Оценка влияния факторов роста на продукцию хлорофиллов а и в из микроводорослей

Резюме

В настоящем исследовании подчеркиваются преимущества использования метода, разработанного Джеффри и Хамфри для извлечения и количественного определения жирорастворимых пигментов из микроводорослей. Этот метод служит ценным инструментом для оценки влияния факторов роста на продукцию хлорофилла и содержание клеток в этих организмах.

Аннотация

Микроводоросли содержат две основные группы пигментов: хлорофиллы и каротиноиды. Хлорофилл – это зеленый пигмент, который поглощает световую энергию и преобразует ее в химическую энергию, способствуя синтезу органических соединений. Этот пигмент служит ценным первичным источником для биотехнологических продуктов в пищевой, фармацевтической и косметической промышленности благодаря своим высоким антиоксидантным свойствам и красящим свойствам. Целью данного исследования была оценка влияния факторов роста (концентрация CO₂ , цвет и интенсивность света) с помощью экспериментального дизайна Taguchi L₄ на рост клеток и содержание хлорофилла a и b в клетках Chlorella sorokiniana с последующей валидацией метода с использованием Haematococcus pluvialis микроводоросли в качестве дополнительной модели для исследования. Количественный рост клеток определяли с помощью спектрофотометрического метода оптической плотности на длине волны 550 нм. Для количественного определения хлорофиллов был получен клеточный экстракт с использованием 90% чистого раствора ацетона, а затем концентрации хлорофиллов a и b количественно определяли с помощью спектрофотометрических методов на длинах волн 647 нм и 664 нм, согласно методу, описанному Jeffrey and Humphrey. Экспериментальные результаты показали, что контроль условий низкого присоединения_CO2 , фиолетового света и низкой интенсивности света увеличивает как рост клеток, так и концентрацию хлорофиллов a и b в клетках. Реализация этого метода количественного определения хлорофилла позволяет быстро, просто и точно определить содержание хлорофилла, поскольку используемые длины волн находятся на пиках поглощения обоих типов хлорофиллов, что делает этот метод легко воспроизводимым для любых изучаемых микроводорослей.

Введение

В последние годы растущие экологические проблемы, вызванные антропогенной деятельностью, и ее негативное воздействие на здоровье и баланс экосистем привели к поиску более эффективных и экологически чистых производственных систем. Это ускорило процессы в промышленности и способствовало внедрению биомедикационных процедур и разработке биосоединений для смягчения этих вредных последствий¹.

Этот контекст привел к значительному росту изучения микроводорослей, что обусловлено необходимостью поиска инновационных решений текущих экологических и экономических проблем. Микроводоросли процветают в водной среде, используя солнечный свет и углекислый газ в качестве источников энергии и углерода соответственно. Эта характеристика делает их устойчивой и перспективной альтернативой для производства различных ценных продуктов. Исследования в этой области были сосредоточены на понимании физиологии и метаболизма этих клеток, а также на разработке эффективных технологий их культивирования и переработки².

Существует очевидная потребность в разработке доступных и надежных инструментов для изучения микроводорослей для ускорения исследовательских процессов и углубления понимания их физиологии, метаболизма и потенциального применения. Эти инструменты должны позволить проводить оперативный анализ влияния факторов окружающей среды и производства на ключевые параметры, такие как концентрация хлорофилла, которая является фундаментальным показателем здоровья и развития этих организмов. Снижение содержания хлорофилла может указывать на экологический стресс, дефицит питательных веществ или заболевания.

Эти зеленые пигменты играют решающую роль в фотосинтезе, улавливая энергию солнечного света для преобразования углекислого газа и воды в глюкозу и кислород и составляют от 0,5% до 5% биомассы микроводорослей^. Помимо своей важной роли в поддержании жизненных процессов, хлорофиллы нашли применение в различных отраслях промышленности. Экстракты хлорофилла используются в пищевой промышленности и производстве напитков в качестве натуральных красителей, придавая продуктам яркие зеленые оттенки, а также обладая антиоксидантными свойствами. Кроме того, добавки на основе хлорофилла набирают популярность в секторе здоровья и хорошего самочувствия из-за их предполагаемого детоксикационного и противовоспалительного действия. Используя многогранные свойства хлорофилла, промышленность может разрабатывать инновационные продукты, способствующие как визуальной привлекательности, так и благополучию потребителей^.

В связи с этим одной из микроводорослей, имеющих большое биотехнологическое значение, является C. sorokiniana. Этот микроорганизм отличается быстрыми темпами роста, что делает его очень эффективным в производстве биомассы. Кроме того, C. sorokiniana отличается разнообразным содержанием высокопитательных соединений, включая белки, липиды и витамины, что делает его ценным для различных применений в продуктах питания, кормах^{и производстве} биотоплива. Кроме того, было обнаружено, что этот вид микроводорослей продуцирует внеклеточные ферменты с различными функциями, открывая возможности для биотехнологических применений, таких как очистка сточных вод, биоремедиация и фармацевтика⁴. В дополнение к быстрому росту и универсальному применению, C. sorokiniana также демонстрирует значительный потенциал для производства хлорофилла. Являясь фотосинтезирующим микроорганизмом, C. sorokiniana обладает механизмами, необходимыми для синтеза хлорофилла, который составляет от 0,5% до 5% биомассы микроводорослей3^. Эта способность делает C. sorokiniana привлекательным кандидатом для производства хлорофилла в промышленных масштабах и обещает стать устойчивым решением насущных экологических и пищевых^{проблем5}.

С другой стороны, еще одним видом микроводорослей, представляющим значительный интерес, является H. pluvialis. Эта микроводоросль известна своим производством астаксантина, мощного антиоксидантного пигмента с многочисленными промышленными применениями. Астаксантин служит защитным механизмом для фотосистемы H. pluvialis , защищая ее от окислительного стресса, вызванного факторами окружающей среды. Этот пигмент пользуется большим спросом в косметической, нутрицевтической промышленности и аквакультуре благодаря своим антиоксидантным свойствам и потенциальной пользе для здоровья. Обладая обширной способностью продуцировать астаксантин, H. pluvialis представляет собой многообещающее направление для разработки инновационных продуктов, отвечающих различным промышленным и потребительским потребностям⁶.

Недавние исследования также выявили потенциал H. pluvialis¹ для производства хлорофилла, что еще больше повысило его промышленное значение. Например, в исследовании изучалось содержание хлорофилла в H. pluvialis при различных условиях роста и было обнаружено, что при оптимальных параметрах культивирования H. pluvialis демонстрирует замечательные темпы производства хлорофилла, превосходящие показатели других видов микроводорослей⁷. Это открытие подчеркивает потенциал H. pluvialis в качестве устойчивого источника хлорофилла, предлагая новые возможности для его использования в различных отраслях промышленности.

протокол

1. Приготовление питательных сред и посевного материала

1. Приготовьте 1 л питательной среды 3N-BBM+ V(CCAP) (макроэлементы: NaNO₃ [0,75 г ^л-1], CaCl₂ [0,019 г ^л-1], MgSO₄ [0,019 г ^л-1], K₂HPO₄ [0,057 г ^л-1], NaCl [0,025 г ^л-1], KH₂PO₄ [0,175 г ^л-1]; микроэлементы: Na₂ EDTA [0,0186 г ^л-1], FeCl₃ [0,0024 г ^L-1], MnCl₂ [0,001 г ^L-1], ZnCl₂ [1,25 x ^10-4 г ^L-1], CoCl₂ [5 x ^10-5 г ^L-1], Na₂MoO₄ [9,98 x ^10-5 г ^L-1])⁸ и стерилизуют в течение 15 мин при 121 °C и давлении 1,5 фунта на квадратный дюйм.
2. Инокулировать колбу 1 л питательной среды в приблизительной концентрации 3 х 10⁶ клеток ^мл-1 для микроводоросли C. sorokiniana; Или добавьте от 5% до 10% (v/v) инокулюма в питательную среду.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для поддержания стерильных условий рекомендуется использовать капюшон с ламинарным потоком, перчатки, лабораторный халат и маску для лица.
3. Инкубируют инокулированную колбу при источниках красного света с приблизительной интенсивностью от 3 600 до 4 200 лк, при температуре от 22 до 26 °С, с фотопериодом 12 ч в свете и 12 ч в темноте для C. sorokiniana и 16 ч в светлой и 8 ч в темноте для H. pluvialis, и вручную перемешивают каждые 24 ч. Примерно в течение 7 дней для обоих штаммов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выдерживайте в условиях роста не менее 7-10 дней (до получения интенсивного зеленого цвета) для C. sorokiniana и 10-12 дней для H. pluvialis. Для получения концентрата микроводорослей, который будет служить инокулюмом в кинетике, необходимо удалить надосадочную среду из образующихся водорослей.
4. В стерильной среде наполните стерильные конические центрифужные пробирки объемом 15 мл приблизительно 10 мл инокулированной среды и центрифугируйте при давлении 3000 x g в течение 20 минут при температуре 25-30 °C.
5. В стерильных условиях надосадочную жидкость удаляют с помощью микропипетки или путем наливания и концентрирования биомассы в стерильной конической центрифужной пробирке объемом 50 мл.
6. Повторяйте этот процесс по мере необходимости до тех пор, пока не будет получен необходимый для кинетики объем инокулята.
7. Измерьте оптическую плотность (наружный диаметр₅₅₀ нм) инокулюма, чтобы определить клеточную концентрацию микроводорослей и храните его при температуре 3-4 °C до готовности к использованию.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Прямой подсчет клеток первоначально проводился для корреляции концентрации клеток с абсорбцией. После подсчета инокулят можно хранить в холодильнике не более 4 дней.

2. Изучение кинетики роста

1. Приготовьте необходимое количество 3N-BBM+ V(CCAP), подходящее для каждого эксперимента (8 л для испытаний на уровне фотобиореактора для C. sorokiniana и 0,5 л для испытаний на уровне колбы для H. pluvialis) в соответствии со стандартными лабораторными процедурами, обеспечив надлежащую стерилизацию.
2. Как для фотобиореактора, так и для колб настройте источник света на желаемый цветовой спектр (синий на 460 нм, фиолетовый, смесь 460 нм и 630 нм для C. sorokiniana и красный на 630 нм для H. pluvialis); Накройте обе системы, чтобы избежать внешних световых помех.
   Примечание: Из-за изменения длины волны, излучаемой каждым светоизлучающим диодом, спектрорадиометрия была выполнена с использованием спектрорадиометра на источниках света для определения длины волны и мощности излучения каждого диода⁹. Фиолетовый свет был получен путем объединения красных и синих светодиодов, в результате чего длина волны составила 460 нм с мощностью излучения 1,65 Вт ^нм-1 для синих светодиодов и 630 нм с мощностью излучения 0,6 Вт ^нм-1 для красных светодиодов. Эти измерения использовались для испытаний, проводимых исключительно под синим и красным светом.
3. Запрограммируйте таймер на чередование 12-часовых световых и 12-часовых темновых циклов для C. sorokiniana и 16-часовых световых и 8-часовых темных циклов для H. pluvialis.
4. Подключите систему аэрации CO₂ к емкости для культивирования фотобиореактора для обеспечения подачи углекислого газа с интервалом в 12 часов для C. sorokiniana.
5. Инокулируют культуральный сосуд достаточным объемом предварительного инокулята для достижения исходной клеточной плотности 3 х 10⁵ клеток ^мл-1 или ее эквивалента по оптической плотности (наружный диаметр₅₅₀ нм) = 0,180.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обеспечьте асептическую технику во время инокуляции, чтобы предотвратить загрязнение.
6. Образец культуры с регулярными интервалами 12 ч для C. sorokiniana и 8 ч для H. pluvialis для мониторинга роста клеток и физиологических параметров. Соберите образцы с использованием стерильных методов для поддержания целостности культуры.

3. Количественное определение хлорофиллов

ПРИМЕЧАНИЕ: Данные для количественного определения сотовой связи представлены в Дополнительном файле 1.

1. Поместите 40 мл образца в пластиковые конические центрифужные пробирки.
2. Центрифугируйте при давлении 3 000 x g в течение 20 минут при 15 °C и удалите надосадочную жидкость путем декантации или с помощью пастеровской пипетки.
3. Переложите клеточную гранулу в стеклянную трубку, покрытую алюминиевой фольгой и завинчивающейся крышкой, чтобы предотвратить окисление.
4. Суспендируйте клеточную гранулу 3 мл 90% чистого раствора ацетона с помощью вихря.
5. Ультразвуковую обработку взвешенного образца на ледяной бане в течение двух циклов по 5 мин каждый и дать ему отдохнуть при температуре 4 °C в течение 16 ч¹⁰ мин.
6. Через 16 ч снова провести ультразвуковую обработку в тех же условиях, упомянутых на предыдущем этапе (шаг 3.5), и снова центрифугировать в ранее описанных условиях (шаг 3.2).
7. Отделите пигментный экстракт с помощью пастеровской пипетки и переложите его в другую чистую пробирку, защищенную от света.
8. Поместите экстракт пигмента в кварцевую ячейку для считывания в спектрофотометре на длинах волн 630 нм, 647 нм и 664 нм.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Предварительно откалибруйте спектрофотометр с 90% ацетоном.
9. Для расчета концентраций хлорофилла используют следующие уравнения¹¹:
   Хлорофилл А = 11,93 А₆₆₄ - 1,93 А₆₄₇
   Хлорофилл b = 20,36 А₆₄₇ - 5,50 А₆₆₄
   ПРИМЕЧАНИЕ: Результаты выражаются в ^{мкг-мл-1} экстракта, которые умножаются на объем экстракта и делятся на количество мл образца для получения концентраций хлорофилла в ^{мкг-мл-1} культуры.
10. Для получения значений в μg chl ^cell-1 используют следующую формулу:
    μг chl ^{клетка-1} = μг chl в 1 мл культуры / [клетки ^мл-1] концентрация клеток в культуре.

Результаты

Для наблюдения за эффективностью метода обнаружения вариаций концентрации хлорофилла в клетках и оценки влияния факторов роста у C. sorokiniana был разработан экспериментальный дизайн Taguchi L₄ , в котором оценивалось добавление объема_CO2 , цвет света и интенс?...

Обсуждение

Сравнительное исследование между H. pluvialis и C. sorokiniana выявило значимые различия в динамике продукции хлорофилла. В то время как H. pluvialis демонстрировала снижение концентрации хлорофилла на протяжении всего эксперимента, C. sorokiniana показала устойчивое у?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
C3H6O	Meyer	67-64-1	Acetone 90%
15 mL tube	Biologix	10-9502	Test tube
2510-DTH	Branson	D-73595	Sonicator
5 mL screw cap test tube	Kimax	45066-13100	Test tube
50 mL centrifuge tube	Biologix	10-9151	Test tube
Aluminum foil	Reynolds	611 standard, 12" x 1000 feet	Test tube cover
CaCl2	Meyer	0925-250	Calcium Chloride
Centrifuge	Dynamica	14 R	Centrifuge Refrigerated
CoCl2	Merck	1057-100	Cobalt dichloride
FeCl3	Merck	157740	Iron(III) Chloride
K2HPO4	Meyer	2051-250	Dipotassium Phosphate
KH2PO4	Meyer	2055-250	Monopotassium Phosphate
MgSO4	Meyer	1605-250	Magnesium Sulphate
Micropipette	LabNet	Model Beta-Pette	Micropipette
MnCl2	Merck	429449	Manganese(II) Chloride
Na2 EDTA	Merck	200-449-4	Edatamil, Edetato Disodium Salt Dihydrate
Na2MoO4	Merck	243655	Sodium Molybdate
NaCl	Meyer	2365-500	Sodium Chloride
NaNO3	Meyer	2465-250	Sodium Nitrate
RGB LED stripe	Steren	GAD-LED2	Light source
Spectrophotometer	PerkinElmer	Model Lambda35	Spectrophotometer
spectroradiometer	Gigahertz-Optik	model BTS256
Vortex	Scientific Industries	Vortex-Genie® 2	Vortex
ZnCl2	Merck	208086	Zinc Chloride