לפני שמתחילים להכין: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנודד yhird instar הזחלים תסיסנית </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> HL3.1 (השתנה hemolymph דמוי) פתרון </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Sylgard (גומי סיליקון שקוף) צלחות לנתיחה שהוכנו קטן (35 x 10 מ&quot;מ) צלחות פטרי מפלסטיק בשיטות שתוארו על ידי ברנט מקייב (2008) 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גזור סיכות לנתיחה קצר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גירוי pipettes אלקטרודה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקלטה pipettes שארפ </li></ul> HL3 פתרון: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך והניתוחים וניסויים אלקטרו, הזחל שקועים פתרון HL3.1 2 המכיל (מ&quot;מ): 70 NaCl, KCl 5, 4 MgCl 2, 10 NaHCO 3, 5 trehalose, 115 סוכרוז, ו 5 HEPES, pH 7.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ריכוזים של CaCl 2 מתווספים פתרון HL3.1 כדי לספק את הריכוז הדרוש של תאי Ca 2 +. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזחל והניתוחים מבוצעים על Ca 2 + בריכוז נמוך (כדי למנוע התכווצות שרירים) באמצעות HL3.1 + 0.25 mM CaCl 2, שמרה על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניסויים אלקטרו נרשמות בדרך כלל HL3.1 + 1 mM CaCl 2, אבל זה יכול להיות מותאם 0.4-1 mM Ca 2 + כנדרש. </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפתרון HL3.1 מעוקר לסנן לפני השימוש, ומאוחסנים ב 4 ˚ C. </li></ol> הכנת מגרה הקלטה pipettes: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipettes הקלטה מגרה נמשכים עם P-2000 סאטר חולץ מבוסס לייזר micropipette באמצעות ההגדרות הבאות: חום = 390, נימה = 4, מהירות = 35, עיכוב = 200 ו - Pull = 0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אלקטרודות גירוי מוכנים מן דק דופן בורוסיליקט זכוכית נימים עם קצוות רחב כי היו מעט גדולים יותר מאשר רוחב של אקסונים המנוע ניתק. מסתיים בצורת הם firepolished לתת גימור חלק (בעזרת פיפטה Narashiga לטש), כדי למזער פגיעה בעצב. אלקטרודות גירוי מלאים פתרון אמבטיה (HL3.1 + 1 mM Ca 2 +). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אלקטרודות ההקלטה מוכנים מן הכוס בורוסיליקט 1.2 מ&quot;מ, אשר משך להקים פיפטה חדה (30-60 mΩ), ומלא 3M KCl. </li></ol> חלק 1: Dissection של הזחלים תסיסנית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השלישי הזחלים instar נדודים הם גזור לחשוף את שרירי הגוף הקיר כפי שתואר לעיל 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> והניתוחים המבוצעים HL3.1 + 0.25 mM Ca 2 + על לוחות סיליקון קטן (35 x 10 מ&quot;מ). HL3.1 הפתרון חייב להיות קר כקרח עבור והניתוחים על מנת לטשטש את הזחל, והוא שמר על הקרח לפני ובמהלך והניתוחים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזחלים הם גזור בשיטות שתוארו על ידי ברנט מקייב (2008), כי הוא שונה עבור ניסויים electrophysiology ידי הוספת 0.25 mM Ca 2 + פתרון HL3.1 את הנתיחה, וכן באמצעות סיכות לנתיחה קצר (~ 2 מ&quot;מ אורך), כי הם פחות סביר פגע אובייקטיבי מיקרוסקופ ואלקטרודות במהלך ניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות לנתיחה, אקסונים את המנוע של הזחלים נותקו. הדבר נעשה על ידי בעדינות מחזיק את מערכת העצבים המרכזית והעלאת זה כל כך מעט העצבים ההיקפיים כי innervate את השרירים האחוריים עד הגנגליון הגחון ניתן לקצץ מבלי לפגוע בשרירים (איור 1). המוח הוא הוסר לאחר מכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנה הזחל גזור נשטף פעמיים עם HL3.1 + 1 mM Ca 2 +. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1109/fig1.png" alt="איור 1" /> באיור 1. סכמטי המציג את הצעדים הכרוכים חיתוך האקסונים המנוע של הזחלים גזור. CNS היא הרים עם מלקחיים את האקסונים מנוע נחתכים בבסיס המוח. חלק 2: הקלטות תאיים מתאי השריר הזחל. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צלחת לנתיחה על המיקרוסקופ electrophysiology ו להטביע את הכנה עם HL3.1 + 1.5 מ&quot;מ Ca 2 + ולתקן את האלקטרודה אמבטיה כך במגע עם הפתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל הניסויים מבוצעים על השריר 6 במגזר הבטן השלישי (A3). העצבים ההיקפיים כי innervate השרירים הם גירוי באמצעות אלקטרודה יניקה 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיקום האלקטרודה מגרה בצלחת הראשונה, כדי למנוע תנודות כאשר האלקטרודה תאיים נמצא במקום. מניחים את האלקטרודה מגרה באזור קרוב הנוירון המוטורי innervating שריר 6 וליישם שאיבה עדינה עד עצב הוא לחתוך בתוך פיפטה מזכוכית. היזהרו לא למתוח את העצבים כאשר יניקה מוחל. הרם את פיפטה מעט כך שזה לא נוגע שריר ומקם אותה כך שזה לא מושך על סיבי העצב בסלע (איור 2). <img src="/files/ftp_upload/1109/fig2.png" alt="איור 2" width="600" height="296" /> איור 2. סכימטי של השרירים ועל הנוירונים המנוע innervating קטע אחד של הבטן מתוך הגולם תסיסנית. המיקום של פיפטה מגרה עצבים ניתקה את האלקטרודה הקלטה במצב בו השרירים 6 מומחשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוךהקלטות הסלולר עשויים עם microelectrodes חדה מלא 3M KCl. מיקום האלקטרודה הקלטה מעל מרכז שרירים 6 בקטע בטן השלישי (A3) ולהתאים את הקלט לקזז כך קורא אפס לפתרון אמבטיה. לאט לאט להוריד את האלקטרודה ואת הגישה את השריר תחת הגדלה אופטית גבוהה עד שזה נוגע משטח השרירים. צפה אוסצילוסקופ כדי לאשר את השריר כבר חדרו. פוטנציאל הממברנה מנוחה צריך להיות לפחות -60 mV, או בעל חיים לא אמור לשמש. ספוראדי הפוטנציאלים endplate מיניאטורי כעת אמור להיות גלוי. השאר את התא כדי לייצב למשך דקה אחת לפני שמתחילים להקליט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שינויים בפוטנציאל הממברנה מזוהים עם הבמה אקסון HS-2A ראש מגבר 2B Axoclamp והקליט עם Clampex v 8.2.0.235 (אקסון מכשירים). 2B Axoclamp הוא interfaced למחשב שמפעיל תוכנה pCLAMP ועובד בשיתוף עם ממשק Digidata 1322A. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים נרשמו במשך 3 דקות בלי שום גירויים כדי למדוד את התגובות mEJP. עקבות נותחו באמצעות תוכנת ניתוח מיני (Synaptosoft, v 6.0.3) לבין המשרעת בתדירות mEJP ונחוש. </li></ol> גירוי עצבי: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסוף הכרות של הנוירון המוטורי מגורה עם סדרה של פולסים מתח מרובע (0.3 משך ms) בעצימות כי די בשני אקסונים מוטוריים, לעורר תגובות עקבית השריר כולו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגירוי נוצר עם גנרטור מאסטר 8-הדופק, אשר מתוכנת לספק פולסים ברציפות על פי משך הזמן ושעות ההפסקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר חמש שניות בין גירוי להתאוששות הסינפטי על NMJ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעת קביעת עוצמת הגירוי, מתחילים ברמה הנמוכה ביותר ולהגדיל את העוצמה באיטיות על מספר ניסויים. עוצמת הגירוי המינימלית כי התוצאות בתגובה עורר אמור לשמש בניסויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר עוצמת הגירוי המתאים הוא הגיע, צריך להיות אחד EJP מתחם אחד התכווצות שרירים שעורר הגירוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שיא לפחות 10 הפוטנציאלים עורר מן השריר כל הממוצע אמפליטודות. </li></ol> חלק 3: תוצאות נציג <img src="/files/ftp_upload/1109/fig3.png" alt="דמות 3" width="600" height="358" /> איור 3. ההקלטה תאיים נציגת שריר 6 מראה את זה הוא עורר EJP בתגובה גירוי חשמלי של עצב סגמנטלי, ואת הפוטנציאלים ספורדיים endplate מיניאטורי, או mEJP של. EJP אמפליטודות בשריר 6 של הזחלים wild-type בריאים, כגון S קנטון, הם בדרך כלל סביב 40 ​​mV ואת אמפליטודות mEJP בין 1-3 mV.

<ol>
	<li>Atwood, H. L., Govind, C. K., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+ultrastructure+of+synaptic+terminals+on+ventral+longitudinal+abdominal+muscles+in+Drosophila+larvae.">Differential ultrastructure of synaptic terminals on ventral longitudinal abdominal muscles in Drosophila larvae.</a> J. Neurobiol. 24 (8), 1008-1024 (1993).</li><li>Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+minimal+hemolymph-like+solution,+HL3.1,+for+physiological+recordings+at+the+neuromuscular+junctions+of+normal+and+mutant+Drosophila+larvae.">A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae.</a> J Neurogenet. 18 (2), 377-402 (2004).</li><li>Estes, P. S., Roos, J., van der Bliek, A., Kelly, R. B., Krishnan, K. S., Ramaswami, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traffic+of+dynamin+within+individual+Drosophila+synaptic+boutons+relative+to+compartment-specific+markers.">Traffic of dynamin within individual Drosophila synaptic boutons relative to compartment-specific markers.</a> J Neurosci. 16, 5443-5456 (1996).</li><li>Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+dissection+of+Drosophila+larvae.">Protocol for dissection of Drosophila larvae.</a> J Vis Exp. , (2008).</li><li>Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+the+larval+neuromuscular+junction+in+Drosophila+melanogaster.">Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila melanogaster.</a> J Physiol (Lond). 262, 189-214 (1976).</li><li>Katz, L. C., Shatz, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+activity+and+the+construction+of+cortical+circuits.">Synaptic activity and the construction of cortical circuits.</a> Science. 274, 1133-1138 (1996).</li></ol>

השיטות שתוארו כאן לספק דרך מהירה יחסית רחבה כדי לזהות שינויים בתפקוד סינפטי ב NMJ. היכולת לבצע הקלטות אלקטרו באמצעות בעלי חיים שלמים in vivo, ולבצע מניפולציות גנטיות או תרופתי, לעשות תסיסנית מודל חיה אידיאלית לחקר היבטים פיזיולוגיים הגנטי של עצבית. <p class="jove_content" style=";text-...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Small Petri dishes (35 x 10 mm)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton Dickinson</td>
<td>1008</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SYLGARD 182 Silicone Elastomer Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dow Corning Corporation</td>
<td>3097366-1004</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissecting microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Carl Zeiss</td>
<td>475002-9902</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Light for microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Schott</td>
<td>KLI500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissection pins</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>26002-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>pClamp 9 software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Axon CNS, Molecular Devices</td>
<td>PCLAMP 9 STANDARD</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissection scissors: 3mm Vannas Spring Scissors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>15000-0</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dumont SS Forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11200-33</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dumont #5 Forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11252-20</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Thin-walled borosilicate glass capillaries, with filament (1.0 mm, 4 in)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments, Inc.</td>
<td>TW100F-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Borosilicate glass capillaries, with filament (1.2 mm, 4 in)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments, Inc.</td>
<td>1B120F-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sutter P-2000 Laser Based Micropipette Puller </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instruments</td>
<td>Model P-2000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pipette polisher</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Narishiga</td>
<td>MF-83</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Axon HS-2A head stage</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Axon CNS, Molecular Devices</td>
<td>Model HS-2A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micromanipulators</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instruments</td>
<td>MP-85</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Axoclamp 2B amplifier</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Axon CNS, Molecular Devices</td>
<td>AXOCLAMP 2B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Clampex Software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Axon CNS, Molecular Devices</td>
<td>v 8.2.0.235</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mini analysis software. v 6.0.3</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Synaptosoft</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Brownlee Precision Amplifier</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Brownlee</td>
<td>Model 410</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NaCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Baker</td>
<td>4058-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>KCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>p-9333 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NaHCO3</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>s6297-1kg</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trelahose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>TO167</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sucrose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>bp220-212 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HEPES</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>h-3375</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MgCl-6H2O</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>m2670-1kg </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CaCl2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>c79-500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Master-8 Pulse Generator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>A.M.P.I</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vibration table for electrophysiology set up</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Technical manufacturing corporation</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Faraday Cage</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

electrophysiological methods for recording synaptic potentials from the nmj of drosophila larvae

בסרטון זה, אנו מתארים את שיטות אלקטרו הקלטה בשידור סינפטי בצומת neuromuscular (NMJ) של הזחל תסיסנית. מערכת הזחל neuromuscular היא סינפסה מודל לחקר הפיזיולוגיה עצבית הסינפטי ו, ו הוא כלי מחקר חשוב זה הגדיר גנטיקה נגיש מניפולציה ניסויית. הזחלים יכולים להיות גזור כדי לחשוף את הגוף קיר השרירים, מערכת העצבים המרכזית ומערכת העצבים ההיקפית. שרירי תסיסנית דפוס העצבוב שלהם מאופיינים היטב את שרירי קל לגשת להקלטה תאיים. שרירים בודדים ניתן לזהות על ידי מיקומם ואת כיוון בתוך 8 קטעים בטן, כל אחד עם 30 השרירים מסודרים דפוס זה חוזר על עצמו בקטעים A2 - A7. גזור הזחלים תסיסנית הם שרירי רזה הפרט צרורות של אקסונים הנוירון המוטורי ניתן דמיינו ידי שקוף<sup&gt; 1</sup&gt;. בונה טראנסגנטי ניתן להשתמש בתווית תאים היעד לצורך זיהוי חזותי או מניפולציה מוצרים גנים ברקמות ספציפיות. ב זחלים, צומת מעוררים פוטנציאלים (EJPs) נוצרות בתגובה לשחרר שלפוחי של גלוטמט מן motoneurons ב הסינפסה. ב הזחלים גזור, EJP ניתן להקליט בשריר עם אלקטרודה תאיים. פוטנציאל פעולה יכול להיות עורר באופן מלאכותי הנוירונים המנוע, כי כבר לחתוך האחורי אל הגנגליון הגחון, להיגרר פיפטה כוס ידי יניקה עדין מגורה עם אלקטרודה. אלו הנוירונים המנוע יש סף ירי נפרדים כאשר מומרץ, וכשהם אש זמנית, הם מייצרים תגובה בשריר. האותות משודרים ברחבי סינפסה NMJ ניתן להקליט בשרירים כי הנוירונים המנוע innervate. EJPs מיניאטורי הפוטנציאלים צומת מעוררים (mEJPs) נתפסים שינויים פוטנציאל הממברנה. התגובות אלקטרו נרשמות בטמפרטורת החדר בפתרון שונה hemolymph כמו מינימלי<sup&gt; 2</sup&gt; (HL3) המכיל 5 מ&quot;ג mM<sup&gt; 2 +</sup&gt; ו - 1.5 mM Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt;. שינויים משרעת של EJPs עורר יכול להצביע על הבדלים בתפקוד המבנה הסינפטי ו. הקלטות סרוקים מנותחים עבור EJP אמפליטודה, תדירות mEJP ואת משרעת ותוכן quantal.

Watch this Scientific Journal Video about Electrophysiological Methods for Recording Synaptic Potentials from the NMJ of Drosophila Larvae at JoVE.com

Electrophysiological Methods for Recording Synaptic Potentials from the NMJ of Drosophila Larvae

כאן אנו מתארים שיטות אלקטרו למדידת בשידור סינפטי בצומת neuromuscular של הזחל תסיסנית. שחרור עורר היא יזמה באופן מלאכותי על ידי המרצת הנוירונים אקסונים מוטוריים, והעברת דרך NMJ ניתן למדוד התגובה postsynaptic עורר בשריר.

שיטות אלקטרו עבור הקלטה פוטנציאלים Synaptic מן NMJ של הזחלים תסיסנית

In this video, we describe the electrophysiological methods for recording synaptic transmission at the neuromuscular junction (NMJ) of Drosophila larva. ...

electrophysiological-methods-for-recording-synaptic-potentials-from

Research

JoVE Journal

Biology

20.9K Views.  Columbia University College of Physicians and Surgeons. כאן אנו מתארים שיטות אלקטרו למדידת בשידור סינפטי בצומת neuromuscular של הזחל תסיסנית. שחרור עורר היא יזמה באופן מלאכותי על ידי המרצת הנוירונים אקסונים מוטוריים, והעברת דרך NMJ ניתן למדוד התגובה postsynaptic עורר בשריר.

Video: Electrophysiological Methods for Recording Synaptic Potentials from the NMJ of Drosophila Larvae

Dissection of Imaginal Discs from 3rd Instar Drosophila Larvae

This protocol demonstrates the dissection technique used for isolating imaginal discs from drosophila larvae at the 3rd instar stage. Methods for fixing the tissue after saying and removing the wing, leg, and eye discs are demonstrated directly on a microscope slide for subsequent visualization.

Dissection של דיסקים דמותי מן הזחלים 3 תסיסנית Instar

Methods for Patch Clamp Capacitance Recordings from the Calyx

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal. Electrical recordings from the presynaptic terminal allow the measurement of action potentials, calcium channel currents, vesicle fusion (exocytosis) and subsequent membrane uptake (endocytosis). The fusion of vesicles containing neurotransmitter causes the vesicle membrane to be added to the cell membrane of the calyx. This increase in the amount of cell membrane is measured as an increase in capacitance. The subsequent reduction in capacitance indicates endocytosis, the process of membrane uptake or removal from the calyx membrane. Endocytosis, is necessary to maintain the structure of the calyx and it is also necessary to form vesicles that will be filled with neurotransmitter for future exocytosis events. Capacitance recordings at the calyx of Held have made it possible to directly and rapidly measure vesicular release and subsequent endocytosis in a mammalian CNS nerve terminal. In addition, the corresponding postsynaptic activity can be simultaneously measured by using paired recordings. Thus a complete picture of the presynaptic and postsynaptic electrical activity at a central nervous system synapse is achievable using this preparation. Here, the methods for slice preparation, morphological features for identification of calyces of Held, basic patch clamping techniques, and examples of capacitance recordings to measure exocytosis and endocytosis are presented.

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal.

שיטות הצמד תיקון הקלטות קיבול מן Calyx

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal. ...

High-resolution Measurement of Odor-Driven Behavior in Drosophila Larvae

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral paradigm, the experimenter usually assumes that the rapid diffusion of odorant molecules from the source leads to the creation of a stable gradient in the dish. To establish a quantitative correlation between sensory inputs and behavioral responses, it is necessary to achieve a more thorough characterization of the odorant stimulus conditions. In this video article, we describe a new method allowing the construction of odorant gradients with stable and controllable geometries. We briefly illustrate how these gradients can be used to screen for olfactory defects (full and partial anosmia) and to study more subtle features of chemotaxis behavior.

In this video article, we describe a new method allowing the construction of odorant gradients with stable and controllable geometries. We briefly illustrate how these gradients can be used to screen for olfactory defects (full and partial anosmia) and to study more subtle features of chemotaxis behavior.

ברזולוציה גבוהה מדידה של התנהגות ריח מונחה על הזחלים תסיסנית

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral ...

Drosophila Larval NMJ Dissection

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use of the Drosophila motor system is due to its high accessibility. It can be analyzed with single-cell resolution. There are 30 muscles per hemisegment whose arrangement within the peripheral body wall are known. A total of 35 motor neurons attach to these muscles in a pattern that has high fidelity. Using molecular biology and genetics, one can create transgenic animals or mutants. Then, one can study the developmental consequences on the morphology and function of the NMJ. In order to access the NMJ for study, it is necessary to carefully dissect each larva. In this article we demonstrate how to properly dissect Drosophila larvae for study of the NMJ by removing all internal organs while leaving the body wall intact. This technique is suitable to prepare larvae for imaging, immunohistochemistry, or electrophysiology.

This protocol demonstrates how to dissect Drosophila larvae in preparation for immunohistochemistry and/or imaging of the neuromuscular junction.

תסיסנית הזחל Dissection NMJ

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use ...

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use of the Drosophila motor system is due to its high accessibility. It can be analyzed with single-cell resolution. There are 30 muscles per hemisegment whose arrangement within the peripheral body wall are known. A total of 31 motor neurons attach to these muscles in a pattern that has high fidelity. Using molecular biology and genetics, one can create transgenic animals or mutants. Then, one can study the developmental consequences on the morphology and function of the NMJ. Immunohistochemistry can be used to clearly image the components of the NMJ. In this article, we demonstrate how to use antibody staining to visualize the Drosophila larval NMJ.

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

This protocol demonstrates how to perform immunohistochemistry on dissected Drosophila larva.

תסיסנית הזחל NMJ אימונוהיסטוכימיה

Channelrhodopsin2 Mediated Stimulation of Synaptic Potentials at Drosophila Neuromuscular Junctions

The Drosophila larval neuromuscular preparation has proven to be a useful tool for studying synaptic physiology1,2,3. Currently, the only means available to evoke excitatory junctional potentials (EJPs) in this preparation involves the use of suction electrodes. In both research and teaching labs, students often have difficulty maneuvering and manipulating this type of stimulating electrode. In the present work, we show how to remotely stimulate synaptic potentials at the larval NMJ without the use of suction electrodes. By expressing channelrhodopsin2 (ChR2) 4,5,6 in Drosophila motor neurons using the GAL4-UAS system 7, and making minor changes to a basic electrophysiology rig, we were able to reliably evoke EJPs with pulses of blue light. This technique could be of particular use in neurophysiology teaching labs where student rig practice time and resources are limited.

Channelrhodopsin2 Mediated Stimulation of Synaptic Potentials at Drosophila Neuromuscular Junctions

This procedure uses a blue light-activated algal channel and cell-specific genetic expression tools to evoke synaptic potentials with light pulses at the neuromuscular junction (NMJ) in Drosophila larvae. This technique is an inexpensive and easy-to-use alternative to suction electrode stimulation for synaptic physiology studies in research and teaching laboratories.

Channelrhodopsin2 גירוי מתווכת של פוטנציאלים Synaptic בבית תסיסנית Neuromuscular כלאיים

The Drosophila larval neuromuscular preparation has proven to be a useful tool for studying synaptic physiology1,2,3. Currently, the only means available ...

Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite isolated from each other, with largely independent histories and scientific communities. However, the interface between these usually disparate fields is the developmental programs underlying acquisition of functional electrical signaling properties and differentiation of functional chemical synapses during the final phases of neural circuit formation. This interface is a critically important area for investigation. In Drosophila, these phases of functional development occur during a period of &lt;8 hours (at 25&deg;C) during the last third of embryogenesis. This late developmental period was long considered intractable to investigation owing to the deposition of a tough, impermeable epidermal cuticle. A breakthrough advance was the application of water-polymerizing surgical glue that can be locally applied to the cuticle to enable controlled dissection of late-stage embryos. With a dorsal longitudinal incision, the embryo can be laid flat, exposing the ventral nerve cord and body wall musculature to experimental investigation. This system has been heavily used to isolate and characterize genetic mutants that impair embryonic synapse formation, and thus reveal the molecular mechanisms governing the specification and differentiation of synapse connections and functional synaptic signaling properties.

Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures

This technique exposes the Drosophila embryonic neuromusculature for immunohistochemistry or electrophysiological recording. It is useful for studying early events in neuromuscular development or performing electrophysiology in mutants that cannot hatch.

מסיק והכנת תסיסנית עוברים הקלטה אלקטרו ונהלים אחרים

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite ...

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite isolated from each other, with largely independent histories and scientific communities. However, the interface between these usually disparate fields is the developmental programs underlying acquisition of functional electrical signaling properties and differentiation of functional chemical synapses during the final phases of neural circuit formation. This interface is a critically important area for investigation. In Drosophila, these phases of functional development occur during a period of &lt;8 hours (at 25&deg;C) during the last third of embryogenesis. This late developmental period was long considered intractable to investigation owing to the deposition of a tough, impermeable epidermal cuticle. A breakthrough advance was the application of water-polymerizing surgical glue that can be locally applied to the cuticle to enable controlled dissection of late-stage embryos. With a dorsal longitudinal incision, the embryo can be laid flat, exposing the ventral nerve cord and body wall musculature to experimental investigation. Whole-cell patch-clamp techniques can then be employed to record from individually-identifiable neurons and somatic muscles. These recording configurations have been used to track the appearance and maturation of ionic currents and action potential propagation in both neurons and muscles. Genetic mutants affecting these electrical properties have been characterized to reveal the molecular composition of ion channels and associated signaling complexes, and to begin exploration of the molecular mechanisms of functional differentiation. A particular focus has been the assembly of synaptic connections, both in the central nervous system and periphery. The glutamatergic neuromuscular junction (NMJ) is most accessible to a combination of optical imaging and electrophysiological recording. A glass suction electrode is used to stimulate the peripheral nerve, with excitatory junction current (EJC) recordings made in the voltage-clamped muscle. This recording configuration has been used to chart the functional differentiation of the synapse, and track the appearance and maturation of presynaptic glutamate release properties. In addition, postsynaptic properties can be assayed independently via iontophoretic or pressure application of glutamate directly to the muscle surface, to measure the appearance and maturation of the glutamate receptor fields. Thus, both pre- and postsynaptic elements can be monitored separately or in combination during embryonic synaptogenesis. This system has been heavily used to isolate and characterize genetic mutants that impair embryonic synapse formation, and thus reveal the molecular mechanisms governing the specification and differentiation of synapse connections and functional synaptic signaling properties.

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Electrophysiological recordings from Drosophila embryos allow analyses of developing muscle and neuron electrical properties, as well as characterization of functional synaptogenesis at the glutamatergic neuromuscular junction and central cholinergic and GABAergic synapses.

הקלטה של ​​אלקטרו תסיסנית עובריים

Historical View and Physiology Demonstration at the NMJ of the Crayfish Opener Muscle

Here we present some of the key important discoveries made with the opener neuromuscular (NMJ) preparation of crustaceans and illustrate that there is still much to learn from this model preparation. In understanding the history one can appreciate why even today this NMJ still offers a rich playground to address questions regarding pre- and post-synaptic function and plasticity. The viability and ease of access to the terminal for intracellular as well as extracellular electrophysiology and imaging are significant advantages. The mechanisms behind the modulation of vesicular kinetics and fusion within the high- and low-output terminals are begging for investigation. The preparation also offers a testable model system for computational assessments and manipulations to examine key variables in theoretical models of synaptic function, for example calcium dynamics during short-term facilitation. The synaptic complexity of active zone and statistical nature of quantal release is also an open area for future investigation both experimentally and computationally.

The opener muscle of the crayfish leg is presented for its historical importance and experimental versatility in muscle phenotype, synaptic physiology and plasticity.

צפה היסטורי הפגנה לפיזיולוגיה NMJ של השריר פותחן סרטן הנהרות

Here we present some of the key important discoveries made with the opener neuromuscular (NMJ) preparation of crustaceans and illustrate that there is ...

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal lines have enabled biological processes to be studied in the context of a living, and in some instances even behaving, organism. In this protocol we will describe how to anesthetize intact Drosophila larvae, using the volatile anesthetic desflurane, to follow the development and plasticity of synaptic populations at sub-cellular resolution1-3. While other useful methods to anesthetize Drosophila melanogaster larvae have been previously described4,5,6,7,8, the protocol presented herein demonstrates significant improvements due to the following combined key features: (1) A very high degree of anesthetization; even the heart beat is arrested allowing for lateral resolution of up to 150 nm1, (2) a high survival rate of &gt; 90% per anesthetization cycle, permitting the recording of more than five time-points over a period of hours to days2 and (3) a high sensitivity enabling us in 2 instances to study the dynamics of proteins expressed at physiological levels. In detail, we were able to visualize the postsynaptic glutamate receptor subunit GluR-IIA expressed via the endogenous promoter1 in stable transgenic lines and the exon trap line FasII-GFP1. (4) In contrast to other methods4,7 the larvae can be imaged not only alive, but also intact (i.e. non-dissected) allowing observation to occur over a number of days1. The accompanying video details the function of individual parts of the in vivo imaging chamber2,3, the correct mounting of the larvae, the anesthetization procedure, how to re-identify specific positions within a larva and the safe removal of the larvae from the imaging chamber.

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

This protocol describes a reliable method for anesthetization and imaging of intact Drosophila melanogaster larvae. We have utilized the volatile anesthetic desflurane to allow for repetitive imaging at sub-cellular resolution and re-identification of structures for up to a few days1.

בתחום ההדמיה vivo של הזחלים תסיסנית אינטקט ברזולוציה משנה הסלולר

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal ...