Prima di iniziare la preparazione: <ul><li> Vagando yhird instar Drosophila larve </li><li> HL3.1 (Modificata emolinfa-like) soluzione </li><li> Sylgard (gomma siliconica trasparente) dissezione piatti preparati in piccolo (35 x 10 mm) scatole Petri in plastica usando i metodi descritti da Brent e McCabe (2008) 3. </li><li> Tagliare perni dissezione breve </li><li> Stimolare pipette elettrodo </li><li> Pipette di registrazione Sharp </li></ul> HL3 Soluzione: <ol><li> Durante dissezioni ed esperimenti elettrofisiologici, larva sono immersi in HL3.1 soluzione 2 che contiene (in mm): 70 NaCl, 5 KCl, 4 MgCl 2, 10 NaHCO 3, 5 trealosio, 115 saccarosio, e 5 HEPES, pH 7,2. </li><li> Le concentrazioni di CaCl 2 si aggiungono alla soluzione HL3.1 di fornire la necessaria concentrazione extracellulare di Ca 2 +. <ul><li> Dissezioni larvali vengono eseguiti a basse concentrazioni di Ca 2 + (per evitare la contrazione muscolare) utilizzando HL3.1 + 0,25 mM CaCl 2, tenuta in ghiaccio. </li><li> Esperimenti elettrofisiologici sono in genere registrati in HL3.1 + 1 mM CaCl 2, ma questa può essere regolata 0,4-1 mM Ca 2 + come richiesto. </li></ul></li><li> La soluzione è HL3.1 filtro sterilizzati prima dell&#39;uso, e conservati a 4 ˚ C. </li></ol> Preparazione di stimolare e pipette di registrazione: <ol><li> Pipette di registrazione e stimolanti sono tirati con un P-2000 Sutter estrattore basato Laser micropipetta utilizzando le seguenti impostazioni: calore = 390, Filament = 4, Velocità = 35, Delay = 200 e Pull = 0. </li><li> Elettrodi stimolanti sono preparati con pareti sottili capillari in vetro borosilicato con estremità ampia che erano leggermente più grande della larghezza della assoni motori reciso. Le estremità sono a forma di firepolished per dare una finitura liscia (utilizzando una pipetta Narashiga lucidatore), per minimizzare i danni al nervo. Elettrodi stimolanti sono riempite con soluzione bagno (HL3.1 + 1 mM Ca 2 +). </li><li> Gli elettrodi di registrazione sono preparati da 1,2 millimetri di vetro borosilicato, che viene prelevata per formare una pipetta acuto (30-60 mΩ), e riempito di KCl 3M. </li></ol> Parte 1: dissezione di larve di Drosophila <ol><li> Terzo larve instar erranti sono sezionato per mostrare i muscoli nella parete del corpo come descritto in precedenza 4. </li><li> Dissezioni sono eseguite in HL3.1 + 0,25 mM Ca 2 + su lastre di silicone piccolo (35 x 10 mm). HL3.1 soluzione deve essere ghiacciata per dissezioni al fine di anestetizzare la larva, e viene mantenuto in ghiaccio prima e durante la dissezione. </li><li> Le larve sono sezionati utilizzando i metodi descritti da Brent e McCabe (2008), che viene modificato per gli esperimenti di elettrofisiologia con l&#39;aggiunta di 0,25 mm Ca 2 + alla soluzione HL3.1 dissezione, e con perni dissezione breve (circa 2 mm di lunghezza) che sono meno probabilità di colpire l&#39;obiettivo microscopio e gli elettrodi durante un esperimento. </li><li> A seguito di dissezione, gli assoni motori delle larve sono interrotti. Questo viene fatto delicatamente tenendo il sistema nervoso centrale e alzando leggermente in modo da i nervi periferici che innervano i muscoli posteriori del ganglio ventrale può essere tagliata senza danneggiare i muscoli (Figura 1). Il cervello viene quindi rimosso. </li><li> La preparazione larvale sezionato viene lavato due volte con HL3.1 + 1 mM Ca 2 +. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1109/fig1.png" alt="Figura 1" /> Figura 1. Schematica che mostra i passaggi necessari per il taglio del assoni motori di larve sezionato. La CNS è sollevato con una pinza e gli assoni motori sono tagliati alla base del cervello. Parte 2: le registrazioni intracellulari da cellule muscolari larvale. <ol><li> Posizionare la piastra di dissezione sul microscopio elettrofisiologia e sommergere la preparazione con HL3.1 + 1,5 mM Ca 2 + e fissare l&#39;elettrodo in modo da bagno è in contatto con la soluzione. </li><li> Tutti gli esperimenti vengono eseguiti su muscoli 6 anni entro il terzo segmento addominale (A3). Nervi periferici che innervano i muscoli sono stimolati utilizzando un elettrodo di aspirazione 5. </li><li> Posizionare l&#39;elettrodo stimolante il primo piatto per evitare vibrazioni quando l&#39;elettrodo intracellulare è a posto. Posizionare l&#39;elettrodo stimolante in prossimità del neurone motore innervano muscoli 6 e applicare delicata aspirazione fino a quando il nervo taglio è all&#39;interno della pipetta di vetro. Fare attenzione a non allungare i nervi quando l&#39;aspirazione viene applicata. Sollevare la pipetta leggermente in modo che non tocchi il muscolo e posizionarla in modo che non è tirando le fibre nervose taglio (Figura 2). <img src="/files/ftp_upload/1109/fig2.png" alt="Figura 2" width="600" height="296" /> Figura 2. Uno schema della muscolatura e motoneuroni innervano di un segmento addominale dalla larva di Drosophila. La posizione della pipetta stimolante e reciso i nervi e l&#39;elettrodo di registrazione in posizione muscolare 6 sono illustrati. </li><li> Intraregistrazioni cellulari sono realizzate con i microelettrodi affilato pieno di 3 M KCl. Posizionare l&#39;elettrodo di registrazione sopra il centro del muscolo 6 sul terzo segmento addominale (A3) e regolare l&#39;ingresso di offset in modo che legga zero per la soluzione del bagno. Abbassare lentamente l&#39;elettrodo e l&#39;approccio al muscolo sotto alto ingrandimento ottico fino a toccare la superficie del muscolo. Guarda l&#39;oscilloscopio per confermare che il muscolo è stato penetrato. Il potenziale di membrana a riposo deve essere di almeno -60 mV, o l&#39;animale non deve essere utilizzato. Sporadici potenzialità placca in miniatura dovrebbe essere visibile. Lasciare la cella di stabilizzare per un minuto prima di iniziare a registrare. </li><li> Variazioni del potenziale di membrana vengono rilevati con un HS-2A stadio testa Axon e un amplificatore 2B Axoclamp e registrato con CLAMPEX v 8.2.0.235 (Axon Instruments). La 2B Axoclamp è interfacciato con un computer che esegue software pCLAMP e lavora in congiunzione con l&#39;interfaccia Digidata 1322A. </li><li> Le cellule sono state registrate per 3 minuti senza nessuno stimolo a misurare le risposte mEJP. Le tracce sono state analizzate utilizzando un software di analisi Mini (Synaptosoft, v 6.0.3) e l&#39;ampiezza e la frequenza mEJP determinato. </li></ol> La stimolazione del nervo: <ol><li> La fine reciso del neurone motore viene stimolato con una serie di impulsi di tensione quadrati (0,3 ms di durata) con un&#39;intensità che è sufficiente per entrambe le assoni motori, per evocare risposte coerenti in tutto il muscolo. </li><li> Lo stimolo viene generato con il Maestro-8 generatore di impulsi, che è programmato per fornire impulsi continuamente a seconda della durata e tempi di intervallo. </li><li> Lasciate cinque secondi tra gli stimoli per il recupero sinaptico al NMJ. </li><li> Nel determinare l&#39;intensità dello stimolo, iniziare con il più basso livello e aumentare l&#39;intensità lentamente diverse prove. L&#39;intensità dello stimolo minimo che si traduce in una risposta evocata deve essere utilizzato negli esperimenti. </li><li> Quando l&#39;intensità dello stimolo appropriato è raggiunto, ci dovrebbe essere una EJP composto e una contrazione muscolare evocata dallo stimolo. </li><li> Record di almeno 10 potenziali evocati da ogni muscolo e media le ampiezze. </li></ol> Parte 3: Risultati Rappresentante <img src="/files/ftp_upload/1109/fig3.png" alt="figura 3" width="600" height="358" /> Figura 3. Rappresentante registrazione intracellulare dal muscolo 6 mostra la evocato EJP è risposta alla stimolazione elettrica del nervo segmentale, e le potenzialità sporadici placca in miniatura, o di mEJP. Ampiezze EJP nel muscolo 6 di sano wild-type larve, come il Canton S, sono in genere circa 40 mV e le ampiezze mEJP tra 1-3 mV.

<ol>
	<li>Atwood, H. L., Govind, C. K., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+ultrastructure+of+synaptic+terminals+on+ventral+longitudinal+abdominal+muscles+in+Drosophila+larvae.">Differential ultrastructure of synaptic terminals on ventral longitudinal abdominal muscles in Drosophila larvae.</a> J. Neurobiol. 24 (8), 1008-1024 (1993).</li><li>Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+minimal+hemolymph-like+solution,+HL3.1,+for+physiological+recordings+at+the+neuromuscular+junctions+of+normal+and+mutant+Drosophila+larvae.">A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae.</a> J Neurogenet. 18 (2), 377-402 (2004).</li><li>Estes, P. S., Roos, J., van der Bliek, A., Kelly, R. B., Krishnan, K. S., Ramaswami, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traffic+of+dynamin+within+individual+Drosophila+synaptic+boutons+relative+to+compartment-specific+markers.">Traffic of dynamin within individual Drosophila synaptic boutons relative to compartment-specific markers.</a> J Neurosci. 16, 5443-5456 (1996).</li><li>Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+dissection+of+Drosophila+larvae.">Protocol for dissection of Drosophila larvae.</a> J Vis Exp. , (2008).</li><li>Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+the+larval+neuromuscular+junction+in+Drosophila+melanogaster.">Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila melanogaster.</a> J Physiol (Lond). 262, 189-214 (1976).</li><li>Katz, L. C., Shatz, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+activity+and+the+construction+of+cortical+circuits.">Synaptic activity and the construction of cortical circuits.</a> Science. 274, 1133-1138 (1996).</li></ol>

I metodi descritti qui forniscono un modo relativamente rapido e ampio per rilevare i cambiamenti nella funzione sinaptica alla NMJ. La possibilità di effettuare registrazioni elettrofisiologiche su animali intatti in vivo, ed eseguire manipolazioni genetiche o farmacologiche, fanno Drosophila un modello animale ideale per indagare gli aspetti fisiologici e genetici della neurotrasmissione. Dato che le cellule muscolari sono molto grandi, qualcuno potrebbe preferire di aggiungere un ulterio...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Small Petri dishes (35 x 10 mm)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton Dickinson</td>
<td>1008</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SYLGARD 182 Silicone Elastomer Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dow Corning Corporation</td>
<td>3097366-1004</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissecting microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Carl Zeiss</td>
<td>475002-9902</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Light for microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Schott</td>
<td>KLI500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissection pins</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>26002-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>pClamp 9 software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Axon CNS, Molecular Devices</td>
<td>PCLAMP 9 STANDARD</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissection scissors: 3mm Vannas Spring Scissors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>15000-0</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dumont SS Forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11200-33</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dumont #5 Forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11252-20</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Thin-walled borosilicate glass capillaries, with filament (1.0 mm, 4 in)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments, Inc.</td>
<td>TW100F-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Borosilicate glass capillaries, with filament (1.2 mm, 4 in)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments, Inc.</td>
<td>1B120F-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sutter P-2000 Laser Based Micropipette Puller </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instruments</td>
<td>Model P-2000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pipette polisher</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Narishiga</td>
<td>MF-83</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Axon HS-2A head stage</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Axon CNS, Molecular Devices</td>
<td>Model HS-2A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micromanipulators</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instruments</td>
<td>MP-85</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Axoclamp 2B amplifier</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Axon CNS, Molecular Devices</td>
<td>AXOCLAMP 2B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Clampex Software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Axon CNS, Molecular Devices</td>
<td>v 8.2.0.235</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mini analysis software. v 6.0.3</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Synaptosoft</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Brownlee Precision Amplifier</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Brownlee</td>
<td>Model 410</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NaCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Baker</td>
<td>4058-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>KCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>p-9333 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NaHCO3</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>s6297-1kg</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trelahose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>TO167</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sucrose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>bp220-212 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HEPES</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>h-3375</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MgCl-6H2O</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>m2670-1kg </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CaCl2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>c79-500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Master-8 Pulse Generator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>A.M.P.I</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vibration table for electrophysiology set up</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Technical manufacturing corporation</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Faraday Cage</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

electrophysiological methods for recording synaptic potentials from the nmj of drosophila larvae

In questo video, si descrivono i metodi elettrofisiologici per la registrazione, la trasmissione sinaptica a livello della giunzione neuromuscolare (NMJ) larva di Drosophila. Il sistema larvale neuromuscolare è una sinapsi modello per lo studio della fisiologia e la neurotrasmissione sinaptica, ed è un valido strumento di ricerca che ha definito la genetica ed è accessibile alla manipolazione sperimentale. Larve possono essere sezionato per mostrare il corpo muro muscolatura, sistema nervoso centrale, e dei nervi periferici. I muscoli di Drosophila e il loro modello di innervazione sono ben caratterizzati e muscoli sono di facile accesso per la registrazione intracellulare. Singoli muscoli possono essere identificati dalla loro posizione e l&#39;orientamento all&#39;interno degli 8 segmenti addominali, ciascuno con 30 muscoli disposti in uno schema che si ripete in segmenti A2 - A7. Sezionato larve drosofila sono i muscoli sottili e individuali e fasci di assoni dei neuroni motori possono essere visualizzati con transilluminazione<sup&gt; 1</sup&gt;. Costrutti transgenici possono essere usati per etichettare le cellule bersaglio per l&#39;identificazione visiva o per la manipolazione di prodotti genici in tessuti specifici. In larve, i potenziali di giunzione eccitatori (EJPs) sono generati in risposta a rilascio vescicolare di glutammato da motoneuroni alla sinapsi. In larve sezionato, il EJP può essere registrato nel muscolo con un elettrodo intracellulare. Potenziali d&#39;azione può essere artificialmente evocati in neuroni motori che sono stati tagliati posteriore al ganglio ventrale, coinvolto in una pipetta di vetro di aspirazione delicata e stimolato con un elettrodo. Questi neuroni motori sono distinte soglie di cottura, quando stimolato, e quando il fuoco simultaneamente, essi generano una risposta nel muscolo. Segnali trasmessi attraverso la sinapsi NMJ possono essere registrati nei muscoli che il motore neuroni innervano. Il EJPs e miniatura potenzialità giunzione eccitatori (mEJPs) sono visti come i cambiamenti del potenziale di membrana. Risposte elettrofisiologiche sono registrati a temperatura ambiente in modificata minimo emolinfa-come soluzione<sup&gt; 2</sup&gt; (HL3) che contiene 5 mg mM<sup&gt; 2 +</sup&gt; E 1,5 mm ca<sup&gt; 2 +</sup&gt;. Le variazioni di ampiezza di EJPs evocato può indicare le differenze in funzione sinaptica e la struttura. Registrazioni digitalizzate vengono analizzati per EJP ampiezza, frequenza e ampiezza mEJP e contenuti quantico.

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Electrophysiological Methods for Recording Synaptic Potentials from the NMJ of Drosophila Larvae

Qui si descrivono i metodi elettrofisiologici per la misurazione della trasmissione sinaptica a livello della giunzione neuromuscolare larva di Drosophila. Rilascio evocato è iniziata artificialmente stimolando gli assoni dei motoneuroni, e la trasmissione attraverso il NMJ può essere misurata la risposta postsinaptica evocata nel muscolo.

Metodi elettrofisiologici per la registrazione Potenziali Synaptic dal NMJ Larve di Drosophila

In this video, we describe the electrophysiological methods for recording synaptic transmission at the neuromuscular junction (NMJ) of Drosophila larva. ...

electrophysiological-methods-for-recording-synaptic-potentials-from

Research

JoVE Journal

Biology

20.8K Views.  Columbia University College of Physicians and Surgeons. Qui si descrivono i metodi elettrofisiologici per la misurazione della trasmissione sinaptica a livello della giunzione neuromuscolare larva di Drosophila. Rilascio evocato è iniziata artificialmente stimolando gli assoni dei motoneuroni, e la trasmissione attraverso il NMJ può essere misurata la risposta postsinaptica evocata nel muscolo.