Получение встроенной в агаровую бусину Mycobacterium abscessus для инокуляции иммунокомпетентных мышей внутритрахеально

Резюме

Мыши, как правило, устойчивы к инфекциям, вызываемым Mycobacterium abscessus, что усложняет открытие и разработку столь необходимых антибиотиков против легочных инфекций. Здесь мы описываем метод приготовления посевного материала и внутритрахеальной инфекции, который, как было показано, обеспечивает устойчивую инфекцию у иммунокомпетентных мышей.

Аннотация

Крайне необходимы надежные мышиные модели хронической инфекции Mycobacterium abscessus, патогеном из окружающей среды, который преимущественно инфицирует легкие. Многокомпонентная терапия в течение всего года обеспечивает неприемлемо низкие показатели излечения у пациентов, около 50%, что обуславливает потребность в прогностических доклинических инструментах для разработки более эффективных антибиотиков. Тем не менее, иммунокомпетентные мыши, как правило, устойчивы к легочной инфекции, вызванной M. abscessus. В литературе сообщалось о многочисленных попытках установления устойчивой инфекции M. abscessus у иммунокомпетентных мышей. Среди них наиболее перспективными оказались методы, основанные на бактериях, встроенных в шарики агара, инокулированные мышам C57BL/6 внутритрахеальным путем. Основным ограничением этого подхода является техническая проблема, связанная с получением агаровых шариков воспроизводимого размера и количества бактерий с последующим внутритрахеальным посевом. В этой статье мы сначала подробно опишем оптимизированный протокол, который доставляет нагруженные M. абсцессом шарики агара оптимального диаметра и воспроизводимой бактериальной нагрузки. Далее мы предоставляем подробный протокол внутритрахеального посева, оптимизированный для предотвращения потерь гранул и бактерий из-за прилипания к поверхностям инокуляционных устройств и для достижения воспроизводимого легочного отложения M. abscessus, встроенного в агар. Цель состоит в том, чтобы обеспечить простоту внедрения и превосходную воспроизводимость от лаборатории к лаборатории.

Введение

Варианты лечения легочной болезни Mycobacterium abscessus (Mab) ограничены и включают в себя годичные схемы приема нескольких препаратов с пероральными, парентеральными и иногда ингаляционными антибиотиками, большинство из которых не обладают оптимальной бактерицидной активностью и связаны со значительной токсичностью 1,2,3,4,5 . Срочно необходимы более короткие, безопасные и эффективные методы лечения. Мышиные модели микобактериальных инфекций сыграли важную роль в открытии и оптимизации эффективных лекарств и схем приема лекарств ^6,7. Тем не менее, доклиническая оценка антибиотиков против инфекций Mab оказалась сложной задачей из-за трудности установления прогрессирующих и устойчивых легочных инфекций у мышей ^8,9.

Инфицирование иммунокомпетентных линий мышей Mab в значительной степени приводит к транзиторной колонизации с последующим быстрым клиренсом возбудителя^10,11. Для достижения хронической инфекции, наблюдаемой клинически, иммобилизующие агенты, такие как агароза или агар, были использованы для стимулирования персистенции и иммунопатологического ответа на условно-патогенные микроорганизмы, такие как Pseudomonas aeruginosa или Haemophilus influenza у иммунокомпетентных мышей 12,13,14. Эта модель была недавно адаптирована для достижения хронической респираторной инфекции с помощью Mab ATCC 19977 на иммунокомпетентных мышах C57BL/6N 15,16,17,18. Метод индуцировал персистирующую инфекцию в течение 45 дней после интратрахеальной инокуляции ~1 × 10⁴ до 1 ×^{10 6} колониеобразующими единицами (КОЕ), с частотой хронической инфекции среди инфицированных мышей 90%-^100%19 и образованием организованных гранулем вокруг распадающегося шарика агара¹⁸. По-видимому, встраивание Mab в бусины защищает от быстрого выведения врожденной иммунной системой и что бусины, наполненные бактериями, представляют собой очаги для вербовки иммунных клеток, что приводит к образованию гранулем и возникновению хронической^{инфекции.} Шарики агара/агарозы представляют собой относительно инертный биоматериал, который вызывает минимальные воспалительные реакции. Кроме того, шарики медленно распадаются, что позволяет избежать проблем с аллергическими реакциями на инородные тела или индуцированным фиброзом. Внутритрахеальная инфекция с использованием или без использования устройства для микрораспыления обеспечивает эффективное введение инокулюма в легкие ^8,20,21 и воспроизводит клинический контакт и инфекцию лучше, чем внутривенная или интраназальная инокуляция.

Таким образом, модель имеет множество преимуществ. Тем не менее, это также сопряжено с некоторыми проблемами технического характера, а именно: (i) достижение воспроизводимого размера гранул, (ii) получение воспроизводимой бактериальной нагрузки в гранулах и (iii) обеспечение постоянной внутритрахеальной доставки инокулюма. Здесь мы предоставляем подробные протоколы для надежного достижения этих целей и обеспечения воспроизводимости от лаборатории к лаборатории.

протокол

Все исследования на животных проводились в соответствии с Руководством по уходу за лабораторными животными и их использованию Национальных институтов здравоохранения с одобрения Комитета по институциональному уходу за животными и их использованию NIAID (NIH), Бетесда, штат Мэриленд. Все процедуры были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию в учреждениях. Все исследования с участием M. abscessus проводились в лаборатории с уровнем локализации биобезопасности 2.

1. Приготовление агаровой бусины, внедренной M. abscessus inoculum

1. Получить предварительную культуру M. abscessus ATCC 19977 путем инокуляции 1,5 мл культуры оптической плотности (OD₆₀₀) 1 (с использованием спектрофотометра) в 200 мл среды Middlebrook 7H9 с добавлением 0,05% (v/v) Tween 80, 0,5% (v/v) глицерина и 10% (v/v) обогащения альбумин-декстрозой-каталазой (ADC) Миддлбрука.
2. Инкубируйте культуры в роликовой бутылке при температуре 37 °C в течение 24 ч до достижения средней фазы логарифма (наружный диаметр₆₀₀ = 0,4-0,6).
3. Суспензируйте 1,2 г соевого бульона Tryptic (TSB) в 40 мл ультрачистой воды и добавьте 0,6 г агара Difco до конечной концентрации 1,5%.
4. Перелейте 60 мл тяжелого минерального масла в колбу Эрленмейера объемом 500 мл и стерилизуйте минеральное масло и триптический соевый агар (TSA) при 121 °C в течение 15 минут, затем уравновесьте при 50 °C в духовке.
5. Возьмите образец 1 мл культуры и измерьте наружный диаметр₆₀₀.
6. Соберите клетки центрифугированием при 3700 г в течение 15 мин при 4 °C. Ресуспендируйте клетки в 4 мл 1x фосфатно-солевого буфера Дульбекко (DPBS) для достижения наружного диаметра₆₀₀ , равного примерно 30.
7. Смешайте 3 мл бактериальной суспензии с 27 мл расплавленного TSA, предварительно уравновешенного при 50 °C, в центрифужной пробирке объемом 50 мл. Быстро перемешайте с помощью вортекса или пипетирования.
8. Осторожно влейте бактериально-агаровую смесь (30 мл) в 60 мл минерального масла и поместите колбу во вторичную емкость. Быстро установите смесь на среднюю скорость (420 об/мин) на магнитной мешалке, установленной на 50 °C, с помощью магнитной мешалки. Следите за тем, чтобы в масляно-агаровой смеси образовался видимый вихрь. Перемешивайте в течение 6 минут при комнатной температуре (RT).
9. Охладите смесь, положив лед во вторичную емкость, и продолжайте помешивать в течение 35 минут.
10. Прекратите помешивание и дайте агаровой суспензии отдохнуть в течение 20 минут (при необходимости пополняйте лед).
11. Перелейте смесь суспензии в две центрифужные пробирки объемом 50 мл и промойте 10 раз одним объемом DPBS для удаления масла и свободных бактерий (3700 г, 6 мин, 4 °C, в течение первых 5 циклов).
    1. Соедините суспензии шариков агара в одну трубочку на третьей промывке. Во время первых 5 циклов стирки используйте серологическую пипетку, чтобы аккуратно суспендировать бусины.
    2. Для последующих 5 циклов стирки используйте следующие параметры центрифугирования: 2000 г в течение 5 минут, затем 1000 г в течение 4, 3, 2 и 2 минут соответственно.
12. Суспендируйте шарики агара в DPBS до конечного объема 40 мл, переложите в стерильный флакон объемом 125 мл и разбавьте в 4 раза, добавив 120 мл DPBS.
13. Пропустите суспензию через сетчатое фильтр 200 мкм.
    1. Прикрепите ситечко к стерильной центрифужной пробирке объемом 50 мл. Затем добавьте образец материала на ситечко и отфильтруйте суспензию шариков.
    2. Чтобы облегчить процесс фильтрации, объедините сетчатое фильтр для клеток, воронку, соединительное кольцо и пробирку объемом 50 мл в одно устройство. Соберите детали в порядке воронки, клеточного фильтра, соединительного кольца и трубки объемом 50 мл и медленно потяните за поршень шприца объемом 30 мл, прикрепленного к соединительному кольцу.
14. При необходимости промойте ситечко с противоположной стороны с помощью DPBS, чтобы смыть остатки более крупных шариков. Разбавленную суспензию сконцентрировать, вращая при 1000 г в течение 2 минут или давая шарикам осесть под действием силы тяжести. После сбора урожая бусины из агара хранить при температуре 4 °C до 1 недели. Для каждой партии экспериментов рекомендуется свежая подготовка.
15. Пипеткой нанесите 5 л суспензии шарика на предметное стекло, накройте его защитным стеколом и сделайте снимки в нескольких случайных положениях с помощью светового или флуоресцентного микроскопа с объективом 10×. Сохраните изображения и измерьте диаметр валика с помощью ImageJ (желаемый диапазон размеров: 200 ± 50 мкм).

2. Титрование агаровых шариков, внедренных M. abscessus inoculum

1. Добавьте 1 мл суспензии шариков в М-пробирку и асептически гомогенизируйте для высвобождения бактерий, встроенных в гранулы, с помощью диссоциатора, установленного на заранее заданную программу RNA.02.01.
2. Возьмите 100 мкл гомогената и последовательно разбавьте от 1:10 до 1 × ^10-5 разведения. Разбавления на агаре 7H10 с добавлением 10% олеиновой кислоты-альбумин-декстрозы-каталазы (OADC) и 2% глицерина. Перечислите КОЕ через 3-5 дней инкубации.
3. При необходимости отрегулируйте титр инокулюма. Например, если каждая мышь получает 100 мкл суспензии в гранулах, содержащей 1 ×^{10 5} КОЕ, на 10 мышей, всего готовят 2 мл суспензии, содержащей 1 ×^{10 6} КОЕ/мл, плюс ~25% для учета потерь в шприцах.

3. Тестирование дозирования шариков через шприц и иглу

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги были включены для того, чтобы шарики не прилипли к поверхности шприца или иглы. Было установлено, что важно использовать стеклянный шприц и металлическую подающую иглу 24 Г, чтобы предотвратить потерю бусин из-за прилипания к пластиковым поверхностям.

1. Приготовьте PBST, добавив 1,25 мл стерильного Tween от 80 до 500 мл стерильного PBS.
2. Добавьте 900 мкл PBST в пять М-пробирок для тестирования шариков агара, проходящих через подающую иглу, а также 900 мкл PBST в 2-мл стерильных пробирок для приготовления от -2 до -6 разведений каждого проталкиваемого образца.
3. Смешайте приготовленную ранее бусину с добавлением M. abscessus с помощью пипетки P1000, чтобы убедиться, что все шарики равномерно распределены.
4. Прикрепите к стеклянному шприцу металлическую подающую иглу массой 24 г и аспирируйте агаровую суспензию, следя за тем, чтобы не образовывались пузырьки воздуха.
5. Как только шприц заполнится без пузырьков воздуха, поместите нейлоновые зажимы или пробки на поршень шприца так, чтобы между зажимами не было места. Пробки обеспечивают точное дозирование 50-100 μл. Есть возможность установить до 6 зажимов вдоль плунжера.
6. Выдавите 100 μL шариков («проталкивающих») в пробирки M в соответствующем порядке.
7. После того, как будет собрано 5 проталкиваний, гомогенизируйте шарики с помощью диссоциатора тканей, настроенного на настройку РНК.02.01, адекватного для получения РНК из замороженных органов и который, как было обнаружено, эффективно высвобождает M. abscessus из гранул, не влияя на жизнеспособность клеток.
8. Выполняйте серийное разведение гомогенатов в диапазоне от -1 до -6. Планшеты для разведения на агаровых пластинах 7H11 с добавлением OADC. Посчитайте КОЕ через 5 дней.

4. Внутритрахеальная инокуляция мышей

1. Подготовьте мышей CD-1 в возрасте от 6 до 8 недель.
2. Усыпляйте мышей с помощью системы воздействия изофлурана аэрозолем со скоростью потока 1-5%, как описано ранее¹.
3. Удерживайте мышей с помощью трехмерной (3D) напечатанной наклонной подставки (специально разработанной и изготовленной). Стержень в центре подставки имеет шовную веревку, которая удерживает мышь вертикально за резцы, помещая мышь в брюшное лежачее положение с поднятой головой.
4. Прикрепите металлическую иглу для кормления животных 24 г к стеклянному шприцу, наполненному шариком агара, в который вкраплен M. abscessus. Поместите нейлоновые зажимы или пробки на поршень шприца, чтобы заразить каждую мышь 50 μл инокулюма.
5. После того, как мышь под действием седативных препаратов будет зафиксирована на шве, переместите язык в сторону рта с помощью аппликатора ватной палочки.
6. Визуализируйте заднюю часть рта мыши, чтобы четко определить белую часть в задней части рта и нацелиться на трахею мыши.
7. Наклоните металлическую иглу для зонда вертикально над мышью и вставьте ее в верхнюю часть трахеи. При прохождении через надгортанник может наблюдаться небольшое сопротивление.
8. Вставьте иглу зонда вниз в трахею, снимите нейлоновый зажим или пробку и выдавите 50 мкл агарового шарика, встроенного в M. abscessus.
9. Дайте мышке отдохнуть 5 минут и повторите шаги 4.2-4.8 второй раз. Целью двухэтапной процедуры инокуляции является обеспечение воспроизводимого и глубокого осаждения полного инокулюма в легком.
10. Дайте инфекции прогрессировать в течение 24 часов, после чего мышь усыпляют для перечисления отложений бактерий в легких.

Результаты

Размер и нагрузка борта
Чтобы визуализировать агаровые гранулы и их бактериальную нагрузку, красный флуоресцентный белок mCherry экспрессировали под конститутивным промотором Hsp60 в штамме типа Mab ATCC 19977 и встраивали этот штамм в агаровые гранулы, как описано выше. На рисунке 1А показан диапазон размера валика (масштабная линейка = 200 мкм). На рисунке 1B показана нагрузка на 6 независимых препаратов валика, демонстрируя воспроизводимость описанной процедуры.

Нанесение покрытия на шприц, проталкивание и бактериальная имплантация после внутритрахеального посева
Внутритрахеальная инокуляция была оптимизирована в два этапа. КОЕ/мл подсчитывали в инокулюменте до и после прохождения через стеклянный шприц, чтобы гарантировать отсутствие потерь гранул или бактерий при прохождении шариков через шприц и подключенную трубку. В таблице 1 показан начальный бактериальный титр двух независимых препаратов в гранулах (испытания 1 и 2) и количество извлеченных КОЕ на 100 мл «продавленных» образцов из одной загрузки шприца. Чтобы избежать потерь шариков и бактерий, необходим стеклянный шприц, соединенный с металлической трубкой. Бусины агара имеют тенденцию прилипать к пластиковым поверхностям.

Подсчет КОЕ с течением времени в препарате гранул показал, что бактериальная нагрузка гранул оставалась стабильной на уровне 4 °C в течение 1 недели, с ~2-кратной потерей бактериальной нагрузки за 2 недели и ненарушенным отложением в легких. Затем группы от 5 до 8 мышей были инфицированы тремя независимыми препаратами гранул, чтобы проверить воспроизводимость процедуры внутритрахеальной инокуляции. В таблице 2 показано количество КОЕ в легких на одну мышь, перечисленное через 24 часа после заражения, как описано.

Наконец, межоператорная воспроизводимость инфекции оценивалась путем инфицирования трех групп по 10 мышей CD-1, каждая из которых выполнялась разными операторами. КОЕ в легких, перечисленные через 24 ч после заражения, показаны на рисунке 2.

Рисунок 1: Пилотный эксперимент для оценки размера гранул, визуализации и количественного определения бактериальной нагрузки M. abscessus . (A) Бусины агара, содержащие штамм M. abscessus ATCC 19977, сконструированы для экспрессии флуоресцентного белка mCherry red под конститутивным промотором hsp60. Пять μл суспензии в гранулах наносили на предметное стекло и визуализировали с помощью флуоресцентного микроскопа, оснащенного камерой (объектив 10x). Каждая красная точка представляет собой флуоресцентную бактериальную клетку, заключенную в шарики агара диаметром от ~70-250 мкм. (B) Бактериальная нагрузка в КОЕ/мл 6 отдельных препаратов гранул показывает воспроизводимость метода. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Межоператорная воспроизводимость инфекции. Группы из 10 самок мышей CD-1 интрахеально инфицировались тремя независимыми операторами, как описано, с использованием одного и того же препарата в гранулах. Показаны перечисленные КОЕ в легких через 24 ч после заражения. O1, O2, O3: операторы 1, 2 и 3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

	КОЕ/100 μл
Подготовка швов	Пробное испытание 1	Испытание 2
	1.13Э+05	2.40Э+05
Образец для проталкивания шприца
1	1.14Э+05	5.10Э+05
2	1.36Э+05	4.10Э+05
3	9.30Э+04	3.90Э+05
4	9,80Э+04	3.60Э+05
5	1.14Э+05
Средний	1.11Э+05	4.18Э+05
СД	1.69E+04 (15%)	6.50E+04 (16%)

Таблица 1: Колониеобразующие единицы (КОЕ) на 100 μл-образец после прохождения через стеклянный шприц и металлическую подающую иглу.

Пробное испытание 1		Испытание 2		Пробная версия 3
Идентификатор мыши	КОЕ в легких/мышь	Идентификатор мыши	КОЕ в легких/мышь	Идентификатор мыши	КОЕ в легких/мышь
М-1	6.50Э+03	М-6	2.20Э+05	М-11	6.80Э+04
М-2	1.10Э+04	М-7	2.70Э+05	М-12	1.70Э+05
М-3	1.40Э+04	М-8	8.10Э+04	М-13	2.10Э+05
М-4	3.20Э+03	М-9	1.40Э+05	М-14	4.40Э+04
М-5	4.50Э+03	М-10	1.30Э+05	М-15	7.50Э+04
				М-16	1.01Э+05
				М-17	7.00Э+04
				М-18	5.80Э+03
Средний	7.84Э+03	Средний	1.68Э+05	Средний	9.30Э+04
СД	4.54E+03 (58%)	СД	7.57E+04 (45%)	СД	6.67E+04 (72%)

Таблица 2: Имплантация шарика агара, внедренного M. abscessus , в легкие мыши через 24 часа после инокуляции

Обсуждение

Чтобы обеспечить равномерное распределение бактерий в шариках агара, важно равномерно взвесить расплавленную смесь агара и бактерий перед добавлением ее в масляную фазу. Объемное соотношение масла и агар-бактерий имеет решающее значение для контроля размера гранул. Более высокое соотношение масла к агару приводит к образованию более мелких шариков агара. При смешивании суспензии агар-бактерий с масляной фазой решающее значение имеет контроль температуры. Масляно-агаровая смесь должна быть достаточно теплой, чтобы обеспечить эмульгирование и образование капель, но достаточно холодной, чтобы не навредить бактериям. Непрерывное перемешивание при охлаждении смеси до комнатной температуры или ниже позволяет каплям агара образовываться и затвердевать.

Правильная калибровка перемешивающей пластины, размер мешалки, а также форма и размер колбы являются важными факторами, определяющими равномерность вихря. Перемешивающая планка, расположенная в центре колбы, создает симметричный вихрь, обеспечивая равномерное перемешивание. Смещенная от центра перемешивание полосы может привести к нестабильному вихрю, в результате чего бусины неправильной формы и появятся пузырьки воздуха в бусинах. Рекомендуется мониторинг и регулировка положения перемешивающей планки в режиме реального времени. Объем колбы должен быть пропорционален объему масляно-агаровой смеси. Колба объемом 500 мл идеально подходит для вращения масляно-агаровой смеси объемом 90 мл, создавая видимый вихрь. При использовании колб большего размера важно регулировать объем масляно-агаровой смеси, размер мешалки и скорость вихря, чтобы достичь баланса между эффективным перемешиванием и стабильным вихрем. Поддержание постоянной скорости завихрения во время процесса и при подготовке сварного шва имеет решающее значение для воспроизводимости от партии к партии.

Процесс приготовления агаровых шариков, в частности, скорость вихревого движения и соотношение масла-агара, адаптированы из^16,22 с незначительными изменениями. Поперечные силы внутри вращающегося вихря по своей природе приводят к образованию бусин разных размеров. Чтобы свести к минимуму эту изменчивость размера, стадия сбора бусин была модифицирована путем введения нескольких стадий промывки, используя градиент уменьшающейся скорости центрифугирования и времени для обеспечения удаления мелких гранул (и свободных бактерий). Микросетчатый фильтр был использован для обогащения гранул желаемого размера, эффективно отфильтровывая более крупные гранулы и те, которые могли образоваться в результате случайной коалесценции. Чтобы избежать потерь шариков или бактерий при прохождении суспензии через шприц и подключенную трубку для внутритрахеального инокуляции мыши, крайне важно использовать стеклянный шприц, металлические подающие иглы 24 G и металлическую трубку.

Основным ограничением метода является техническая сложность подготовки шариков и внутритрахеального инокуляции для достижения воспроизводимой нагрузки на шарики и имплантации легких. Требуется внимание к деталям и умение устранять неполадки. Кроме того, модель не была полностью проверена путем тестирования эффективности стандартных антибиотиков и наиболее частых комбинаций антибиотиков, назначаемых пациентам с Маб.

В настоящее время ни одна мышиная модель хронической инфекции Mab не была валидирована до такой степени, чтобы эффективность отдельных агентов и комбинаций лекарств у пациентов можно было обоснованно предсказать с помощью модели⁹. Мышиная система C57BL/6, встроенная в агаровые шарики, была использована для проверки эффективности антимикробной терапии 15,19,23. Ближайшей альтернативой мышиной системе C57BL/6 со встроенными в бусины агарами является мышиная модель C3HeB/FeJ, которая полагается на иммуносупрессию дексаметазона для достижения длительной хронической инфекции^24,25. Преимущества описанного здесь протокола заключаются в том, что (i) можно использовать полностью иммунокомпетентных и наиболее доступных мышей C57BL/6, (ii) продуктивная и хроническая инфекция может быть получена с помощью хорошо охарактеризованного типового штамма ATCC 19977, и (iii) отсутствует потребность в химически индуцированной иммуносупрессии, что позволяет избежать необходимости ежедневных инъекций дексаметазона, тем самым избегая потенциальных лекарственных взаимодействий и влияния на иммунопатологию легких.

Учитывая отсутствие валидированных мышиных моделей хронической инфекции Mab для оценки новых кандидатов в лекарства и схем приема лекарств ^8,9, описанный здесь метод может продвинуть эту область вперед, повысить прогностическую ценность данных о доклинической эффективности, помочь определить приоритеты схем лечения с наибольшим потенциалом для обеспечения долгосрочного лечения и в целом ускорить открытие и разработку лекарств для лечения болезни легких Mab. Метод может быть применен к другим патогенам легких и имеет установленный послужной список для P. aeruginosa или Haemophilus influenza. Основная цель описанного здесь протокола заключается в предоставлении достаточных подробностей и рекомендаций для обеспечения простоты реализации и превосходной воспроизводимости от лаборатории к лаборатории.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
125-mL bottle	Corning	8388	Sterile
3 x 3 Tube Holding Rack	Fisher	5972-0030PK	Disinfected prior to use
3D Printed Mouse Stand	Transworld Marketing	custom designed and produced	Disinfected prior to use
48-well dilution Plate	Celltreat	229192	Sterile
50-mL centrifuge tubes	Greiner Bio-One	227261	Sterile
Anesethia Machine	E-Z Systems	EZ-AF9000 SYSTEM	n/a
Avanti J-15R	Beckman Coulter	B99517	Centrifuge
Barrier Pipette Tips in Lift-off Lid Rack 1000G	Thermo Scientific ART	21-236-2A	Sterile
Biohazard bag	Fisherbrand	22-044561
Connector Ring	pluriSelect	41-50000-03
Cotton-Tipped Applicators	Puritan	22-029-571	Sterile
Disposable Inoculation Loops Yellow Sterile 100 in ziplock bag	Cole-Parmer Essentials	03-391-562	Sterile
Disposable Poly-Lined Towel Drape	Dynarex	19-310-671	Sterile
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Thomas Scientific	21-031-CM	Sterile
Funnel	pluriSelect	42-50000	Sterile
GE Ultrospec 10	Sigma-Aldrich	GE80211630	Spectrophotometer
Gentlemacs Tissue Dissociator	Miltenyi Biotec	130-096-427	Not heat activated
Hamilton Syringe	Hamilton	80801	Disinfected prior to use
Heavy Mineral Oil	Sigma-Aldrich	330760-1L	Sterile
Isoflurane solution 250 ml bottle	Covetrus	29405	Skin Corrosion/Irritation: Category 2, Serious Eye Damage/Eye Irritation: Category 2A, Specific target organ systemic toxicity (single exposure): Category 3 May cause drowsiness and dizziness, Causes serious eye irritation, Causes skin irritation. Do not inhale, use in well ventilated area.
M Tubes (gentleMACS)	Miltenyi Biotec	130-096-335	Sterile
Magnetic stirrer MR Hei-Connect	Heidolph	505-40000-13-1
Magnetic stirring bar	Thomas Scientific	1181L08	Sterile
Mechanical Pipet 100–1000 µL	Gilson PIPETMAN L	FA10006M	Disinfected prior to use
Mechanical Pipet 20–200 µL	Gilson PIPETMAN L	FA10003MG	Disinfected prior to use
Metal Animal Feeding Needle 24 G	Braintree Scientific	N-VP 24G-1S	Must be sterilized (autoclaved)
Middlebrook 7H10 Agar	Sigma-Aldrich	M0303-500G	Sterilized (autoclaved)
Middlebrook 7H11 Agar	Thermo Fisher	R4554002	Sterilized (autoclaved)
Middlebrook 7H9 medium	Beckton Dickinson	271310	Sterilized (autoclaved)
Mouse Stand Parts	TriMech Solutions	SRV-AMS-FDM	Disinfected prior to use
Nonabsorbable Silk Suture	Fisher Scientific	18020-50	n/a
OADC Liquid Enrichment for use with Middlebrook Media 500 ml	Thermo Scientific Remel	R450605	Sterile
PBS (10x), pH 7.4 Sterile Filtered 500 mL	Gibco	70-011-044	Sterile
Peroxiguard Wipes	Peroxigard	29221	n/a
Petri Dishes with Clear Lid Round 100mmx 15mm	Fisherbrand	FB0875712	Sterile
PluriStrainer 200 mm	pluriSelect	43-50200-03	Sterile; cell strainer
Roller bottles	Corning	430165	Sterile
Serological pipette	Corning	4489	Sterile
Spectrophotometer cuvettes 1.5 mL	Fisher Scientific	14955127	Sterilized (autoclaved)
Syringe stoppers or clips (nylon)	Trimech	SRV-AMS-MJF	Disinfected prior to use
Tryptic Soy Broth	Sigma-Aldrich	T8907-500G	Sterile
Tween 80	Fisher	170793	Filter sterilized
Wide Bore Filtered Pipette Tips Lift-off Lid Rack 200G	Thermo Scientific ART	21-236-1A	Sterile