Перед началом приготовления: <ul><li> Блуждающие yhird возраста личинок дрозофилы </li><li> HL3.1 (модифицированный гемолимфы-подобных) решение </li><li> Sylgard (прозрачная силиконовая резина) пластин рассечение подготовлен в небольшом (35 х 10 мм) пластиковых чашках Петри используя методы, описанные Брентом и МакКейб (2008) 3. </li><li> Вырезать рассечение контакты короткий </li><li> Стимулирование электрода пипетки </li><li> Sharp пипетки записи </li></ul> HL3 Решение: <ol><li> Во время вскрытия и электрофизиологических экспериментов, личинки погружаются в HL3.1 раствора 2, который содержит (в мм): 70 NaCl, KCl 5, 4 2 MgCl, 10 NaHCO 3, 5 трегалозу, 115 сахарозы и 5 HEPES, рН 7,2. </li><li> Концентрации CaCl 2 добавляются HL3.1 решение для обеспечения требуемой концентрации внеклеточного Са 2 +. <ul><li> Личинки вскрытия проводятся при низких Са 2 + концентрации (во избежание сокращения мышц), используя HL3.1 + 0,25 мМ CaCl 2, держится на льду. </li><li> Электрофизиологические эксперименты, как правило, записываются в HL3.1 + 1 мМ CaCl 2, но это может быть в диапазоне от 0,4 - 1 мМ Ca 2 + по мере необходимости. </li></ul></li><li> HL3.1 решение фильтр стерилизовать перед использованием, и хранили при 4 ˚ C. </li></ol> Подготовка стимулирования и записи пипетки: <ol><li> Запись и стимулирующие пипетки тянут с Саттер P-2000 Лазерная съемник микропипетки, используя следующие параметры: Тепло = 390, накаливания = 4, скорость = 35, Delay = 200 и Вытяните = 0. </li><li> Стимулирующие электроды изготавливаются из тонкостенных капилляров боросиликатного стекла с широкими концами, которые были немного больше, чем ширина разорвала аксонов двигателя. Формы концы firepolished дать гладкой поверхностью (с помощью пипетки Narashiga полировки), чтобы свести к минимуму повреждения нерва. Стимулирующие электроды заполнены с ванной решение (HL3.1 + 1 мМ Ca 2 +). </li><li> Запись электроды изготовлены из боросиликатного стекла 1.2 мм, которая тянется к форме резкого пипетки (30-60 мОм), и наполнены 3M KCl. </li></ol> Часть 1: Препарирование личинки дрозофилы <ol><li> Третьего возраста блуждающих личинки расчлененный подвергать мышцы в стенке тела, как описано выше 4. </li><li> Вскрытия проводятся в HL3.1 + 0,25 мМ Са 2 + на небольшие пластины силиконовые (35 х 10 мм). HL3.1 решение должно быть ледяным для вскрытия в целях анестезировать личинки, и она хранится на льду до и во время вскрытия. </li><li> Личинки расчлененный используя методы, описанные Брентом и МакКейб (2008), то есть изменение для экспериментов электрофизиологии, добавив 0,25 мМ Ca 2 + до HL3.1 рассечение решение, и с помощью коротких контактов рассечение (~ 2 мм в длину), которые являются менее вероятно, ударил микрообъектива и электродов во время эксперимента. </li><li> После вскрытия двигателя аксонов личинки разорваны. Это можно сделать, мягко проведение ЦНС и повышения ее немного, таким образом периферических нервов, иннервирующих мышцы задней до брюшного ганглия могут быть сокращены без ущерба для мышц (рис. 1). Мозг затем удаляются. </li><li> Расчлененный личиночной препарата дважды промывают HL3.1 + 1 мМ Ca 2 +. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1109/fig1.png" alt="Рисунок 1" /> Рисунок 1. Схематическое изображение этапов резки двигателя аксонов расчлененный личинок. ЦНС снимается пинцетом и двигателя аксоны Срез у основания головного мозга. Часть 2: Внутриклеточные записи из личиночных клеток. <ol><li> Место вскрытия пластину на микроскоп электрофизиологии и погрузиться приготовительный с HL3.1 + 1,5 мМ Са 2 + и исправить ванны электродом так она находится в контакте с раствором. </li><li> Все эксперименты проводятся на мышечную 6 в третий сегмент брюшка (A3). Периферических нервов, иннервирующих мышцы стимулируются использованием всасывающего электрода 5. </li><li> Позиция стимулирующего электрода в первые блюда, чтобы избежать вибрации, когда внутриклеточный электрод на место. Место стимулирующих электродов в непосредственной близости от мотонейрона, иннервирующих мышцы 6 и применять нежные всасывания до сократить нерв находится внутри стеклянной пипетки. Будьте осторожны, чтобы не растягивать нервы, когда всасывающий применяется. Поднимите пипеткой немного, так что не касается мышц и положение его, чтобы он не тянет на разрезе нервных волокон (рис. 2). <img src="/files/ftp_upload/1109/fig2.png" alt="Рисунок 2" width="600" height="296" /> Рисунок 2. Схема мускулатуры и иннервирующих моторных нейронов одного сегмента брюшка от личинки дрозофилы. Положение стимулирует пипетки и разорвал нервов и записи электрода в позиции на мышцы 6, показано на рисунке. </li><li> Intraсотовые запись производится с острыми микроэлектродов заполнены 3 М KCl. Позиция записи электрода над центром мышц 6 на третий сегмент брюшка (A3) и отрегулировать входной информации таким образом это читает нулю для ванны решение. Медленно опустите электрод и подход мышц под высоким оптическим увеличением до касания поверхности мышц. Часы осциллограф для подтверждения того, что мышца была проникли. Мембранный потенциал покоя должна быть не менее -60 мВ, или животное не должно использоваться. Спорадические миниатюрных потенциалов концевой пластинки теперь должна быть доступна. Оставьте ячейки стабилизироваться в течение одной минуты, прежде чем начать запись. </li><li> Изменения мембранного потенциала регистрировались Axon HS-2А стадии голову и Axoclamp усилителя 2B и записывался с CLAMPEX V 8.2.0.235 (Axon Instruments). 2B Axoclamp сопряжено с компьютером, который работает pCLAMP программного обеспечения и работает совместно с интерфейсом DIGIDATA 1322A. </li><li> Клетки были записаны в течение 3 минут без каких-либо стимулов для измерения mEJP ответов. Следы были проанализированы с помощью мини программного обеспечения для анализа (Synaptosoft, V 6.0.3) и mEJP амплитудой и частотой, определяемой. </li></ol> Нервные стимуляция: <ol><li> Разорвала конце двигательных нейронов стимулируется ряд прямоугольных импульсов напряжения (0,3 мс) на интенсивность, достаточную для аксонов двигателя, чтобы вызвать последовательных мер в целом мышцы. </li><li> Стимулом формируется с мастер-8 генератор импульсов, который запрограммирован для доставки импульсы непрерывно в зависимости от продолжительности и интервала времени. </li><li> Разрешить пять секунд между стимулами для восстановления синаптической на NMJ. </li><li> При определении силы раздражителя, начните с самого низкого уровня и повысить интенсивность медленно, в течение нескольких судебных разбирательств. Минимальная интенсивность стимула, который приводит к вызвала реакция должна быть использована в экспериментах. </li><li> При соответствующей интенсивности стимула будет достигнута, должен быть один EJP соединения и один мышечных сокращений вызвана стимул. </li><li> Запись по крайней мере 10 вызванных потенциалов от каждой мышцы и средней амплитудой. </li></ol> Часть 3: Представитель Результаты <img src="/files/ftp_upload/1109/fig3.png" alt="Рисунок 3" width="600" height="358" /> Рисунок 3. Представителю внутриклеточной регистрации из мышечной 6 показывает вызвала EJP является ответ на электрическую стимуляцию сегментарные нервы, и спорадические миниатюрных потенциалов концевой пластинки, или mEJP в. EJP амплитуд в мышцах 6 здорового дикого типа личинок, такие, как Кантона S, как правило, около 40 мВ и mEJP амплитуды между 1-3 мВ.

<ol>
	<li>Atwood, H. L., Govind, C. K., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+ultrastructure+of+synaptic+terminals+on+ventral+longitudinal+abdominal+muscles+in+Drosophila+larvae.">Differential ultrastructure of synaptic terminals on ventral longitudinal abdominal muscles in Drosophila larvae.</a> J. Neurobiol. 24 (8), 1008-1024 (1993).</li><li>Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+minimal+hemolymph-like+solution,+HL3.1,+for+physiological+recordings+at+the+neuromuscular+junctions+of+normal+and+mutant+Drosophila+larvae.">A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae.</a> J Neurogenet. 18 (2), 377-402 (2004).</li><li>Estes, P. S., Roos, J., van der Bliek, A., Kelly, R. B., Krishnan, K. S., Ramaswami, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traffic+of+dynamin+within+individual+Drosophila+synaptic+boutons+relative+to+compartment-specific+markers.">Traffic of dynamin within individual Drosophila synaptic boutons relative to compartment-specific markers.</a> J Neurosci. 16, 5443-5456 (1996).</li><li>Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+dissection+of+Drosophila+larvae.">Protocol for dissection of Drosophila larvae.</a> J Vis Exp. , (2008).</li><li>Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+the+larval+neuromuscular+junction+in+Drosophila+melanogaster.">Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila melanogaster.</a> J Physiol (Lond). 262, 189-214 (1976).</li><li>Katz, L. C., Shatz, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+activity+and+the+construction+of+cortical+circuits.">Synaptic activity and the construction of cortical circuits.</a> Science. 274, 1133-1138 (1996).</li></ol>

Методы, описанные здесь, обеспечивают относительно быстрый и широкий путь для обнаружения изменений в синаптической функции в NMJ. Способность выполнять электрофизиологические записи на основе интактных животных в естественных условиях, а также выполнять генетические или фармаколог?...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Small Petri dishes (35 x 10 mm)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton Dickinson</td>
<td>1008</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SYLGARD 182 Silicone Elastomer Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dow Corning Corporation</td>
<td>3097366-1004</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissecting microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Carl Zeiss</td>
<td>475002-9902</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Light for microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Schott</td>
<td>KLI500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissection pins</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>26002-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>pClamp 9 software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Axon CNS, Molecular Devices</td>
<td>PCLAMP 9 STANDARD</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissection scissors: 3mm Vannas Spring Scissors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>15000-0</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dumont SS Forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11200-33</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dumont #5 Forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11252-20</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Thin-walled borosilicate glass capillaries, with filament (1.0 mm, 4 in)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments, Inc.</td>
<td>TW100F-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Borosilicate glass capillaries, with filament (1.2 mm, 4 in)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments, Inc.</td>
<td>1B120F-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sutter P-2000 Laser Based Micropipette Puller </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instruments</td>
<td>Model P-2000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pipette polisher</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Narishiga</td>
<td>MF-83</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Axon HS-2A head stage</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Axon CNS, Molecular Devices</td>
<td>Model HS-2A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micromanipulators</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instruments</td>
<td>MP-85</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Axoclamp 2B amplifier</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Axon CNS, Molecular Devices</td>
<td>AXOCLAMP 2B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Clampex Software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Axon CNS, Molecular Devices</td>
<td>v 8.2.0.235</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mini analysis software. v 6.0.3</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Synaptosoft</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Brownlee Precision Amplifier</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Brownlee</td>
<td>Model 410</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NaCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Baker</td>
<td>4058-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>KCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>p-9333 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NaHCO3</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>s6297-1kg</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trelahose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>TO167</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sucrose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>bp220-212 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HEPES</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>h-3375</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MgCl-6H2O</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>m2670-1kg </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CaCl2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>c79-500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Master-8 Pulse Generator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>A.M.P.I</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vibration table for electrophysiology set up</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Technical manufacturing corporation</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Faraday Cage</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

electrophysiological methods for recording synaptic potentials from the nmj of drosophila larvae

В этом видео мы описываем электрофизиологические методы регистрации синаптической передачи в нервно-мышечном соединении (NMJ) личинки дрозофилы. Личиночная система нервно-мышечной является модель синапсов для изучения физиологии и синаптической нейротрансмиссии, и является ценным инструментом исследований, которые определил генетики и доступна для экспериментальных манипуляций. Личинки можно разрезать, чтобы разоблачить стенки тела мускулатуре, центральной нервной системы, и периферических нервов. Мышцах дрозофилы и их иннервации картина хорошо охарактеризованы и мышцы легко доступны для внутриклеточной регистрации. Индивидуальные мышц можно определить по их расположения и ориентации в 8 брюшных сегментов, каждый из 30 мышц, расположенных в шаблон, который повторяется в сегментах A2 - A7. Расчлененный дрозофилы личинки тонкие и отдельных мышц и связок двигателя аксонов нейронов могут быть визуализированы на просвечивание<sup&gt; 1</sup&gt;. Трансгенные конструкции могут использоваться для маркировки клеток-мишеней для визуальной идентификации или в целях манипулирования генных продуктов в определенных тканях. У личинок, возбуждающих потенциалов перехода (EJPs) генерируются в ответ на везикулярного выброс глутамата из мотонейронов в синапсах. В расчлененный личинки, EJP могут быть записаны в мышцы с внутриклеточным электродом. Потенциалы действия может быть искусственно вызывали у моторных нейронов, которые были сокращены задней до брюшного ганглия, втягивается в стеклянной пипетки, осторожно всасывания и стимулировали электрода. Эти моторные нейроны имеют разные пороги стрельбы при стимуляции, и, когда они стреляют одновременно, они генерируют ответ в мышцах. Сигналы передаются по NMJ синапса может быть записано в мышцах, что моторные нейроны иннервирующие. EJPs и миниатюрные возбуждающих потенциалов перехода (mEJPs) рассматриваются как изменения мембранного потенциала. Электрофизиологические ответы записываются при комнатной температуре в модифицированной минимально гемолимфы подобные решения<sup&gt; 2</sup&gt; (HL3), который содержит 5 мМ Mg<sup&gt; 2 +</sup&gt; И 1,5 мМ Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt;. Изменения в амплитуду вызванных EJPs может указывать на различия в синаптической функции и структура. Оцифрованные записи анализируются на EJP амплитуды, mEJP частоты и амплитуды, и квантовой содержания.

Watch this Scientific Journal Video about Electrophysiological Methods for Recording Synaptic Potentials from the NMJ of Drosophila Larvae at JoVE.com

Electrophysiological Methods for Recording Synaptic Potentials from the NMJ of Drosophila Larvae

Здесь мы опишем электрофизиологические методы измерения синаптической передачи в нервно-мышечном соединении личинки дрозофилы. Вызванные релиз инициируется искусственно стимулируя двигательных нейронов аксоны, и передачу по NMJ можно измерить с помощью постсинаптического ответа вызвало в мышцах.

Электрофизиологические методы регистрации синаптические потенциалы от NMJ личинок дрозофилы

In this video, we describe the electrophysiological methods for recording synaptic transmission at the neuromuscular junction (NMJ) of Drosophila larva. ...

electrophysiological-methods-for-recording-synaptic-potentials-from

Research

JoVE Journal

Biology

20.9K Views.  Columbia University College of Physicians and Surgeons. Здесь мы опишем электрофизиологические методы измерения синаптической передачи в нервно-мышечном соединении личинки дрозофилы. Вызванные релиз инициируется искусственно стимулируя двигательных нейронов аксоны, и передачу по NMJ можно измерить с помощью по?...

Video: Electrophysiological Methods for Recording Synaptic Potentials from the NMJ of Drosophila Larvae

Dissection of Imaginal Discs from 3rd Instar Drosophila Larvae

This protocol demonstrates the dissection technique used for isolating imaginal discs from drosophila larvae at the 3rd instar stage. Methods for fixing the tissue after saying and removing the wing, leg, and eye discs are demonstrated directly on a microscope slide for subsequent visualization.

Препарирование имагинальных дисков с 3-го личинки дрозофилы Инстар

Methods for Patch Clamp Capacitance Recordings from the Calyx

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal. Electrical recordings from the presynaptic terminal allow the measurement of action potentials, calcium channel currents, vesicle fusion (exocytosis) and subsequent membrane uptake (endocytosis). The fusion of vesicles containing neurotransmitter causes the vesicle membrane to be added to the cell membrane of the calyx. This increase in the amount of cell membrane is measured as an increase in capacitance. The subsequent reduction in capacitance indicates endocytosis, the process of membrane uptake or removal from the calyx membrane. Endocytosis, is necessary to maintain the structure of the calyx and it is also necessary to form vesicles that will be filled with neurotransmitter for future exocytosis events. Capacitance recordings at the calyx of Held have made it possible to directly and rapidly measure vesicular release and subsequent endocytosis in a mammalian CNS nerve terminal. In addition, the corresponding postsynaptic activity can be simultaneously measured by using paired recordings. Thus a complete picture of the presynaptic and postsynaptic electrical activity at a central nervous system synapse is achievable using this preparation. Here, the methods for slice preparation, morphological features for identification of calyces of Held, basic patch clamping techniques, and examples of capacitance recordings to measure exocytosis and endocytosis are presented.

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal.

Методы Patch Clamp Емкость записи из Чашечка

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal. ...

High-resolution Measurement of Odor-Driven Behavior in Drosophila Larvae

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral paradigm, the experimenter usually assumes that the rapid diffusion of odorant molecules from the source leads to the creation of a stable gradient in the dish. To establish a quantitative correlation between sensory inputs and behavioral responses, it is necessary to achieve a more thorough characterization of the odorant stimulus conditions. In this video article, we describe a new method allowing the construction of odorant gradients with stable and controllable geometries. We briefly illustrate how these gradients can be used to screen for olfactory defects (full and partial anosmia) and to study more subtle features of chemotaxis behavior.

In this video article, we describe a new method allowing the construction of odorant gradients with stable and controllable geometries. We briefly illustrate how these gradients can be used to screen for olfactory defects (full and partial anosmia) and to study more subtle features of chemotaxis behavior.

Высокое разрешение Измерение Запах-Driven Поведение в личинки дрозофилы

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral ...

Drosophila Larval NMJ Dissection

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use of the Drosophila motor system is due to its high accessibility. It can be analyzed with single-cell resolution. There are 30 muscles per hemisegment whose arrangement within the peripheral body wall are known. A total of 35 motor neurons attach to these muscles in a pattern that has high fidelity. Using molecular biology and genetics, one can create transgenic animals or mutants. Then, one can study the developmental consequences on the morphology and function of the NMJ. In order to access the NMJ for study, it is necessary to carefully dissect each larva. In this article we demonstrate how to properly dissect Drosophila larvae for study of the NMJ by removing all internal organs while leaving the body wall intact. This technique is suitable to prepare larvae for imaging, immunohistochemistry, or electrophysiology.

This protocol demonstrates how to dissect Drosophila larvae in preparation for immunohistochemistry and/or imaging of the neuromuscular junction.

Дрозофилы личинок NMJ Dissection

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use ...

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use of the Drosophila motor system is due to its high accessibility. It can be analyzed with single-cell resolution. There are 30 muscles per hemisegment whose arrangement within the peripheral body wall are known. A total of 31 motor neurons attach to these muscles in a pattern that has high fidelity. Using molecular biology and genetics, one can create transgenic animals or mutants. Then, one can study the developmental consequences on the morphology and function of the NMJ. Immunohistochemistry can be used to clearly image the components of the NMJ. In this article, we demonstrate how to use antibody staining to visualize the Drosophila larval NMJ.

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

This protocol demonstrates how to perform immunohistochemistry on dissected Drosophila larva.

Дрозофилы личинок NMJ Immunohistochemistry

Channelrhodopsin2 Mediated Stimulation of Synaptic Potentials at Drosophila Neuromuscular Junctions

The Drosophila larval neuromuscular preparation has proven to be a useful tool for studying synaptic physiology1,2,3. Currently, the only means available to evoke excitatory junctional potentials (EJPs) in this preparation involves the use of suction electrodes. In both research and teaching labs, students often have difficulty maneuvering and manipulating this type of stimulating electrode. In the present work, we show how to remotely stimulate synaptic potentials at the larval NMJ without the use of suction electrodes. By expressing channelrhodopsin2 (ChR2) 4,5,6 in Drosophila motor neurons using the GAL4-UAS system 7, and making minor changes to a basic electrophysiology rig, we were able to reliably evoke EJPs with pulses of blue light. This technique could be of particular use in neurophysiology teaching labs where student rig practice time and resources are limited.

Channelrhodopsin2 Mediated Stimulation of Synaptic Potentials at Drosophila Neuromuscular Junctions

This procedure uses a blue light-activated algal channel and cell-specific genetic expression tools to evoke synaptic potentials with light pulses at the neuromuscular junction (NMJ) in Drosophila larvae. This technique is an inexpensive and easy-to-use alternative to suction electrode stimulation for synaptic physiology studies in research and teaching laboratories.

Channelrhodopsin2 опосредованная стимуляция синаптические потенциалы в Drosophila Нервно-мышечная переходов

The Drosophila larval neuromuscular preparation has proven to be a useful tool for studying synaptic physiology1,2,3. Currently, the only means available ...

Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite isolated from each other, with largely independent histories and scientific communities. However, the interface between these usually disparate fields is the developmental programs underlying acquisition of functional electrical signaling properties and differentiation of functional chemical synapses during the final phases of neural circuit formation. This interface is a critically important area for investigation. In Drosophila, these phases of functional development occur during a period of &lt;8 hours (at 25&deg;C) during the last third of embryogenesis. This late developmental period was long considered intractable to investigation owing to the deposition of a tough, impermeable epidermal cuticle. A breakthrough advance was the application of water-polymerizing surgical glue that can be locally applied to the cuticle to enable controlled dissection of late-stage embryos. With a dorsal longitudinal incision, the embryo can be laid flat, exposing the ventral nerve cord and body wall musculature to experimental investigation. This system has been heavily used to isolate and characterize genetic mutants that impair embryonic synapse formation, and thus reveal the molecular mechanisms governing the specification and differentiation of synapse connections and functional synaptic signaling properties.

Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures

This technique exposes the Drosophila embryonic neuromusculature for immunohistochemistry or electrophysiological recording. It is useful for studying early events in neuromuscular development or performing electrophysiology in mutants that cannot hatch.

Сбор и подготовка Drosophila Эмбрионы для Электрофизиологические Запись и другие процедуры

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite ...

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite isolated from each other, with largely independent histories and scientific communities. However, the interface between these usually disparate fields is the developmental programs underlying acquisition of functional electrical signaling properties and differentiation of functional chemical synapses during the final phases of neural circuit formation. This interface is a critically important area for investigation. In Drosophila, these phases of functional development occur during a period of &lt;8 hours (at 25&deg;C) during the last third of embryogenesis. This late developmental period was long considered intractable to investigation owing to the deposition of a tough, impermeable epidermal cuticle. A breakthrough advance was the application of water-polymerizing surgical glue that can be locally applied to the cuticle to enable controlled dissection of late-stage embryos. With a dorsal longitudinal incision, the embryo can be laid flat, exposing the ventral nerve cord and body wall musculature to experimental investigation. Whole-cell patch-clamp techniques can then be employed to record from individually-identifiable neurons and somatic muscles. These recording configurations have been used to track the appearance and maturation of ionic currents and action potential propagation in both neurons and muscles. Genetic mutants affecting these electrical properties have been characterized to reveal the molecular composition of ion channels and associated signaling complexes, and to begin exploration of the molecular mechanisms of functional differentiation. A particular focus has been the assembly of synaptic connections, both in the central nervous system and periphery. The glutamatergic neuromuscular junction (NMJ) is most accessible to a combination of optical imaging and electrophysiological recording. A glass suction electrode is used to stimulate the peripheral nerve, with excitatory junction current (EJC) recordings made in the voltage-clamped muscle. This recording configuration has been used to chart the functional differentiation of the synapse, and track the appearance and maturation of presynaptic glutamate release properties. In addition, postsynaptic properties can be assayed independently via iontophoretic or pressure application of glutamate directly to the muscle surface, to measure the appearance and maturation of the glutamate receptor fields. Thus, both pre- and postsynaptic elements can be monitored separately or in combination during embryonic synaptogenesis. This system has been heavily used to isolate and characterize genetic mutants that impair embryonic synapse formation, and thus reveal the molecular mechanisms governing the specification and differentiation of synapse connections and functional synaptic signaling properties.

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Electrophysiological recordings from Drosophila embryos allow analyses of developing muscle and neuron electrical properties, as well as characterization of functional synaptogenesis at the glutamatergic neuromuscular junction and central cholinergic and GABAergic synapses.

Электрофизиологические Запись в Drosophila Эмбрионов

Historical View and Physiology Demonstration at the NMJ of the Crayfish Opener Muscle

Here we present some of the key important discoveries made with the opener neuromuscular (NMJ) preparation of crustaceans and illustrate that there is still much to learn from this model preparation. In understanding the history one can appreciate why even today this NMJ still offers a rich playground to address questions regarding pre- and post-synaptic function and plasticity. The viability and ease of access to the terminal for intracellular as well as extracellular electrophysiology and imaging are significant advantages. The mechanisms behind the modulation of vesicular kinetics and fusion within the high- and low-output terminals are begging for investigation. The preparation also offers a testable model system for computational assessments and manipulations to examine key variables in theoretical models of synaptic function, for example calcium dynamics during short-term facilitation. The synaptic complexity of active zone and statistical nature of quantal release is also an open area for future investigation both experimentally and computationally.

The opener muscle of the crayfish leg is presented for its historical importance and experimental versatility in muscle phenotype, synaptic physiology and plasticity.

Исторические Просмотр и физиологии Демонстрация на NMJ из мышц открывалка раков

Here we present some of the key important discoveries made with the opener neuromuscular (NMJ) preparation of crustaceans and illustrate that there is ...

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal lines have enabled biological processes to be studied in the context of a living, and in some instances even behaving, organism. In this protocol we will describe how to anesthetize intact Drosophila larvae, using the volatile anesthetic desflurane, to follow the development and plasticity of synaptic populations at sub-cellular resolution1-3. While other useful methods to anesthetize Drosophila melanogaster larvae have been previously described4,5,6,7,8, the protocol presented herein demonstrates significant improvements due to the following combined key features: (1) A very high degree of anesthetization; even the heart beat is arrested allowing for lateral resolution of up to 150 nm1, (2) a high survival rate of &gt; 90% per anesthetization cycle, permitting the recording of more than five time-points over a period of hours to days2 and (3) a high sensitivity enabling us in 2 instances to study the dynamics of proteins expressed at physiological levels. In detail, we were able to visualize the postsynaptic glutamate receptor subunit GluR-IIA expressed via the endogenous promoter1 in stable transgenic lines and the exon trap line FasII-GFP1. (4) In contrast to other methods4,7 the larvae can be imaged not only alive, but also intact (i.e. non-dissected) allowing observation to occur over a number of days1. The accompanying video details the function of individual parts of the in vivo imaging chamber2,3, the correct mounting of the larvae, the anesthetization procedure, how to re-identify specific positions within a larva and the safe removal of the larvae from the imaging chamber.

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

This protocol describes a reliable method for anesthetization and imaging of intact Drosophila melanogaster larvae. We have utilized the volatile anesthetic desflurane to allow for repetitive imaging at sub-cellular resolution and re-identification of structures for up to a few days1.

В естественных изображений интактного личинки дрозофилы на субклеточном Резолюцию

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal ...