEM	#41965	Thermo Fisher
Epifluorescence microscope	#Eclipse Ti2E	Nikon
Epifluorescence microscope	#Axiovert200	Zeiss
Ethanol	#9065.3	Carl Roth
FBS South America	#S181T	Thermo Fisher
Fibrinogen	#F13191	Invitrogen	Alexa488 conjugate
Fibronectin	#F1141	Sigma
Fluorescent beads 200 nm	#F8805	Invitrogen	Carboxylated (365/415)
Fluorescent beads 200 nm	#F8848	Invitrogen	Carboxylated (505/515)
Fluorescent beads 200 nm	#F8810	Invitrogen	Carboxylated (580/605)
Fluorescent beads 200 nm	#F8807	Invitrogen	Carboxylated (660/680)
Glass coverslip 15 mm round	#41001115	Assistent
Glass coverslip 24 mm round	#41001124	Assistent
Microscope Objective	#MRH08230	Nikon	20x air NA 0.45
Mouse Embryonic Fibroblasts	#CRL-2991	ATCC
mPEG-SVA	#MPEG-SVA-5000	Laysan Bio
N-Hydroxyethyl acrylamide	#697931	Aldrich
Plasma cleaner	#100-E	TePla
PLPP gel	#PLPPgel	Alveole
Poly-L-lysine	#P4823	Sigma Aldrich
Poly(L-lysine)-graft-poly(ethylene glycol)	#PLL(20-g[3.5]-PEG(2)	SuSoS
Sodium(meta) periodate	#S1878	Sigma Aldrich
TEMED	#17919	Thermo Scientific
UV Patterning module	#PRIMO	Alveole
UVO cleaner	#342-220	Jelight