Vor Beginn der Vorbereitung: <ul><li> Wandering yhird instar Drosophila-Larven </li><li> HL3.1 (Modified Hämolymphe-like)-Lösung </li><li> Sylgard (transparent Silikon-Kautschuk) Dissektion Platten in kleine (35 x 10 mm) Kunststoff-Petrischalen mit Methoden von Brent und McCabe (2008) 3 beschriebenen Verfahren hergestellt. </li><li> Cut Dissektion Stifte kurz </li><li> Stimulationselektrode Pipetten </li><li> Sharp Aufnahme Pipetten </li></ul> HL3 Lösung: <ol><li> 70 NaCl, 5 KCl, 4 MgCl 2, 10 NaHCO 3, 5 Trehalose, 115 Saccharose und 5 HEPES, pH 7,2: Während Dissektionen und elektrophysiologischen Experimenten werden Larve in HL3.1 Lösung 2, die (in mM) enthält, eingetaucht. </li><li> Die Konzentrationen von CaCl 2 sind die HL3.1 Lösung für die erforderliche Konzentration von extrazellulärem Ca 2 + zu addieren. <ul><li> Larven Dissektionen sind bei niedrigen Ca 2 +-Konzentrationen (die Muskelkontraktion zu vermeiden) mit HL3.1 + 0,25 mM CaCl 2, auf Eis gehalten durchgeführt. </li><li> Elektrophysiologische Experimente sind in der Regel in HL3.1 aufgezeichnet + 1 mM CaCl 2, aber das kann von 0,4 eingestellt werden - 1 mM Ca 2 + als erforderlich. </li></ul></li><li> Die Lösung ist HL3.1 Filter vor dem Gebrauch sterilisiert und bei 4 ˚ C. </li></ol> Vorbereitung der anregenden und Aufnahme Pipetten: <ol><li> Heat = 390, Filament = 4, Velocity = 35, Delay = 200 und Pull = 0:. Recording und anregende Pipetten sind mit einem Sutter P-2000 Laser basiert Mikropipette Abzieher mit den folgenden Einstellungen gezogen </li><li> Stimulationselektroden sind aus dünnwandigen Kapillaren aus Borosilikatglas mit breiten Enden, die etwas größer als die Breite der abgetrennten Motor Axone wurden vorbereitet. Die geformten Enden firepolished zu einer glatten Oberfläche (mit einer Pipette Narashiga Polierer), um Schäden an den Nerven zu minimieren geben. Stimulationselektroden sind ausgestattet mit Bad-Lösung (HL3.1 + 1 mM Ca 2 +) gefüllt. </li><li> Die Aufnahme Elektroden sind aus 1,2 mm Borosilikatglas, das gezogen wird, um eine scharfe Pipette (30-60 mW) zu bilden, und mit 3M KCl vorbereitet. </li></ol> Teil 1: Präparation des Drosophila-Larven <ol><li> Drittens instar wandernde Larven werden seziert, um die Muskeln im Körper Wand freizulegen, wie beschrieben bisher 4. </li><li> Dissektionen sind in HL3.1 durchgeführt + 0,25 mM Ca 2 + auf kleinen Silikon-Platten (35 x 10 mm). HL3.1 Lösung muss eiskalten für Dissektionen werden, um die Larve zu betäuben, und ist auf dem Eis vor und während der Sektionen gehalten. </li><li> Die Larven werden seziert mit Methoden von Brent und McCabe (2008), dass für die Elektrophysiologie Experimenten durch Zugabe von 0,25 mM Ca 2 + auf die HL3.1 Dissektion Lösung, und mit kurzen Dissektion Pins (~ 2 mm in der Länge), die weniger verändert wird beschrieben wahrscheinlich das Mikroskop-Objektiv und Elektroden während eines Experiments getroffen. </li><li> Nach Dissektion, sind der Motor Axone der Larven durchtrennt. Dies wird durch leichtes Halten des ZNS und erhöhen sie leicht, so dass die peripheren Nerven, die die Muskeln hinter dem Bauchganglion innervieren, ohne die Muskeln (Abbildung 1) geschnitten werden kann getan. Das Gehirn wird dann entfernt. </li><li> Die seziert Larven Vorbereitung wird zweimal mit HL3.1 gewaschen + 1 mM Ca 2 +. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1109/fig1.png" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Schematische Darstellung der Schritte bei der Reduzierung der Motor Axone seziert Larven beteiligt. Das ZNS ist mit einer Pinzette angehoben und der Motor Axone sind an der Basis des Gehirns geschnitten. Teil 2: Intrazelluläre Aufnahme von Larven Muskelzellen. <ol><li> Legen Sie die Dissektion Platte auf der Elektrophysiologie Mikroskop und tauchen prep mit HL3.1 + 1,5 mM Ca 2 + und fixieren Badelektrode so dass es in Kontakt mit der Lösung ist. </li><li> Alle Experimente sind auf Muskel-6 innerhalb der dritten Abdominalsegment (A3) durchgeführt. Periphere Nerven, die die Muskeln innervieren angeregt mit einem Saug-Elektrode 5. </li><li> Position der stimulierenden Elektrode in die Schüssel ersten Erschütterungen zu vermeiden, wenn die intrazelluläre Elektrode vorhanden ist. Setzen Sie den stimulierenden Elektrode in unmittelbarer Nähe des motorischen Neurons innervieren einen Muskel 6 und gelten sanfte Saugwirkung, bis der Schnitt Nerv im Inneren der Glaspipette. Achten Sie darauf, nicht auf die Nerven dehnen, wenn Saug angewendet wird. Heben Sie die Pipette etwas so ist es nicht berühren, die Muskel-und positionieren Sie es, damit es nicht zieht sich auf den Schnitt Nervenfasern (Abb. 2). <img src="/files/ftp_upload/1109/fig2.png" alt="Abbildung 2" width="600" height="296" /> Abbildung 2. Eine schematische Darstellung der Muskulatur und innervieren Motoneuronen eines Abdominalsegment aus der Drosophila Larve. Die Position des anregenden Pipette und durchtrennten Nerven und die Aufnahme Elektrode in Position Muskel 6 sind dargestellt. </li><li> Intrazellulären Aufnahmen sind mit scharfen Mikroelektroden mit 3 M KCl gefüllt. Position der Aufnahme-Elektrode oberhalb des Zentrums von Muskel-6 auf dem dritten Abdominalsegment (A3) und stellen Sie die Eingangs-Offset so dass es Null für die Badlösung liest. Langsam senken die Elektrode und Ansatz des Muskels unter hohem optischen Vergrößerung, bis er den Muskel Oberfläche berührt. Sehen Sie sich das Oszilloskop, um zu bestätigen, dass der Muskel wurde durchbrochen. Das Ruhemembranpotential sollte mindestens -60 mV, oder das Tier sollte nicht verwendet werden. Sporadische Miniatur Endplatte Potenziale sollten jetzt sichtbar sein. Lassen Sie die Zelle für eine Minute, bevor die Aufnahme zu stabilisieren. </li><li> Änderungen in Membranpotential sind mit einem Axon HS-2A Kopf Bühne und ein Axoclamp 2B Verstärker erfasst und aufgezeichnet mit CLAMPEX v 8.2.0.235 (Axon Instruments). Die Axoclamp 2B ist eine Schnittstelle mit einem Computer, pCLAMP Software und arbeitet in Verbindung mit dem Digidata 1322a-Schnittstelle läuft. </li><li> Die Zellen wurden für 3 Minuten ohne Stimuli zu mEJP Reaktionen messen aufgezeichnet. Die Spuren wurden mit Mini-Analyse-Software (Synaptosoft, v 6.0.3) und die mEJP Amplitude und Frequenz bestimmt. </li></ol> Nerve Stimulation: <ol><li> Der abgetrennte Ende des motorischen Neurons ist mit einer Reihe von quadratischen Spannungsimpulse (0,3 ms Dauer) mit einer Intensität, die ausreicht, sowohl Motor Axone, um konsistente Antworten in der gesamten Muskulatur hervorrufen wird angeregt. </li><li> Der Reiz wird mit dem Master-8 Impulsgeber, die so programmiert werden, Impulse kontinuierlich liefern je nach Dauer und Intervall-Zeiten generiert. </li><li> Lassen Sie fünf Sekunden zwischen Stimuli für die synaptische Erholung an der NMJ. </li><li> Bei der Bestimmung der Stärke des Reizes, mit der untersten Ebene beginnen und die Intensität langsam über mehrere Studien. Die minimale Reizstärke, die in einem evozierte Ergebnisse sollten in Experimenten verwendet werden. </li><li> Wenn die entsprechende Reizintensität erreicht ist, sollte es eine Verbindung EJP und eine Muskelkontraktion durch den Reiz hervorgerufen werden. </li><li> Rekord mindestens 10 evozierte Potentiale aus jeder Muskel und der Mittelwert der Amplituden. </li></ol> Teil 3: Repräsentative Ergebnisse <img src="/files/ftp_upload/1109/fig3.png" alt="Abbildung 3" width="600" height="358" /> Abbildung 3. Representative intrazelluläre Aufnahme von Muskel-6, welche die evozierten EJP das ist Reaktion auf elektrische Stimulation der segmentalen Nerven, und die sporadischen Miniatur-Endplatten Potentialen oder mEJP ist. EJP Amplituden im Muskel 6 von gesunden Wildtyp-Larven, wie Canton S, sind in der Regel um 40 mV und die mEJP Amplituden zwischen 1-3 mV.

<ol>
	<li>Atwood, H. L., Govind, C. K., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+ultrastructure+of+synaptic+terminals+on+ventral+longitudinal+abdominal+muscles+in+Drosophila+larvae.">Differential ultrastructure of synaptic terminals on ventral longitudinal abdominal muscles in Drosophila larvae.</a> J. Neurobiol. 24 (8), 1008-1024 (1993).</li><li>Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+minimal+hemolymph-like+solution,+HL3.1,+for+physiological+recordings+at+the+neuromuscular+junctions+of+normal+and+mutant+Drosophila+larvae.">A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae.</a> J Neurogenet. 18 (2), 377-402 (2004).</li><li>Estes, P. S., Roos, J., van der Bliek, A., Kelly, R. B., Krishnan, K. S., Ramaswami, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traffic+of+dynamin+within+individual+Drosophila+synaptic+boutons+relative+to+compartment-specific+markers.">Traffic of dynamin within individual Drosophila synaptic boutons relative to compartment-specific markers.</a> J Neurosci. 16, 5443-5456 (1996).</li><li>Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+dissection+of+Drosophila+larvae.">Protocol for dissection of Drosophila larvae.</a> J Vis Exp. , (2008).</li><li>Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+the+larval+neuromuscular+junction+in+Drosophila+melanogaster.">Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila melanogaster.</a> J Physiol (Lond). 262, 189-214 (1976).</li><li>Katz, L. C., Shatz, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+activity+and+the+construction+of+cortical+circuits.">Synaptic activity and the construction of cortical circuits.</a> Science. 274, 1133-1138 (1996).</li></ol>

Die hier beschriebenen Methoden eine relativ schnelle und breite Weg, um Veränderungen der synaptischen Funktion an der NMJ erkennen. Die Fähigkeit zur elektrophysiologischen Ableitungen mit intakten Tieren in vivo durchzuführen, und führen genetische oder pharmakologische Manipulationen machen Drosophila ein ideales Tiermodell zur Untersuchung der physiologischen und genetischen Aspekte der Neurotransmission. Da Muskelzellen sehr groß sind, könnten einige es vorziehen, einen weiteren ...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Small Petri dishes (35 x 10 mm)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton Dickinson</td>
<td>1008</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SYLGARD 182 Silicone Elastomer Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dow Corning Corporation</td>
<td>3097366-1004</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissecting microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Carl Zeiss</td>
<td>475002-9902</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Light for microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Schott</td>
<td>KLI500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissection pins</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>26002-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>pClamp 9 software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Axon CNS, Molecular Devices</td>
<td>PCLAMP 9 STANDARD</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissection scissors: 3mm Vannas Spring Scissors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>15000-0</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dumont SS Forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11200-33</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dumont #5 Forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11252-20</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Thin-walled borosilicate glass capillaries, with filament (1.0 mm, 4 in)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments, Inc.</td>
<td>TW100F-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Borosilicate glass capillaries, with filament (1.2 mm, 4 in)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments, Inc.</td>
<td>1B120F-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sutter P-2000 Laser Based Micropipette Puller </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instruments</td>
<td>Model P-2000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pipette polisher</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Narishiga</td>
<td>MF-83</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Axon HS-2A head stage</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Axon CNS, Molecular Devices</td>
<td>Model HS-2A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micromanipulators</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instruments</td>
<td>MP-85</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Axoclamp 2B amplifier</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Axon CNS, Molecular Devices</td>
<td>AXOCLAMP 2B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Clampex Software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Axon CNS, Molecular Devices</td>
<td>v 8.2.0.235</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mini analysis software. v 6.0.3</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Synaptosoft</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Brownlee Precision Amplifier</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Brownlee</td>
<td>Model 410</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NaCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Baker</td>
<td>4058-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>KCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>p-9333 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NaHCO3</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>s6297-1kg</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trelahose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>TO167</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sucrose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>bp220-212 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HEPES</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>h-3375</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MgCl-6H2O</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>m2670-1kg </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CaCl2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>c79-500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Master-8 Pulse Generator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>A.M.P.I</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vibration table for electrophysiology set up</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Technical manufacturing corporation</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Faraday Cage</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

electrophysiological methods for recording synaptic potentials from the nmj of drosophila larvae

In diesem Video, beschreiben wir die elektrophysiologischen Methoden zur Erfassung der synaptischen Übertragung an der neuromuskulären Synapse (NMJ) von Drosophila Larve. Die Larven neuromuskuläre System ist ein Modell Synapse für das Studium der synaptischen Physiologie und Neurotransmission und ist eine wertvolle Recherche-Tool, dass die Genetik definiert und ist zugänglich für experimentelle Manipulation. Die Larven können seziert, um den Körper Wand Muskulatur, zentrales Nervensystem und der peripheren Nerven freizulegen. Die Muskeln von Drosophila und ihre Innervationsmuster sind gut charakterisiert und Muskeln sind leicht zu intrazelluläre Aufnahme zuzugreifen. A7 - Einzelne Muskeln können durch ihre Lage und Orientierung innerhalb der 8 Abdominalsegmente mit je 30 Muskeln in ein Muster, das in Segmente A2 wiederholt angeordnet identifiziert werden. Dissected Drosophila-Larven sind dünn und einzelnen Muskeln und Bündeln von Motoneuronen Axone können visualisiert werden Durchleuchtung<sup&gt; 1</sup&gt;. Transgene Konstrukte können verwendet werden, um Zielzellen für die visuelle Identifizierung oder zur Manipulation von Genprodukten in bestimmten Geweben zu kennzeichnen. In Larven, sind exzitatorische Kreuzung Potentiale (EJPs) in Reaktion auf vesikuläre Freisetzung von Glutamat aus den Motoneuronen an der Synapse erzeugt. In seziert Larven können die EJP in den Muskel mit einer intrazellulären Elektrode aufgezeichnet werden. Aktionspotenziale können künstlich in Motoneuronen, die ausgeschnitten hinter der Bauchganglion, gezeichnet in eine Glaspipette durch sanfte Saugwirkung und angeregt mit einer Elektrode hervorgerufen werden. Diese motorischen Neuronen haben unterschiedliche Schwellenwerte feuern, wenn er stimuliert, und wenn sie gleichzeitig feuern, erzeugen sie eine Antwort in den Muskel. Signale über die NMJ Synapse übertragen können in den Muskeln, die die motorischen Neurone innervieren aufgezeichnet werden. Die EJPs und Miniatur-erregenden Kreuzung Potentiale (mEJPs) werden als Änderungen in Membranpotential gesehen. Elektrophysiologische Reaktionen sind bei Raumtemperatur in modifizierter minimal Hämolymphe-like-Lösung aufgenommen<sup&gt; 2</sup&gt; (HL3), die 5 mM Mg enthält<sup&gt; 2 +</sup&gt; Und 1,5 mM Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt;. Änderungen in der Amplitude der evozierten EJPs können auf Unterschiede in der synaptischen Funktion und Struktur. Digitalisierte Aufnahmen sind für EJP Amplitude, Frequenz und Amplitude mEJP und quantal analysiert.

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Electrophysiological Methods for Recording Synaptic Potentials from the NMJ of Drosophila Larvae

Hier beschreiben wir elektrophysiologische Methoden zur Messung der synaptischen Transmission an der neuromuskulären Synapse von Drosophila Larve. Evozierte Freisetzung wird künstlich durch die Stimulierung der Motoneuronen Axone initiiert, und die Übertragung durch die NMJ kann durch die postsynaptische Reaktion im Muskel ausgelöst gemessen werden.

Elektrophysiologischen Methoden für die Aufzeichnung Synaptic Potentials aus dem NMJ von Drosophila-Larven

In this video, we describe the electrophysiological methods for recording synaptic transmission at the neuromuscular junction (NMJ) of Drosophila larva. ...

electrophysiological-methods-for-recording-synaptic-potentials-from

Research

JoVE Journal

Biology

20.8K Aufrufe.  Columbia University College of Physicians and Surgeons. Hier beschreiben wir elektrophysiologische Methoden zur Messung der synaptischen Transmission an der neuromuskulären Synapse von Drosophila Larve. Evozierte Freisetzung wird künstlich durch die Stimulierung der Motoneuronen Axone initiiert, und die Übertragung durch die NMJ kann durch die postsynaptische Reaktion im Muskel ausgelöst gemessen werden.