Неонатальная модель некротизирующего энтероколита BALB/c

Резюме

Некротизирующий энтероколит (НЭК) является наиболее тяжелым желудочно-кишечным (ЖКТ) заболеванием, которое часто встречается у недоношенных детей, особенно у младенцев с очень низкой массой тела при рождении, с высокой смертностью и неясным патогенезом. Причина НЭК может быть связана с воспалительными нарушениями иммунной регуляторной системы. Модель животных NEC является незаменимым инструментом для иммунных исследований болезни NEC. На животных моделях NEC обычно используются неонатальные мыши C57BL/6J; BALB/c неонатальных мышей используется редко. Связанные с этим исследования показали, что когда мыши инфицированы, дифференцировка клеток Th2 преобладает у мышей BALB / c по сравнению с мышами C57BL / 6J. Исследования показали, что возникновение и развитие НЭК связаны с увеличением Т-хелперов типа 2 (Th2) клеток и, как правило, сопровождаются инфекцией. Поэтому в этом исследовании использовались неонатальные мыши BALB/ c для индуцирования модели NEC с аналогичными клиническими характеристиками и патологическими изменениями кишечника, как те, которые наблюдаются у детей с NEC. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы определить, может ли эта животная модель быть использована для изучения реакций клеток Th2 в NEC.

Аннотация

Некротизирующий энтероколит (НЭК) является наиболее тяжелым желудочно-кишечным (ЖКТ) заболеванием, которое часто встречается у недоношенных детей, особенно у младенцев с очень низкой массой тела при рождении, с высокой смертностью и неясным патогенезом. Причина НЭК может быть связана с воспалительными нарушениями иммунной регуляторной системы. Модель животных NEC является незаменимым инструментом для иммунных исследований болезни NEC. На животных моделях NEC обычно используются неонатальные мыши C57BL/6J; BALB/c неонатальных мышей используется редко. Связанные с этим исследования показали, что когда мыши инфицированы, дифференцировка клеток Th2 преобладает у мышей BALB / c по сравнению с мышами C57BL / 6J. Исследования показали, что возникновение и развитие НЭК связаны с увеличением Т-хелперов типа 2 (Th2) клеток и, как правило, сопровождаются инфекцией. Поэтому в этом исследовании использовались неонатальные мыши BALB/ c для индуцирования модели NEC с аналогичными клиническими характеристиками и патологическими изменениями кишечника, как те, которые наблюдаются у детей с NEC. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы определить, может ли эта животная модель быть использована для изучения реакций клеток Th2 в NEC.

Введение

Некротический энтероколит (НЭК), наиболее тяжелое заболевание желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), встречается у большинства недоношенных детей (>90%), особенно у детей с очень низкой массой тела при рождении (СНОБВ)¹. У младенцев с СБНВ заболеваемость колеблется от 10% до 12%, а смертность детей с диагнозом НЭК составляет от 20% до 30%^2,3. Причина НЭК может быть связана с травмами слизистой оболочки, инвазией патогенных бактерий и питанием кишечника, что может привести к воспалительным реакциям и индукции повреждений кишечника у восприимчивых ^{хозяев3}. Патогенез НЭК неясен. Соответствующие исследования показывают, что иммунный ответ пострадавшего ребенка является ненормальным, а генетическая восприимчивость, микрососудистое напряжение и бактериальные изменения кишечника могут играть важную роль в ^{заболевании3}.

Животная модель NEC является незаменимым инструментом для исследования патогенеза NEC. Виды животных, используемые для моделей NEC, - это свиньи, крысы и мыши. Однако из-за длительного периода беременности, циклов роста и высоких затрат в последние годы свиньи не были первым выбором для моделей NEC и были заменены крысами или ^{мышами4}. Поскольку существуют различия в иммунном фоне различных штаммов ^мышей5, в разных исследованиях необходимо использовать разные штаммы мышей для установления моделей животных NEC. Мыши BALB/c имеют важную особенность; когда они заражаются или справляются с внешним повреждением, поляризация клеток TH2 при заражении у мышей значительно сильнее, чем у других штаммов мышей6,7,8. Т-хелперы играют решающую роль в возникновении и прогрессировании НЭК, особенно в развитии клеток TH23,9,10,11. Поэтому в этом исследовании использовались мыши BALB / c для создания модели NEC, которая может быть полезна для исследований болезни NEC на Т-клетках.

протокол

Это исследование было одобрено Комитетом по медицинской этике Медицинского центра женщин и детей Гуанчжоу (NO 174A01) и Комитетом по этике животных Центра лабораторных животных Гуанчжоу Forevergen Biosciences (IACUC-G160100). Все животные были выведены в одной комнате в определенной среде, свободной от патогенов (SPF), и эксперименты проводились в обычной среде. Мышам, используемым для разведения, было 7-8 недель; мышей для индуцирования NEC (n = 72) отделяли от плотины на 4-й день, а плотины (n = 14) держали в исходной клетке и выхаживали контрольных (Cont.) групп мышей (n = 24).

1. Подготовка реагентов и приспособлений

1. Приготовьте заменитель молока для мышей BALB/c в соответствующем соотношении (сухое молоко недоношенного ребенка: сухое козье молоко = 2:1).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Окончательные питательные композиции молочных ^{смесей12} приведены в таблице 1.
2. Раствор ЛПС (2,5 мг/мл)
   1. Растворите в общей сложности 10 мг порошка ЛПС в 4 мл стерилизованной двойной дистиллированной воды, хорошо перемешайте и храните в холодильнике при -20 °C после аликотирования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор ЛПС хранят в темноте при 2-8 °C для немедленного использования или при -20 °C для длительного хранения.

2. Индуцировать некротизирующий энтероколит у неонатальных мышей BALB/c

1. Кормите неонатальных мышей.
   1. Держите неонатальных мышей в одной клетке с плотиной, выхаженной плотиной в дни 0-4.
   2. В ночь на 4-й день (когда неонатальные мыши весят 2,5-3 г) отделите неонатальных мышей в группе NEC от плотины, чтобы вызвать NEC, держите их в инкубаторе для животных и кормите их смесью. Тем не менее, группе Cont. разрешено оставаться и питаться плотиной.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Неонатальные мыши, которые отделены от плотины, должны быть выращены в инкубаторе из-за их слабой регуляции температуры тела.
2. Подготовьте пластырь, замочив его в 75% спиртовых контейнерах на 1-2 мин и дважды промыв их в чистой, дважды дистиллированной воде.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать перекрестного загрязнения среди мышей, вышеуказанный процесс должен быть выполнен после кормления каждой мыши.
3. Индуцировать модель NEC.
   1. Возьмите неонатальных мышей из плотины на 4-й день и постите их на одну ночь.
   2. Дайте мышам ЛПС (20-30 мкл за раз) и кормите их смесью на 5-й день (40-50 мкл за раз).
   3. Начиная с 5-го дня, подвергайте мышей циклу гипоксии-реоксигенации-холода-шока два раза в день в течение 5 дней. Поместите мышей в устройство для гипоксии при 5% _O2 в течение 90 с и реоксигенируйте их в течение 3 мин; Повторите этот процесс пять раз. Затем поместите мышей в среду с температурой 4 °C на 15 минут, а затем перенесите их в инкубатор. См. рисунок 1A,B для индукционного процесса.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Цикл гипоксии-реоксигенации-стимуляции холода проводился один раз утром и один раз во второй половине дня. В контейнере готовили смесь 5% _O2 с 95% _N2 , а концентрацию измеряли с помощью детектора кислорода.
4. Внимательно наблюдайте за всеми мышами, взвешивайте их каждый день, записывайте выживаемость мышей в течение индукционного периода и записывайте характеристики стула (с липким стулом или без него / кровавым стулом).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Установленная модель NEC длится 5 дней.
5. На 10-й день или ранее, когда у мышей проявятся симптомы НЭК (илеус, гематохезия, диарея)¹³, усыпляют мышей путем ингаляционной анестезии изофлураном, затем немедленно собирают кишечную ткань. Не собирайте ткани у мышей, которые погибли спонтанно.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании конечная точка эвтеназии мышей была адаптирована, когда мышь проявляла гематохезию и цианоз всего тела.

3. Зажгите мышь

1. Зафиксируйте головку мыши, держа желудочный зонд в правой руке. Вставьте желудочный зонд из левого угла рта мыши.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Головка была закреплена указательным пальцем на голове мыши и осторожно нажата назад и вниз, чтобы мышь не сгибалась вперед во время операции и не влияла на введение желудочного зонда.
2. Медленно переместите трубку к центру рта. После введения в трубку примерно 2-3 см протолкните в пищеварительный тракт 40-50 мкл формулы или 20-30 мкл ЛПС. Смотрите рисунок 2A,B для gavage.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При нормальных обстоятельствах желудочный зонд вводится в пищеварительный тракт плавно. Если у мыши сильный рвотный рефлекс, желудочный зонд был введен в трахею по ошибке. Желудочный зонд должен быть осторожно вытащен, и мыши дать отдохнуть некоторое время, прежде чем пытаться снова принять участие. Кроме того, процедура gavage используется для индуцирования модели NEC перед эвтаназией мышей.

4. Соберите свежие образцы кишечной ткани для окрашивания гематоксилином и эозином (H & E)

1. Погружайте свежую ткань подвздошной кишки в 10% формалин в течение 24 ч.
2. Вставьте ткани в парафин и нарежьте их на 4 мкм срезы.
3. Депарафинизируйте срезы в ксилоле и последовательно регидратируйте их в абсолютном этаноле, 95% этаноле, 80% этаноле, 70% этаноле и дистиллированной воде, замачивая в течение 5 мин на каждой стадии. Окрашивают срезы раствором гематоксилина в течение 5 мин и дифференцируют их в 1% соляной кислоте в 75% спирте в течение 5 с. Наконец, окрашивают их раствором эозина в течение 1 мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: После окрашивания раствором гематоксилина его необходимо дифференцировать 1% соляной кислотой в этаноле для удаления чрезмерно связанного раствора гематоксилина и цитоплазматического гематоксилина. Концентрация 1% соляной кислоты подходит для тканей кишечника.
4. Исследуем гистопатологию кишечной ткани при 40-кратном увеличении.

Результаты

Модель NEC для мышей BALB/c была индуцирована искусственным вскармливанием, кормлением LPS, гипоксией и стимуляцией холода. В течение индукционного периода у мышей наблюдалась патология кишечника, характеристики стула, изменения массы тела и ежедневная выживаемость. Репрезентативные изоб?...

Обсуждение

NEC является наиболее распространенной неотложной ситуацией желудочно-кишечной системы для новорожденных, с высокой заболеваемостью и смертностью, особенно у недоношенных детей1,2,3. Однако его патогенез до сих пор неясен. В настоящее в?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absolute ethanol	Sinopharm Chemical Reagent Co., LTD.	100092683
Goat Milk powder	Petag	71795558417
HE dye solution	Sinopharm Chemical Reagent Co., LTD.	G1003
Isoflurane	RWD, Shenzhen Reward Life Technology Co., LTD.	R510
LPS	Sigma-Adrich	L2880
Medical oxygen	various	various
Microscope	NIKON	NIKON imaging system (DS-Ri2)
Neutral resin	Sinopharm Chemical Reagent Co., LTD.	10004160
Paraffin	various	various
Premature baby milk powder	Abbott	57430
Xylene	Sinopharm Chemical Reagent Co., LTD.	10023418
1% Hydrochloric acid	various	various
10% Formalin	LEAGENE	DF0110