Использование 2-фотонной микроскопии для количественной оценки влияния хронической односторонней обструкции мочеточника на клубочковые процессы

Резюме

Здесь мы представляем протокол с использованием 2-фотонной микроскопии у мюнхенских крыс Wistar Fromter с поверхностными клубочками для количественной оценки влияния длительной обструкции мочеточника на клубочковую динамику и функцию.

Аннотация

Применение новых методов микроскопии к подходящим моделям болезней животных для изучения динамической физиологии почек остается проблемой. Крысы с поверхностными клубочками предоставляют уникальную возможность исследовать физиологические и патофизиологические процессы с помощью прижизненной 2-фотонной микроскопии. Количественная оценка клубочкового капиллярного кровотока и вазоконстрикции и дилатации в ответ на лекарства, проницаемость и воспаление — это лишь некоторые из процессов, которые можно изучить. Кроме того, трансгенные крысы, то есть подоциты, помеченные флуоресцентными красителями и другими подходами к молекулярным биомаркерам, обеспечивают повышенную разрешающую способность для непосредственного мониторинга и количественной оценки белково-белковых взаимодействий и эффектов конкретных молекулярных изменений.

У мышей, у которых отсутствуют поверхностные клубочки после четырехнедельного возраста, односторонняя мочеточниковая обструкция (UUO) в течение нескольких недель использовалась для индуцирования поверхностных клубочков. Поскольку эта индукционная модель не позволяет проводить базовые исследования, мы количественно оценили влияние UUO на клубочковые процессы в модели UUO у мюнхенских крыс Wistar Frömter (MWF), которые имеют поверхностные клубочки в физиологических условиях. Модель UUO в течение пяти недель или более вызывала значительные изменения в грубой морфологии почек, перитубулярном и клубочковом микроциркуляторном русле, а также структуре и функции канальцевого эпителия. Поток клубочковых и перитубулярных эритроцитов (эритроцитов) значительно снизился (р< 0,01), вероятно, из-за значительного увеличения приверженности лейкоцитов (ЛЕЙК) в клубочковых и перитубулярных капиллярах. Коэффициент клубочкового просеивания альбумина увеличился с 0,015 ± 0,002 у необработанных MWF до 0,045 ± 0,05 у 5-недельных крыс UUO MWF. Двенадцать недель UUO привели к дальнейшему увеличению поверхностной клубочковой плотности и коэффициента клубочкового просеивания (GSC) для альбумина. Флуоресцентный альбумин, отфильтрованный через клубочки, не реабсорбировался проксимальными канальцами. Эти данные свидетельствуют о том, что использование UUO для индуцирования поверхностных клубочков ограничивает способность изучать и интерпретировать нормальные клубочковые процессы и изменения заболевания.

Введение

Понимание клубочковых процессов, особенно биологии подоцитов, было целью на протяжении более 50 лет. Мюнхенские крысы Wistar с поверхностными клубочками сыграли центральную роль в этих исследованиях, включая исследования микропунктуры, чтобы понять многочисленные аспекты физиологических и патологических процессов ^1,2,3. Использование микроскопии для изучения клубочковых компонентов прижизненно было ограничено из-за эффектов фототоксичности до появления 2-фотонной микроскопии, которая минимизировала это токсическое воздействие и увеличила глубину проникновения ^1,2. Наряду с быстрым прогрессом в компьютерном оборудовании и программном обеспечении, это позволило проводить трехмерные (3D) и четырехмерные (время) исследования в течение нескольких часов в одной обстановке ^1,4,5.

Количественная оценка клубочкового капиллярного кровотока, вазоконстрикции и дилатации в ответ на лекарства, проницаемость и влияние заряда на проницаемость и воспаление - это лишь некоторые из клубочковых процессов, которые были изучены. Кроме того, сегмент S1 проксимального канальца идентифицируется, а различия в поведении трубчатого эпителия S1 и S2 могут быть количественно определены ^1,4. Исследования на мышах, особенно с повсеместной доступностью мышиных трансгенных средств, привели к быстрому прогрессу в понимании молекулярной биологии процессов клубочковых заболеваний. Отдельные белки отвечают за клубочковую дисфункцию в нокаут-исследованиях, особенно в отношении протеинурии ^6,7,8. Тем не менее, использование мышиных моделей для исследований клубочковой визуализации было ограничено, поскольку клубочки находятся более чем на 100 мкм ниже поверхности в многочисленных изученных штаммах⁹.

Это привело исследователей к разработке и использованию мышиных моделей, приводящих к поверхностным клубочкам, которые можно изучать. Наиболее распространенной моделью является использование полного UUO 10,11,12. В конце расширенного периода UUO в почках мышей появляются многочисленные поверхностные клубочки, которые могут быть и были изучены^13,14. В этих исследованиях на мышах не было базового или контрольного исследования для определения влияния длительного UUO на клубочковую биологию. Поскольку это тяжелая и длительная модель повреждения, приводящая к быстрому фиброзу и разрушению коры 10,11,12, мы предположили, что это повлияет на клубочковые процессы и функцию. Чтобы ответить на этот вопрос, мюнхенские крысы Wistar Fromter (MWF) с поверхностными клубочками были использованы для изучения контрольных / исходных параметров, а исходный результат сравнивали с клубочковыми исследованиями на крысах MWF после пяти недель UUO. Мы также изучили крыс Sprague Dawley (SD), у которых нет поверхностных клубочков после UUO. Полученные данные показывают, что 5 недель UUO у крыс MWF и SD действительно увеличивают количество поверхностных клубочков. Однако это были аномальные клубочки с выраженными изменениями клубочкового кровотока, воспалением, проницаемостью и размером макромолекул.

протокол

Все эксперименты проводились в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных и были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию в Медицинской школе Университета Индианы.

1. Подготовка мюнхенской крысы Wistar Frömter или SD к операции UUO

1. Обезболить крысу с помощью изофторана (5% индукции, 1,5-2,5% поддержания), затем побриться, промыть и продезинфицировать хирургическую область несколько раз круговыми движениями как скрабом на основе йода, так и на основе хлоргексида и спиртом. Применять анальгетик длительного действия / медленного высвобождения для лечения боли в соответствии с институциональными руководящими принципами IACUC.
2. Сделайте разрез по средней линии с помощью скальпеля; найти левую почку и освободить ее от окружающих перитонеальных органов.
3. Осторожно найдите почечную ножку, которая включает почечную артерию, почечную вену и мочеточник. Отделите мочеточник от других структур, принимая меры предосторожности, чтобы не повредить деликатную структуру.
4. Используя тонкие щипцы, аккуратно обмотайте шов 3-0 вокруг мочеточника и завяжите его, стараясь не порвать. Повторите эту процедуру на несколько миллиметров по обе стороны от первого узла, чтобы завязать второй узел и обеспечить полное препятствие.
5. Как только процедура будет завершена, тщательно закройте последовательные мышечные слои. Перед закрытием последнего слоя добавьте 2 мл теплого, стерильного 0,9% физиологического раствора в брюшко, прежде чем полностью закрыть его. Закройте внешнюю кожу хирургическими скобами.
6. Применяйте анальгетик длительного действия / медленного высвобождения для лечения боли и внимательно следите за восстановлением в соответствии с институциональными руководящими принципами IACUC. После этого периодически проводите мониторинг и подготовьтесь к визуализации в конце пятой недели.

2. Синтез альбумина сыворотки техасской красной крысы (TR-RSA)

1. Взвесьте 100 мг сывороточного альбумина ratum и растворите его в 6,67 мл 0,1 М буфера бикарбоната натрия при рН 8,4 в конической трубке объемом 50 мл.
2. Во флакон с 5 мг техасского эфира Red-X-сукцинимидила добавьте 100 мкл диметилформамида (DMF, высокого качества) и вихрь до тех пор, пока весь краситель не растворится.
3. Поместите раствор альбумина крысиной сыворотки на вихрь при низкой/средней настройке, чтобы объем раствора вращался значительно ниже верхней части открытой трубки.
4. Добавьте растворенный краситель, пока трубка вихрь.
5. Возьмите коническую трубку объемом 50 мл, заверните ее в фольгу, поместите трубку на любой коромысл или валик и медленно перемешивайте в течение 1 ч при комнатной температуре (RT).
6. В 5-литровом ведре 0,9% NaCl с перемешивающим стержнем при мягком перемешивании смочите мембраны подходящего диализатора с отсечкой молекулярной массы 50 кДа (подходит мембрана с клипсами, закрытыми мембранными трубками или диализными кассетами).
7. Загрузите раствор TR-RSA в мембранную систему и прикрепите его к флотационным насадкам, обычно входящим в комплект поставки системы. Поместите контейнер объемом 5 л с 0,9% физиологическим раствором/TR-RSA на ночь при температуре 4 °C (в холодном помещении) с мягким перемешиванием на перемешиваемой пластине. Меняйте диализный раствор не менее трех раз в течение следующих 36 ч.
8. Набухание мембраны увеличит объем теперь уже прозрачного раствора TR-RSA. Разделите исходные 100 мг на объем, чтобы получить приблизительную концентрацию: соотношение краситель:белок составит 1:1. Аликвотировать в подходящие объемы и лиофилизировать для длительного хранения.

3. Подготовка к 2-фотонной прижизненной визуализации на инвертированном микроскопе

1. Снимите крышку нижней тарелки с крышкой 50 мм (диаметром крышки 40 мм) и поместите 8 кусков автоклавной ленты на внутреннее дно вдоль края. Сделайте пирамидальное пустое окно, используя по 4 штуки с каждой стороны, чтобы экстериоризированная почка плотно прилегала к этому пространству, сохраняя при этом периферический контакт с автоклавной лентой, тем самым помогая минимизировать движение. Отрегулируйте расстояние в соответствии с размером крысы, чтобы обеспечить наилучший контакт с почкой.
2. Поместите по 1 термопрокладке с каждой стороны нижней тарелки с крышкой 50 мм. Убедитесь, что согревающая подушка покрывает сцену.
3. Используйте 40-кратный объектив погружения в воду при 0,75-кратном зуме и 1,5-кратном зуме для создания 30-кратных и 60-кратных изображений соответственно, что позволяет получать изображения с меньшим и более высоким увеличением. При необходимости добавьте воду к объективу с помощью шприца объемом 1 мл с длинным куском трубки ПЭ-200, которая может достигать верхней части объектива под углом вниз, чтобы предотвратить попадание капли воды вниз по трубке.
4. Используйте 2% лазерной пропускаемости, с синими, зелеными и красными детекторами, установленными на заранее определенные уровни, чтобы обеспечить согласованность изображений между исследованиями. Установите длину волны возбуждения на 800 нм на указанном лазере (см. Таблицу материалов), который будет эффективно возбуждать все флуорофоры, используемые в этом исследовании.
   1. Используйте внешние (недесканированные) детекторы для сбора синего излучения с помощью фотоумножителя (PMT) (420-490 нм, коэффициент усиления 950).
   2. Используйте детектор Hyd для улавливания зеленых выбросов (500-550 нм, коэффициент усиления 100).
   3. Используйте детектор Hyd для захвата красных выбросов (590-660 нм, коэффициент усиления 200).
   4. Отрегулируйте смещение в PMT (синие излучения) так, чтобы только несколько пикселей в пустых областях ткани имели значение ноль.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Детекторы HyD для зеленого и красного излучения имеют автоматическую регулировку смещения; может быть установлен только коэффициент усиления.
   5. Установите битовую глубину на 12 бит, чтобы придать изображениям шкалу интенсивности 4096 между черным и белым.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимо установить нижние пределы детекторов (смещение в PMT), чтобы не исключать эти значения, чтобы обеспечить сбор выбросов низкой интенсивности в пространстве Боумена. Если настройка чувствительности слишком низкая, визуальные предупреждающие маркеры будут указывать на это; этим значениям присваивается нулевое значение интенсивности.
5. Развести приблизительно 6 мг сывороточного альбумина Texas-Red-X-Rat до общего объема 1 мл, загрузить раствор в шприц объемом 1 мл и поместить на внутренний катетер i.v на стадии 4.1 после инфузии Hoechst 33342 на стадии 9.1.

4. Хирургическая подготовка к прижизненной 2-фотонной визуализации

1. Поместите предварительно обезболенную крысу с внутренней венозной линией доступа (бедренной или яремной) на бок с бритым левым боком, обращенным вверх плоско и прямо на стол. Убедитесь, что передние лапы касаются друг друга, как и задние лапы.
2. Осторожно пальпируйте левый бок чуть ниже ребер, чтобы пощупать почку, чтобы определить естественное положение в животе. При необходимости проведите линию, используя постоянный маркер вдоль бритой области, разделив пополам почечный центр в ориентации нос к хвосту.
3. Используя пару зубчатых щипцов, захватите кожу и поднимите ее вверх, чтобы облегчить защемление постоянной маркерной линии парой гемостатов, чтобы раздавить подлежащую сосудистую систему и предотвратить кровотечение при выполнении разреза с помощью хирургических ножниц. Повторите это для тонкого наружного мышечного слоя, чтобы свести к минимуму кровотечение.
4. Чтобы сделать окончательный разрез тонкого внутреннего мышечного слоя брюшной полости, обустройте почку, чтобы оценить размер и положение. Осторожно поднимите внутренний мышечный слой парой щипцов и раздавите линию, которая делит кожу пополам над почкой с помощью гемостатов, что составляет примерно 1^/3 предполагаемого размера почки.
5. Поддерживая хватку на мышечном слое щипцами, делают заключительный разрез.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Лучше сделать меньший разрез и расширить по мере необходимости, чем сделать его слишком большим, что потребует частичного закрытия швом.
6. Осторожно захватите почку окружающим жиром. Используя обе руки с щипцами в каждой руке, работайте, чтобы захватить жир на нижнем полюсе почки, используя технику «рука-через руку», чтобы захватывать и удерживать почечный жир, работая вниз.
7. Крепко захватив жир на нижнем полюсе почки одной рукой, осторожно вытяните жир и, при необходимости, очень аккуратно сожмите почку через разрез. Если почка не проходит легко, расширьте разрез.

5. Позиционирование крысы для визуализации

1. Осторожно поместите открытую почку к краю чашки, с небольшим вращением, чтобы брюшная сторона почки соприкасалась с покровом, а спинная сторона была обращена в сторону от края.
2. Чтобы еще больше свести к минимуму движение, возьмите две стерильные марлевые подушечки 2 х 2, смочите их физиологическим раствором и упакуйте их против спинной стороны почки, усиливая контакт брюшной стороны почки с краем.
3. Посмотрите через окуляр микроскопа при эпифлуоресцентном освещении с помощью двухпроходного куба Родамин/FITC. При обнаружении движения внесите незначительные коррективы в положение и осторожно отрегулируйте марлю, следя за тем, чтобы она не проталкивалась под почку. Чтобы еще больше уменьшить движение, слегка переверните крысу, чтобы грудная клетка находилась дальше от тарелки.

6. Получение изображений для количественного анализа

1. Сканируйте поверхность почки с помощью эпифлуоресцентного освещения (шаг 5.3) и отмечайте положение (положения) клубочков с помощью программного обеспечения, связанного с моторизованным контроллером ступени (особенность современных систем).
2. Для каждого цветового канала под 2-фотонной подсветкой возьмите неглубокий 3D-объем верхней части каждого отмеченного клубочка, который будет служить фоном изображения. Используйте псевдоцветную палитру в опции отображения программного обеспечения для визуализации, чтобы лучше визуализировать слабые интенсивности фоновой флуоресценции клубочковых капиллярных петель.
3. Используя поверхностный кровеносный сосуд в качестве фокусной точки, медленно вводят флуоресцентный альбумин, позволяя вовремя наблюдать подъем и падение флуоресценции из-за системного распределения. Вливайте достаточно TR-RSA для достижения интенсивности в перитубулярной сосудистой и капиллярной петлях, которая находится чуть ниже насыщения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно существует задержка 5 с между инфузией материала и его появлением в кровотоке, когда почечная перфузия является нормальной.
4. Подождите примерно 10 минут, прежде чем получить 3D-объемы (интервал 1 мкм) для всех отмеченных и изображенных клубочков из шага 6.2.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мюнхенские крысы Симонсена Имеют меньше поверхностных клубочков. Однако, поскольку штамм Frömter крыс MW имеет большее количество поверхностных клубочков, часто можно получить до 10 клубочков.
5. Усыплите крысу через передозировку изофлурана в конце исследования. Выполните двойную пневмоторакотамию для обеспечения эвтаназии.

7. Расчет клубочковой проницаемости

1. Используя программное обеспечение для просмотра изображений, связанное с системой микроскопа, экспортируйте изображения в 12-битные необработанные изображения для обработки и анализа.
2. Загрузите фоновые 3D-тома и необработанный 3D-объем, содержащий циркулирующий флуоресцентный альбумин. Расположите фокальную плоскость в 3D-объеме с самой яркой поверхностной капиллярной петлей в клубочках с достаточным пространством до края окружающей капсулы Боумена.
3. Используя визуальные ориентиры, найдите ту же фокальную плоскость, что и в фоновом объеме. Выберите область в капиллярной петле и область в пространстве Боумена, отметив средние значения интенсивности каждого из них. Используйте эти значения интенсивности в качестве фоновых значений.
4. Наметьте область (по крайней мере, 20 x 20 пикселей в области) в пространстве Боумена на альбуминсодержащем изображении и обратите внимание на показания интенсивности (выберите область, которая не примыкает к капиллярной петле или капсуле Боумена, чтобы обеспечить максимально чистое измерение интенсивности пространства Боумена). Переместите нарисованную область на две другие области, чтобы получить среднее значение средней интенсивности в пространстве Боумена.
5. Выберите самую яркую интенсивность флуоресценции плазмы в сечении капиллярной петли и обведите эту область. Используя пороговую функцию, выделите яркие значения (обычно расположенные по краям стенок капиллярной петли), избегайте циркулирующих теней RBC и записывайте значение.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку факторы в крови будут вызывать недооценку уровней флуоресценции плазмы, важно выбрать наиболее яркие области.
6. Введите значения в электронную таблицу для расчета GSC с помощью Eq (1):
   ГСК = (1)

8. Расчет потока эритроцитов в поверхностных клубочковых капиллярных петлях и почечной сосудистой системе с использованием функции linecan

1. Найдите подходящий сосуд (либо капиллярную петлю, либо перитубулярный сосуд). Поскольку функция linescan в программном обеспечении для получения изображений, на которую указывает ссылка (см. Таблицу материалов), требует, чтобы сосуд был перпендикулярным, поверните изображение с помощью функции поворота .
2. После того, как сосуд повернут и лежит ровно, выберите функцию XT в меню приобретения . Настройте сканирование 4 000 строк. Проведите линию через судно, подлежащее осмотру; убедитесь, что фокальная плоскость находится на максимальном диаметре отрезка, подлежащего изображению.
3. Щелкните левой кнопкой мыши цветное составное изображение и выберите «Сделать снимок», чтобы создать эталонное изображение области, в которой были сделаны линии. Немедленно нажмите кнопку Пуск , чтобы захватить линейное сканирование судна.
4. Чтобы определить скорость потока RBC, импортируйте линейные сканы в программное обеспечение для обработки изображений (см. Таблицу материалов). Откройте диалоговое окно Показать статистику региона в раскрывающемся меню Измерение . Выберите инструмент рисования одной линии и нарисуйте линию, соответствующую наклону теней RBC. Обратите внимание на значения ширины и высоты.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Значения пикселей, полученные для ширины, будут соответствовать расстоянию; пиксели для высоты соответствуют времени.
5. Используйте следующую формулу (Eq (2)) для вычисления скорости.
   Расход РБК в мкм/с = (2)
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это соответствует параметрам сбора при 60-кратном увеличении и частоте сканирования 400 Гц с помощью эталонного микроскопа (см. Таблицу материалов).
   1. Сделайте не менее пяти расчетов и усредните их, чтобы сообщить скорость для каждой линии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эти параметры будут зависеть от размера пикселя и скорости захвата системы микроскопа.

9. Расчет окклюзии WBC в клубочковых капиллярных петлях

1. Вводите ядерное пятно Hoechst 33342 (при массе крысы ~8 мкг/кг) через внутреннюю венозную линию доступа для идентификации лейкоцитов, застрявших в капиллярных петлях.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Полезная глубина будет ограничена из-за рассеяния фотонов и поглощения гемоглобином, особенно для коротковолновых синих излучений.
2. Центрируйте клубочек в поле визуализации и принимайте набор 3D-данных, начиная с клубочковой поверхности и заканчивая данными не менее чем от 30 до 35 мкм. Используйте шаг размером 1 мкм в Z-направлении.
3. Идентифицировать WBC, сравнив синий канал Hoechst с каналом Texas Red albumin; ищите исключение красного красителя в капиллярной петле и соответствующего ядерного пятна, чтобы положительно идентифицировать лейкоциты. Определите белые кровяные клетки как «приклеенные», если они кажутся статичными на 3 оптических участках. Сообщайте значения в виде залегания/10 оптических срезов от верхней части клубочка, взятых с интервалом 1 мкм.

10. Оценка присутствия формаций Руло в поверхностных клубочках

1. Следуйте тем же инструкциям для шага 9.3 и получите набор 3D-данных. Ищите образования Руло, появляющиеся в виде эритроцитов, сложенных в пакеты, которые сопротивляются диссоциации, когда они движутся вдоль капиллярных петель. Используйте красный флуорофор для лучшей визуализации структуры на больших глубинах из-за меньшего рассеяния фотонов для более длинных волн красных излучений. Сообщайте значения в виде вхождения/25 оптических срезов от верхней части клубочка, взятых с интервалом 1 мкм.

11. Выделение клубочков

1. Изолируйте три группы клубочков из свежих почек, используя стандартную технику просеивания, которая приводит к почти 90% чистоте клубочков крыс¹⁵.
   1. Поместите кору почек в холодный фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS) и измельчите его, используя несколько тонких ножниц или лезвий бритвы.
   2. Добавьте измельченную ткань в 100 мкм стерильного клеточного ситечка и осторожно протолкните его, используя шприц-поршень объемом 5 мл и 50-100 мл холодного PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Большинство канальцев сохраняются, пока клубочки проходят.
   3. Поместите обогащенную фракцию клубочков на фильтр 70 мкм и тщательно промыть их холодным PBS. Промыть фильтр 100-200 мл холодного ПБС, чтобы удалить большую часть оставшихся канальцев.
   4. Соберите клубочки из фильтра с помощью 1-2 мл холодного PBS, центрифуги (10 000 × г, 2 мин, 4 °C) и заморозьте их в жидком азоте до выделения РНК.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Клубочковая чистота, определяемая с помощью фазово-контрастной микроскопии, составляет >90%, а выход составляет примерно 10 мг из 2 почек.

12. Клубочковая изоляция РНК

1. Гомогенизируйте замороженную гранулу клубочков с использованием реагента, выделяющего РНК, добавив 400 мкл реагента и разбив гранулу с помощью наконечника пипетки объемом 200 мкл с последующим коротким вихрем и 5 мин инкубации при RT¹⁶.
2. Добавьте 40 мкл 1-бром-3-хлорпропана (BCP), вихрь в течение 15 с и подержите при RT в течение 15 мин.
3. Центрифуга при 12 000 × г, 15 мин, 4 °C. Удалить водный слой, разбавить нижний слой равным объемом 70% этанола и загрузить его непосредственно на спиновую колонну (см. Таблицу материалов).
4. После промывки, каждая из которых состоит из добавления соответствующего раствора в колонну с последующим центрифугированием при 12 000 х г, 15 с, 26 °C [3 всего, сначала 2 с 500 мкл RPE (запатентованный мягкий промывочный буфер с этанолом для удаления следов солей,^3-я промывка с 500 мкл 80% EtOH], элюируют РНК путем добавления 15 мкл_H2 O и центрифуга, что касается промывок. Проверьте концентрацию и чистоту РНК и транспортируйте образцы РНК в ядро для анализа Nanostring^17,18.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Общий выход РНК составляет приблизительно 1-2 мкг. Здесь 24 образца содержали 200 нг РНК при 30 нг/мкл.

13. Нанострочный анализ

ПРИМЕЧАНИЕ: Технология Nanostring основана на цифровом обнаружении и прямом молекулярном штрих-кодировании молекул-мишеней, которые используют пары зондов с цветовой кодировкой. Зонд Capture несет фрагмент биотина на 3'-конце, а зонд Reporter несет сигнал на своем 5'-конце.

1. Отправьте пары генных зондов Nanostring и CodeSets в Genomic Core Facility штата Мичиган и используйте их в соответствии с указаниями NanoString.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Существует шесть позиций для цветовых кодов, и каждая позиция может быть одним из четырех цветов, что обеспечивает большое разнообразие тегов, каждый из которых может быть индивидуально разрешен и идентифицирован во время сбора данных.
2. Получите данные, собранные сотрудниками объекта Genomic Core с помощью запатентованного анализатора Nanostring nCounter Digital, который собирает поля зрения с помощью объектива микроскопа и ПЗС-камеры, а также табулирует и отображает количество штрих-кодов.
3. Импортируйте необработанные данные в программное обеспечение nanostring nSolver для анализа. Нормализуйте нормализованные данные, используя их настройки по умолчанию, и сравнивайте данные между группами, как описано в руководстве.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Цель состояла в том, чтобы контролировать изменения генов, которые, как было ранее показано, были изменены в кортикальной ткани из модели UUO¹⁹, заболевание почек ^{17,20,21,22,23,24,25,26}. В общей сложности 126 генов, включая рекомендуемые положительные и отрицательные контрольные группы, были проанализированы в каждой группе клубочков (CONT, SHAM и UUO).

Результаты

Три группы клубочков были выделены с использованием стандартного метода просеивания, который приводит к почти 90% чистоте клубочков крыс¹⁵. Первая группа клубочков была из левой почки крыс SD, которые подвергались зажатию левой почки мочеточника в течение 5 недель, UUO (5 самцов, 3 самки). Вторая группа клубочков была выделена из контралатеральной контрольной почки от той же крысы, CONT (5 самцов, 3 самки). Третья группа клубочков была выделена из крыс SD, перенесших операцию SHAM, а левая почка использовалась для выделения клубочков через 5 недель, SHAM (4 самца, 4 самки).

Морфологические изменения
Экстернализация закупоренной почки для визуализации выявила сильно увеличенную почку, примерно в четыре раза превышающую нормальный размер, с тонким эпителием, видимым через заполненную жидкостью внутреннюю часть почки. Через 20-кратный объектив, использующий эпифлуоресцентное освещение и двухпроходный куб FITC/Rhodamine, наиболее очевидным изменением было истончение трубчатого эпителия и равномерный коллапс трубчатых просветов по всей трубчатой длине. Гистология была хорошо описана и является тяжелой к одной неделе UUO 10,11,12. Количество клубочков, видимых на поверхности у крыс MWF и SD, увеличилось после пяти недель односторонней обструкции мочеточника. На рисунке 1A показан метод, используемый для создания модели UUO. Правая почка нетронута и обеспечивает адекватную скорость клубочковой фильтрации для крысы. Количество клубочков на поле с использованием 20-кратного объектива (363 мкм x 363 мкм) было подсчитано и показано на графике на рисунке 1B. Количество поверхностных клубочков у крыс MWF увеличилось с 1,08 ± 0,11 / поле у необработанных крыс до 2,97 ± 0,65 / поле в пятинедельной группе UUO. Крысы SD перешли от отсутствия поверхностных клубочков к 2,02 ± 0,37 / поле после 5 недель UUO.

Прижизненные 2-фотонные изображения этих крыс были сделаны после инъекции TR-RSA (красный), Каскадный синий декстран 10 кДа (10 кДа-CB) и Hoechst 33342 для маркировки ядер (голубой). Они показаны для нормальных крыс MWF (рисунок 1C), крыс MWF после пяти недель UUO (рисунок 1D) и крыс SD после пяти недель UUO (рисунок 1E). Эти изображения подчеркивают драматические изменения, которые происходят в трубчатом эпителии. Проксимальные канальцевые лизосомы, которые обычно представляют собой небольшие пунктатные скопления оранжевого цвета у необработанных крыс MWF и SD, становятся крупными сингулярными вакуолярными структурами, которые заполняют большую часть сморщенной трубчатой клетки. Как обрисовывается альбумином TR-RSA, сосудистая система оказалась выпрямленной, а во многих сосудах, лишенных протекающих эритроцитов, показывая только струящуюся плазму. Фиксация почек показала, что кора истончилась до волокнистой кожи не толще миллиметра. Эти наблюдения согласуются с ранней литературой, использующей эту модель 3,10,11,12.

Изменения в динамике сосудов почек и клубочковой проницаемости
Почечный кровоток был значительно снижен как в пятинедельных группах UUO MWF, так и в группах SD по сравнению с необработанными крысами (рисунок 2). Крысы MWF с фиктивным управлением имели перитубулярный расход RBC 885 ± 25 мкм/с. Перитубулярный поток эритроцитов у пятинедельных крыс UUO MWF и SD снизился до 250 ± 100 мкм/с и 200 ± 125 мкм/с соответственно. Эти значения были рассчитаны путем сбора линейных сканов по перитубулярным сосудам для расчета скорости RBC. На рисунке 2D показан график этих данных.

Скорость RBC в клубочковых капиллярных петлях была значительно снижена у пятинедельных крыс UUO MWF и SD по сравнению с необработанным MWF (рисунок 3). Во многих случаях было обнаружено, что клубочки имеют капиллярные петли, полностью лишенные протекающих эритроцитов. Скорость потока эритроцитов капиллярного контура составляла 1 405 ± 425 мкм /с, 250 ± 220 мкм /с ± и 190 ± 200 мкм /с или необработанные MWF, пятинедельные UUO MWF и пятинедельные крысы UUO SD соответственно (рисунок 3D). В капиллярных петлях пятинедельных групп UUO вялый поток эритроцитов выявил наличие адгезивных лейкоцитов, либо замедляющих поток, либо блокирующих его, причем только поток плазмы визуализируется вниз по течению от частичной или полной обструкции. Чтобы количественно оценить это наблюдение, количество адгезивных ЛЕЙК, обнаруженных в 3D-объеме, было подсчитано, а затем нормализовано до встречаемости на каждые 10 мкм глубины 3D-объема. Структуру прилипшей белой клетки можно было различить с помощью флуоресценции голубого ядерного красителя от Hoechst 33342. К сожалению, больший фотонный разброс синих излучающих огней ограничил надежную идентификацию WBC по их ядрам в верхние 10 оптических секций сверху, взятых на шагах клубочкового объема 1 мкм. Необработанные крысы MWF имели менее 0,125 ± 0,05 WBC / 10 оптических секций сверху, взятых при объеме шагов 1 мкм, в то время как это число увеличилось до 1,5 ± 0,5 и 3,25 ± 0,7 у 5-недельных UUO MWF и 5-недельных UUO SD крыс соответственно (рисунок 3E).

Другим сосудистым изменением, которое также может объяснять снижение потока эритроцитов в 5-недельных группах UUO, было регулярное появление формаций Руло (сгруппированные эритроциты, которые придерживаются в конфигурации «сложенной монеты», см. вставку на рисунке 3F). Формации Руло текут медленнее и могут быть остановлены адгезивным WBC. Необработанные крысы WMF практически не имеют образований Руло в своих клубочковых капиллярах, имея только 0,05 ± 0,05 вхождения на 25 оптических срезов сверху, взятых с шагом 1 мкм. У пятинедельных крыс UUO MWF и SD наблюдалось заметное увеличение формаций Руло на 2,27 ± 0,46 и 1,46 ± 0,73 на 25 оптических участков, начиная с вершины, взятых с шагом 1 мкм соответственно (рисунок 3F).

В дополнение к снижению скорости потока клубочкового эритроцита, наблюдаемому при UUO, наблюдалось увеличение проницаемости альбумина. Наблюдалась большая гетерогенность в проницаемости альбумина между клубочками. Иногда накопление альбумина в пространстве Боумена было достаточно интенсивным, чтобы его можно было четко увидеть (рисунок 4B, звездочка). Коэффициент клубочкового просеивания альбумина увеличился с 0,015 ± 0,002 в необработанных MWF до 0,045 ± 0,05 у 5-недельных UUO MWF и 0,052 ± 0,075 у пятинедельных крыс UUO SD.

Измененная функция проксимальных канальцев
Интересно, что отфильтрованный альбумин не мог быть обнаружен в проксимальных канальцевых клетках после UUO. Сегмент S1 обычно эндоцитозирует большое количество альбумина ^27,28,29,30, как показано здесь в физиологических условиях у необработанных крыс MWF (рисунок 5A). Такое же поглощение не наблюдалось в MWF или SD PT после 5 недель UUO (рисунок 5B, C). Проксимальные канальцы, окружающие клубочки, изображенные между 45 и 60 мин после инфузии TR-RSA, оценивали либо по присутствию (1), либо по отсутствию (0) альбумина. Важно отметить, что в физиологических условиях сегмент S1 жадно связывает и интернализует альбумин практически без альбумина, достигающего дистальных канальцев или собирающих протоков. Таким образом, само собой разумеется, что последние сегменты проксимальных канальцев могут не содержать альбумин, что приводит к фракционной положительности для поглощения альбумина менее 1,0. На рисунке 5D показан график с результатами оценки поглощения альбумина в проксимальных канальцах. Необработанный MWF имел значение фракционного поглощения проксимальных канальцев 0,556 ± 0,126. Как пятинедельные крысы UUO MWF, так и крысы SD имели значительно более низкие значения 0,049 ± 0,126 и 0,00 ±0,00 соответственно.

Исследования были также завершены на 12-недельных крысах UUO MWF (таблица 1). Двенадцать недель UUO - это стандартное время, используемое для исследований на мышах, чтобы вызвать поверхностные клубочки. Были сфотографированы три самца крыс UUO, и клубочковая плотность увеличилась до 6,16 ± 1,83 клубочков на 20-кратное поле у этих крыс. Скорость потока RBC составила 293 ± 67 мкм/с, адгезия WBC составила 1,47 ± 1,12, что аналогично 5-недельным данным UUO. GSC альбумина также увеличился по сравнению с 5-недельными крысами UUO до 0,109 ± 0,04.

Клубочковые изменения мРНК, индуцированные хроническим UUO
В таблице 2 показаны все гены (зонды) с их сгруппированной экспрессией и значениями стандартного отклонения. Обратите внимание, что гены были отобраны для анализа на основе предыдущих документов об изменениях при заболевании почек, включая UUO, как описано в примечании к разделу 13 протокола. Рисунок 6 представляет собой тепловую карту данных, подчеркивающих драматические изменения в экспрессии генов для большинства генов в клубочках UUO по сравнению с контрольными или фиктивными клубочками.

Рисунок 1: Увеличение количества поверхностных клубочков и индукция поверхностных клубочков у крыс SD после 5-недельного UUO у крыс MWF. (A) Хирургическая диаграмма мочеточника на левой почке, тщательно освобожденного от почечной артерии и вены перед тем, как быть закупоренным двумя связями с использованием хирургического шва. (B) График, показывающий увеличение числа поверхностных клубочков, присутствующих у крыс MWF до и через пять недель после UUO, а также количество поверхностных клубочков у крыс SD, которые обычно не имеют поверхностных клубочков. Количество поверхностных клубочков у крыс MWF увеличилось с 1,08 ± 0,11 / поле у необработанных крыс до 2,97 ± 0,65 / поле в 5-недельной группе UUO. SD крысы перешли от отсутствия поверхностных клубочков к 2,02 ± 0,37 / поле. Трехмерные реконструированные изображения показывают почечную поверхность для необработанных MWF (C), MWF после 5-недельного UUO (D) и SD после пятинедельного UUO (E). Обратите внимание на появление больших оранжевых вакуолярных структур, которые объединились из небольших отдельных лизосом в большие аномальные тела. 5-недельный UUO у крыс SD не приводил к областям, напоминающим нормальный трубчатый эпителий, наблюдаемый при C и частично у D. Сосудистая система казалась выпрямленной в некоторых областях и во многих из них имела частичные окклюзии, которые позволяли плазме, но не эритроцитам течь. (n = 3 самца крыс в группе) Шкала стержней = 40 мкм. Полосы ошибок указывают на стандартное отклонение. Сокращения: UUO = односторонняя обструкция мочеточника; СД = Спрэг-Доули; MWF = Мюнхен Вистар Фрёмтер; G = клубочек; Эритроциты = эритроциты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Уменьшение потока эритроцитов в поверхностной перитубулярной сосудистой системе после 5-недельного UUO. Линейные деканы собирали в перитубулярных кровеносных сосудах для определения скорости потока эритроцитов в мкм/с. Вкратце, красные опорные линии, показанные в A, B и C , представляют собой небольшую область, в которой одна и та же область пикселя сканировалась многократно, а изображения складывались в столбец для визуализации искажений, вызванных текучими эритроцитами, которые движутся быстрее, чем микроскоп может их получить. Столбец, прилегающий к эталонной фигуре, представляет собой linecan, при этом наклон искажения RBC используется для расчета скорости (ось x = расстояние и ось y = время). Здесь постепенно более крутые склоны соответствуют более медленным скоростям RBC, поскольку они остаются длиннее в области линейных линий. Обратите внимание на разницу во внешнем виде эритроцитов у необработанных крыс MWF (A) по сравнению с пятинедельными изображениями UUO для крыс MWF (B) и SD (C). Скорости потока RBC для трех групп крыс показаны в D. Перитубулярный поток РБК в необработанных MWF составлял в среднем 885 ± мкм/с. Эти значения значительно снизились через пять недель после UUO у крыс MWF и SD до 250 ± 100 мкм/с и 200 ± 125 мкм/с соответственно. Шкала бара = 20 мкм, n = 3 самца крыс на группу. Полосы ошибок указывают на стандартное отклонение. Сокращения: UUO = односторонняя обструкция мочеточника; СД = Спрэг-Доули; MWF = Мюнхен Вистар Фрёмтер; Эритроцит = эритроциты; WBC = лейкоцит. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Значительное снижение потока эритроцитов клубочковой капиллярной петли и индуцированная активация адгезии лейкоцитов 5-недельным UUO. Тот же подход, используемый для определения перитубулярного потока эритроцитов, был использован для исследования изменений в клубочковом капиллярном кровотоке. Панели A, B и C показывают макет, аналогичный рисунку 2 , и фокусируются на клубочке в фиктивно управляемых MWF, пятинедельных UUO MWF и пятинедельных UUO SD соответственно. (D) График, показывающий физиологически высокий расход эритроцитов в капиллярных петлях у крыс MWF с фикативным управлением, в среднем 1 405 ± 425 мкм/с ± 425, сниженный до 250 ± 220 мкм/с и 190 ± 200 мкм/с для 5-недельных крыс UUO MWF и 5-недельных UUO SD, соответственно. При исследовании клубочковых капиллярных петель адгезивные лейкоциты были легко видны при фокусировке через клубочек. Были взяты трехмерные оптические участки отдельных клубочков, и первые 10 оптических секций, расположенных на расстоянии 1 мкм друг от друга, были использованы для измерения количества адгезивных WBC. Необработанные крысы MWF практически не имели видимых ЛЕЙК в своих объемах, в среднем менее 0,125 ± 0,05 WBC / 10 оптических секций сверху, взятых с шагом 1 мкм. У 5-недельных крыс UUO MWF и SD эти числа увеличились до 1,5 ± 0,5 и 3,25 ± 0,7 WBC / 10 оптических секций сверху, взятых с шагом 1 мкм соответственно. Эти результаты показаны на графике на панели E, с цветными вставками, показывающими WBC, закрывающие капиллярные петли. Образования Руло (стрелки, вставка на панели F) выглядят как эритроциты, тесно связанные друг с другом в конфигурации «сложенной монеты», которые в значительной степени сохраняют свою связную группировку даже в турбулентности кровотока. Эти патологические структуры были легко различимы на больших глубинах внутри клубочка. Фиктивные крысы MWF были в значительной степени лишены этих структур, имея только 0,05 ± 0,05 в 25 оптических секциях сверху, взятых с шагом 1 мкм клубочкового объема. Напротив, 5-недельный UUO как у MWF, так и у SD крыс имел заметное увеличение формаций Rouleaux с залеганиями 2,27± 0,46 и 1,46 ± 0,73/25 оптических секций сверху, взятых с шагом 1 мкм соответственно. Шкала баров = 20 мкм, n = 3 самца крыс на группу. Полосы ошибок указывают на стандартное отклонение. Сокращения: UUO = односторонняя обструкция мочеточника; СД = Спрэг-Доули; MWF = Мюнхен Вистар Фрёмтер; Эритроцит = эритроциты; WBC = лейкоцит. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Значительное увеличение клубочковой проницаемости капиллярного альбумина после 5-недельного UUO. Панели A, B и C показывают псевдоцветные изображения 3D-объема для канала альбумина сыворотки крыс у необработанных MWF, 5-недельных UUO MWF и пятинедельных UUO SD крыс соответственно. Изображения представлены в псевдоцветной палитре, чтобы подчеркнуть заметное количество отфильтрованного альбумина, наблюдаемого в пространстве Боумена, особенно на панели B (звездочка). (A) Пространство Боумена (звездочка) показывает нормальный уровень альбумина, обычно наблюдаемый у необработанных крыс MWF, неразличимый для глаз. Изображения клубочков были сделаны до инфузии альбумина для вычитания фоновых значений флуоресценции из тех, которые были получены после введения альбумина. (D) График с клубочковым коэффициентом просеивания для альбумина у необработанных крыс MWF, имеющий значение 0,015 ± 0,002. Это значение значительно увеличилось до 0,045± 0,05 у 5-недельных крыс UUO MWF и 0,052 ± 0,075 у пятинедельных крыс UUO SD. Этот параметр представляет собой ratioed значение флуоресцентных интенсивностей пространства Боумена, деленное на значение плазмы и не имеющее связанной с ним единицы измерения. Шкала бара = 20 мкм, n = 3 самца крыс на группу. Шкала интенсивности псевдоцвета расположена под панелью D. Полосы ошибок указывают на стандартное отклонение. Сокращения: UUO = односторонняя обструкция мочеточника; СД = Спрэг-Доули; MWF = Мюнхен Вистар Фрёмтер; Эритроцит = эритроциты; WBC = лейкоцит. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5: Снижение функции в проксимальных канальцах после 5-недельного UUO. (A) Изображение поверхностного клубочка и сегмента S1 у обычной мюнхенской крысы Wistar Frömter, полученное через 40 мин после инфузии TR-RSA и каскадного синего декстрана. Интернализацию TR-RSA можно увидеть в сегменте S1 и проксимальном канальце. В отличие от этого, крысы MWF (B) и крысы SD (C), подвергшиеся 5-недельному UUO, демонстрируют сильно измененные проксимальные канальцы с минимальным или нулевым поглощением TR-RSA. Обычно маленькие, пунктатные автофлуоресцентные лизосомы (А) становятся крупными и вакуолярными желто-оранжевыми структурами, часто с полным коллапсом трубчатого просвета, который не может быть найден в трехмерных наборах данных. (C) Дистальные канальцы, обычно лишенные какой-либо формы автофлуоресценции, теперь содержат автофлуоресцентные скопления. Оценка проксимальных канальцев, окружающих клубочки, на аналогичных изображениях, сделанных через 45-60 мин после инфузии, для поглощения альбумина, показала значительную разницу между группой MWF с фикативным управлением и обеими 5-недельными группами UUO. Необработанные крысы MWF имели значение фракционного поглощения проксимальных канальцев 0,556 ± 0,126. Как пятинедельные крысы UUO MWF, так и крысы SD имели значительно более низкие значения 0,049 ± 0,126 и 0,00 ±0,00 соответственно. Шкала бар = 20 мкм, n = 3 самца крыс на группу. Полосы ошибок указывают на стандартное отклонение. Сокращения: UUO = односторонняя обструкция мочеточника; СД = Спрэг-Доули; MWF = Мюнхен Вистар Фрёмтер; Эритроцит = эритроциты; WBC = лейкоцит; TR-RSA = Альбумин сыворотки техасской красной крысы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 6: Изменения экспрессии генов с помощью UUO. (A) Тепловая карта данных. (B) Нормализованные изменения генов для всех данных на точечной диаграмме. Экспрессия генов в контрольных почках была построена от низкой до высокой экспрессии, а гены из почек SHAM и UUO сравнивались с уровнями контрольной экспрессии. Точки данных генов, приближающиеся к диагональному значению контрольных генов, указывают на одинаковые уровни экспрессии для обеих групп, в то время как точки данных выше или ниже диагонали указывают на более высокие или более низкие уровни экспрессии соответственно. Обратите внимание, что гены SHAM группируются ближе к контрольной диагональной экспрессии, чем гены UUO, которые более изменчивы. Аббревиатура: UUO = односторонняя обструкция мочеточника. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 1: Прогрессирование травмы от 5 до 12 недель UUO. Сравнение 5- и 12-недельных параметров визуализации UUO у трех самцов крыс MWF и трех самцов крыс SD в каждый момент времени. Пятинедельные данные такие же, как и на предыдущих рисунках. Обратите внимание на увеличение клубочковой плотности и GSC для альбумина с продолжающимся UUO. Сокращения: UUO = односторонняя обструкция мочеточника; СД = Спрэг-Доули; MWF = Мюнхен Вистар Фрёмтер; GSC = клубочковый коэффициент просеивания. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Таблица 2: Анализ маркеров воспаления в клубочках из UUO и контрольных крыс. Пары генных зондов и CodeSets были разработаны и использованы в соответствии с указаниями NanoString. Было проанализировано более 100 генов, а также положительный и отрицательный контроль, как указано в Nanostring. Все гены (зонды) с их сгруппированной экспрессией и значениями SD приведены в таблице. Рисунок 6A представляет собой тепловую карту данных, в то время как рисунок 6B представляет изменения генов для всех данных на точечной диаграмме. Обратите внимание на сходство между контрольной группой и SHAM и различные изменения для большинства генов в UUO. Сокращения: UUO = односторонняя обструкция мочеточника; SD = стандартное отклонение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Обсуждение

Изучение клубочковой физиологии видело много различных подходов, в первую очередь использование микропунктуры, перфузии изолированных клубочков и микроскопии. Наличие поверхностных клубочков у мюнхенских крыс Wistar, штаммов Фромтера и Симонсена позволило проводить динамические исследования in vivo . Одним из важных замечаний для исследователей, применяющих эту технологию, является необходимость установки параметров сбора для поддержания последовательных изображений между исследованиями, поэтому автофлуоресценция в ткани остается последовательной. Использование двухпроходного флуоресцеинового / родаминового эпифлуоресцентного куба и настройка параметров усиления на зеленый и красный каналы излучения для имитации на экране компьютера того, что видно через окуляры, обеспечит постоянную цветовую сигнатуру в автофлуоресценции даже между различными системами микроскопов.

Штамм Фромтера широко использовался, поскольку он имеет уменьшенное количество общих клубочков, ~ 75% нормальных, и у мужчин спонтанно развивается гипертония в возрасте около 12 недель, с прогрессирующей протеинурией и последующим фокальным клубочковым склерозом, в конечном итоге умирающим от почечной недостаточности¹². Использование этих крыс и добавление 2-фотонной микроскопии с ее уменьшенной фототоксичностью, улучшенной глубиной проникновения и возможностью одновременного просмотра нескольких флуоресцентных зондов проложили путь к новым открытиям ^1,4,5. С развитием компьютерного оборудования и программного обеспечения количественные данные теперь являются стандартом для всех 2-фотонных лабораторий. Разработаны и применены многочисленные количественные методы к клубочковым, проксимальным канальцам, сосудистым и интерстициальным процессам в физиологических и болезненных условиях 1,4,5,27,28,29,30.

Трансгенные мышиные генерирующие средства добавили новое измерение к изучению физиологии и патологии почек, и это был только вопрос времени, когда это было объединено с 2-фотонной микроскопией, чтобы еще больше очертить важность конкретных генных продуктов в структуре и функции почек. Однако мышиные клубочки, за исключением очень молодых мышей, расположены на расстоянии более 100 мкм от поверхности почки⁹. Двухфотонную микроскопию лучше всего проводить на глубине от 20 до 50 мкм в качестве разрешения, и интенсивность флуоресценции быстро уменьшается после этого из-за рассеяния света излучаемого света и поглощения от взаимодействия с гемоглобином. Поэтому необходимо было индуцировать поверхностные клубочки. Обычно используется подход, представляющий собой длительную одностороннюю модель обструкции в течение 12 недель. Поскольку эти модели не позволяют определить исходные условия, отделение эффектов UUO от изучаемого процесса невозможно.

Используя крыс MWF, можно сравнить базовую клубочковую функцию с следующей UUO. Эта модель UUO, как известно, вызывает воспаление и быструю скорость фиброза и использовалась для изучения ХБП и фиброза 10,11,12. Как и ожидалось, наблюдалось увеличение поверхностных клубочков как у MWF, так и у крыс SD. Более того, количественные результаты, полученные после UUO для крыс MWF и SD, были очень сопоставимы. Ранее сообщалось о снижении кровотока, зарегистрированном здесь, при сравнении микроскопических данных после UUO с данными микропунктуры³. Также было хорошо известно, что канальцевая и интерстициальная гистология заметно изменена, а ПТ в основном нефункциональны, как сообщается здесь, с отсутствием эндоцитоза альбумина. Исследования на рисунках 2 и 3 показывают резкое снижение скорости потока эритроцитов в клубочковых и перитубулярных капиллярах и усиление адгезии лейкоцитов. Снижение потока, вероятно, связано с закупоркой капилляров от адгезии WBC и образований руло.

Чтобы дополнительно оценить воспаление, мы количественно оценили проницаемость альбумина и показали, что она увеличивается в десять раз. Кроме того, изолированные клубочки показали, что экспрессия мРНК увеличилась для многих генов, которые, как ранее сообщалось, были увеличены при воспалении почек в различных состояниях заболевания почек 17,19,20,21,22,23,24,25,26 . Увеличение клубочковой поверхностной плотности и проницаемости альбумина было прогрессирующим, как показали 12-недельные данные UUO. Представленные данные являются первыми, которые непосредственно показывают, что клубочки подвергаются значительным структурным повреждениям, воспалению и молекулярным изменениям в модели UUO. Результаты согласуются с более ранним исследованием целой почечной ткани, в котором анализировались биопсии почек овец после UUO, обнаружив, что множественные маркеры воспаления повышены^{на 19}. Настоящие результаты показывают, что в клубочках существует выраженное воспаление, ранее известное только для кортикальной ткани.

Настоящие данные отличаются от более ранних исследований на мышах, где не было обнаружено никаких изменений в экспрессии молекул адгезии, отложении комплемента и инфильтрации нейтрофилов между 12-недельными постгидронефротическими и нормальными клубочками³¹. Кроме того, лаборатория Хикки использовала 12-недельную модель UUO для изучения иммунных реакций у клубочков мышей. Они не обнаружили различий в инфильтрации нейтрофилов между четырехнедельными клубочками мыши и постобструктивными клубочками^32,33. Эти более поздние исследования были проведены после того, как таз закупоренной почки был выведен из мочи. Мы этого не сделали, так как хотели определить влияние UUO на клубочковую функцию, как это было бы in vivo, без искусственного удаления жидкости, вызывающей обструкцию. Наконец, использование UUO у мышей заменяется визуализацией клубочков на глубине более 100 мкм под поверхностью. Хотя это возможно, существует компромисс в разрешении и интенсивности, которые значительно снижаются по мере того, как один из них выходит за пределы 50 мкм³⁴.

Представленные результаты не удивительны, если собрать воедино данные из существующей литературы по гистологическим изменениям, образованию клубочков, воспалению, фиброзу, гемодинамике 10,11,12. Представленные данные, включая адгезию WBC, образования руло, клубочковые молекулярные маркеры воспаления и повышенную проницаемость альбумина, дополнительно указывают на обширное воспаление, которое продолжается в этой модели UUO даже через пять недель, а также присутствует через двенадцать недель. Очевидно, что хронический UUO не является физиологическим состоянием, и использование UUO для индуцирования поверхностных клубочков представляет собой модель травмы. Крысы MWF, которые имеют поверхностные клубочки в физиологических условиях, могут быть продольно изучены по мере получения травмы. Можно генерировать трансгенных крыс, и многочисленные исследователи создают их с помощью биосенсоров, чтобы задавать конкретные вопросы. В частности, Медицинский колледж Висконсина теперь имеет колонию крыс MWF и сделал трансгенных крыс с целью изучения клубочковых процессов в физиологических и патологических условиях. Эти крысы MWF предлагают прекрасную возможность для изучения клубочковых процессов у нормальных, больных и генетически измененных крыс.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
70 µm sterile cell strainer	Corning	#421751
100 µm sterile cell strainer	Corning	#421752
CA Micro scissors Model 1C300	Electron Microscopy Sciences	Cat# 72930
Electric heating pad	Sunbeam	Kroger
Handling Forceps	Electron Microscopy Sciences	Cat# 72962
Kelly Hemostatic Forceps (straight)	Electron Microscopy Sciences	Cat#72930
Leica Dive SP-8 Multi-Photon Inverted Microscope	Leica Microsystems	Note: Version 7.1r1
MaiTai DeepSee titanium-sapphire laser	Spectra-Physics	NA
Mayo Dissecting Scissors	Electron Microscopy Sciences	Cat# 78180-1C3
Metamorph Image processing Software	Molecular Dynamics	Cat# 78266-04
Microsoft Excel	Microsoft Corportation	2007 version
Quant-iT RNA Assay Kit	Invitrogen/ThermoFisher	Q33140
Reptitherm Undertank Heater	Zoomed	Amazon
RNeasy MinElute Cleanup Kit (Spin columns)	Qiagen	74204
RPE buffer	Qiagen	1018013
Strate-Line Autoclave Tape	Fisher Scientific	Cat# 11-889-1
TRI Reagent	Sigma	T9424
Willco-dish Coverslip Bottom Dishes (50 mm/40 mm coverslip)	Electron Microscopy Sciences	Cat# 70665-07