Мы хотели бы отметить вклад Dorthe Юлих, Дженнифер Круглый и Андрей Мара в разработке этого протокола. Исследования поддержки со стороны NICHD, Американского онкологического общества и марте Dimes.

1. ФИКСАЦИИ <ol><li> Fix эмбрионов в течение ночи при 4 ° С с 4% параформальдегида (PFA) в PBS. </li><li> Удалить исправить и мыть 2 х PBS, 5 минут при комнатной температуре (RT). </li><li> Вручную dechorionate эмбрионов в PBS в стеклянную пластинку депрессии использованием часовщик пинцетом. После dechorionation, эмбрионы, переданные с помощью пожарной полированное стекло пипетки Пастера, как они могут прилипнуть к полипропилена пипеток. </li><li> Передача эмбрионы через серию 25%, 50% и 75% метанола в PBS в течение 5 минут каждый. </li><li> Замените жидкость со 100% метанола, инкубировать 5 минут, а затем заменить свежим метанолом. </li><li> Место эмбрионов при температуре -20 ° С в течение минимум одного часа. (Как правило, мы инкубации эмбрионы в одночасье. Стандарт в гибридизация будет работать на эмбрионы хранятся в течение более чем года, но мы еще не исследовали, является ли высоким разрешением флуоресцентные в гибридизация теряется при длительном хранении.) </li><li> Вымойте эмбрионов в течение 5 минут каждый на 75%, 50%, 25% метанола в PBST при комнатной температуре. Мыть два раза в течение 5 минут каждый в PBST при комнатной температуре. </li><li> Fix снова в течение 20 минут в 4% PFA в PBS при комнатной температуре. </li><li> Мыть два раза в течение 5 минут каждый в PBST при комнатной температуре. </li></ol> ПРИМЕЧАНИЕ ОТНОСИТЕЛЬНО PFA: Мы храним 4% PFA в аликвоты при -20 º C (см. таблицу реагентов). Для начальной фиксации, мы используем только PFA, что никогда не было ранее талой. Для последующих записей, мы часто используем PFA, который был ранее талой. Начальная фиксация, кажется, решающее значение для успешного окрашивания с этим протоколом. 2. Протеиназы И вторичная фиксация <ol><li> Дайджест с протеиназы К (5μg/ml в PBST) при комнатной температуре в течение от 3 до 12 минут permeabilize эмбрионов. (Инкубационного периода зависит от возраста эмбрионов в качестве младшего этапов более чувствительны. Это также зависит от партии фермента.) Для эмбрионов сомитогенеза этапе мы обычно permeabilize течение 3-4 минут. Во время этой инкубации, мы закладываем микроцентрифужных трубки на ее стороне. </li><li> Промыть кратко в PBST и мыть один раз в течение 5 минут в PBST. </li><li> Fix снова в течение 20 минут в 4% PFA в PBS при комнатной температуре. </li><li> Промыть два раза, в течение 5 минут каждая, в PBST при комнатной температуре. </li></ol> 3. PREHYBRIDIZATION <ol><li> Инкубируйте эмбрионов в течение 5 минут при 65 ° С в HYB-. </li><li> Prehybridize при температуре 65 ° С в течение не менее 1 часа в HYB +. </li></ol> 4. ГИБРИДИЗАЦИЯ <ol><li> Удалите все, кроме 50 мкл preHYB, но убедитесь, что держать эмбрионов полностью погружены. </li><li> Добавьте 1-2 мкл каждого riboprobe (digoxygenin и меченных флуоресцеином riboprobes) для эмбрионов и смешать, аккуратно стряхивая трубки. Количество зонд, как правило, 1-2μl от 20 мкл реакции синтеза зонда. </li><li> Учитывая, что флуоресцеина является светочувствительным, трубы должны быть завернуты в алюминиевую фольгу или иначе подвергается минимальным свет от данного момента. </li><li> Инкубируйте эмбрионов в течение ночи при 65 ° C. </li></ol> 5. Отсоединения зонда Обратите внимание, что решения с этого момента моющих средств не хватает. Ликвидация моющего средства, чтобы помочь появляется окрашивание реакции, но вызывает эмбрионов, чтобы стать довольно липким. <ol><li> Удалить riboprobe. </li><li> Вымойте 2 х 30 минут при 65 ° С в 50% formamide/2xSSC. </li><li> Промыть в течение 15 минут при 65 ° С в 2 х SSC. </li><li> Промыть в течение 30 минут 65 ° C в 0,2 х SSC. </li></ol> 6. АНТИ-флуоресцеина антитела ИНКУБАЦИИ <ol><li> Блок, по крайней мере 1 час при комнатной температуре в 500 мкл раствора 1x малеиновой кислоты буфера плюс 2% блокирующий реагент (см. таблицу реагентов). </li><li> Добавить анти-флуоресцеин-POD антитела, поставляемый компанией Рош, в разведении 1:500 в блокировании решения. </li><li> Инкубируйте течение ночи при 4 ° С. Во время этой инкубации, мы закладываем микроцентрифужных трубки на ее стороне. </li><li> Промыть 4 х 20 минут в 1x малеиновой кислоты буфера. Мыть два раза в течение 5 минут каждый в PBS. </li></ol> 7. ОБНАРУЖЕНИЕ флуоресцеином Меченые PROBE <ol><li> Выдержите 30-60 минут в TSA Решение Плюс флуоресцеина. (Spin вниз подложки TSA прежде, чем сделать окрашивание раствора. Для реакции, развести tyramide реагента 1:50 в Perkin Elmer буфера разбавителя усиления.) Во время этой инкубации, мы закладываем микроцентрифужных трубки на ее стороне. Время реакции должна определяться эмпирически для каждого зонда. К сожалению, окрашивание реакция не может быть визуально контролировать как субстрат люминесцентные, и не увидит вездесущий зеленая флуоресценция всей окрашивание реакции. </li><li> Промыть в течение 10 минут каждый в 30%, 50%, 75% и 100% метанола в PBS. </li><li> Инкубируйте в 1% раствора Н 2 0 2 в метаноле в течение 30 минут для инактивации первого пероксидазы. </li><li> Вымойте 10 минут в 75%, 50% и 30% метанола в PBS. Затем промыть два раза по 10 минут каждый в PBS. Важно, чтобы все встретилисьhanol быть удалены. </li></ol> ЗАМЕТКИ О TYRAMIDE усиления сигнала: Мы используем Перкин Элмер TSA Kits. Мы считаем, что Alexa-Tyramide субстратов хорошо окрашиваются использованием усиления Перкин Элмер разбавителя буфер, но у нас не было успеха, используя окрашивание буфера снабжена Invitrogen / Molecular Probes Kits. Наконец, мы обнаружили, что Cy5 флуоресценции устраняется последующим метанол / H 2 O 2 в то время как лечение флуоресцеина и Alexa-647 не изменяются. Cy3 также может оказать негативное воздействие на метанол / H 2 O 2 лечения, как это структурно связаны с Cy5. По этой причине, Cy3 и Cy5 TSA реакции должны использоваться только для второй реакции окрашивания в двумя люминесцентными на месте протокол. 8. АНТИ-Digoxygenin антитела ИНКУБАЦИИ <ol><li> Блок эмбрионы снова, по крайней мере 1 час при комнатной температуре в растворе 1x малеиновой кислоты буфера плюс 2% блокирующий реагент. </li><li> Добавить анти-DIG POD антител при поставке компанией Рош в разведении 1:1000 в выше блокирующий раствор </li><li> Инкубируйте течение ночи при 4 ° С. Во время этой инкубации, мы закладываем микроцентрифужных трубки на ее стороне. </li><li> Промыть 4 х 20 минут в 1x малеиновой кислоты буфера. Мыть два раза в течение 5 минут каждый в PBS. </li></ol> 9. ОБНАРУЖЕНИЕ Digoxygenin-Меченые PROBE <ol><li> Выдержите 30-60 минут в TSA Плюс Cy5 Решение (Spin вниз подложки TSA, прежде чем окрашивание раствора. Для реакции, развести tyramide реагента 1:50 в усилении буфера разбавителя) Во время этой инкубации, мы закладываем микроцентрифужных трубки на ее стороне. Время реакции должна определяться эмпирически для каждого зонда. </li><li> Вымойте три раза в течение 10 минут каждый в PBST. </li></ol> 10. Пропидия йодидом окрашивание <ol><li> Мыть два раза в течение 5 минут в 2 х SSC. </li><li> Инкубируйте эмбрионов в течение 30 минут при 37 ° С в 50 мкл 2 х SSCT по 10 мкл РНКазы (для конечной концентрации 100μg/ml). </li><li> Вымойте шесть раз в течение 3 минут каждый в 2 х SSC при комнатной температуре. </li><li> Пятно эмбрионов в течение 8 минут в растворе йодида 330μg/ml пропидий в 2-х SSC. </li><li> Вымойте шесть раз в течение 3 минут каждый в 2 х SSC при комнатной температуре. </li><li> Fix течение 20 минут в 4% PFA в PBS при комнатной температуре. </li><li> Промыть два раза, в течение 5 минут каждая, в PBST при комнатной температуре. </li></ol> 11. МОНТАЖ <ol><li> Инкубируйте эмбрионов в течение 10 минут каждый по 25% и 50% глицерина в PBST. Очистить ночь в 75% глицерине при 4 ° С. </li><li> Мы проанализируем и deyolk эмбрионов и плоские смонтировать их на предметное стекло. Желток может привести к значительным флуоресценции фон. Препарирование намного легче после эмбрионов очистили ночъ в gylcerol. </li></ol> РЕШЕНИЯ: <table border="1"><tbody><tr><td> PBST </td><td> ФСБ, содержащего 0,1% Твин </td><td></td></tr><tr><td> SSCT </td><td> SSC плюс 0,1% Твин </td><td></td></tr><tr><td> HYB- </td><td> 50% формамида 5xSSC 0,1% Твин-20 </td><td></td></tr><tr><td> HYB + </td><td> HYB- 5mg/ml torula (дрожжи) РНК 50μg/ml гепарин </td><td style="width: 300px;"> Torula РНК подготовленный протеиназы К пищеварения РНК с последующей фенол-, фенол-хлороформ-и хлороформ-extraction.The РНК осаждается и растворяют в DEPC обработанной воды. </td></tr><tr><td> 1 х малеиновой кислоты буфер </td><td> 150 мМ малеиновой кислоты, 100 мм NaCl (рН 7,5) </td><td></td></tr></tbody></table><img src="/files/ftp_upload/1229/Brend_Holley_Fig1.png" alt="Рисунок 1" width="600" height="688" /> Рисунок 1. Представителю результаты целом крепление двумя люминесцентными на месте гибридизации. (AC). Изображения показывают одно конфокальной сечение задней части полосатого данио эмбриона на десять сомитов. Зрения спинной с передней к вершине. Ядер окрашенных йодистым пропидий окрашены в синий цвет. (А) deltaC мРНК, обнаруженных с применением digoxygenin меченных riboprobe и TSA-Cy5 реагента. (B) мРНК расшифрованы с геном her1 был обнаружен с флуоресцеина меченных riboprobe и TSA-флуоресцеина реагента. (C) Объединение зеленого и красного каналов однозначно идентифицирует отдельных регионах или перекрывающихся генов из двух генов. (D, E) Деталь her1 выражении демонстрирует высокое разрешение этой процедуры. Субклеточных локализации мРНК можно четко различить. Стрелки указывают на ячейки выставке активной транскрипции, выявленные точки окрашивания в ядре. Стрелки указывают ячейка показывает цитоплазматической локализации мРНК. (F, G) Дважды окрашивание на her1 и deltaC показывает, клетки, которые расшифровки обоих генов (белые стрелки), либо гена или отдельно (красные и зеленые стрелки).

<ol>
	<li>Schulte-Merker, S., Ho, R. K., Herrmann, B. G., N&#252;sslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+product+of+the+zebrafish+homologue+of+the+mouse+T-gene+is+expressed+in+nuclie+of+the+germ+ring+and+the+notochord+of+the+early+embryo.">The protein product of the zebrafish homologue of the mouse T-gene is expressed in nuclie of the germ ring and the notochord of the early embryo.</a> Development. 116, 1021-1027 (1992).</li><li>Jowett, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+in+situ+hybridization+techniques+in+zebrafish.">Double in situ hybridization techniques in zebrafish.</a> Methods. 23, 345-358 (2001).</li><li>J&#252;lich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beamter/deltaC+and+the+role+of+Notch+ligands+in+the+zebrafish+somite+segmentation,+hindbrain+neurogenesis+and+hypochord+differentiation.">beamter/deltaC and the role of Notch ligands in the zebrafish somite segmentation, hindbrain neurogenesis and hypochord differentiation.</a> Dev Biol. 286, 391-404 (2005).</li><li>Mara, A., Schroeder, J., Chalouni, C., Holley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Priming,+Initiation+and+Synchronization+of+the+Segmentation+Clock+by+deltaD+and+deltaC.">Priming, Initiation and Synchronization of the Segmentation Clock by deltaD and deltaC.</a> Nat Cell Biol. 9, 523-530 (2007).</li><li>Lecuyer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+mRNA+localization+reveals+a+prominent+role+in+organizing+cellular+architecture+and+function.">Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function.</a> Cell. 131, 174-187 (2007).</li></ol>

Протокол, представленные здесь хорошо работает с зондов, которые дают чистый сильный сигнал после окрашивания в течение 30-45 минут в обычной щелочной фосфатазы-опосредованной реакции. Перед выполнением флуоресцентные на месте протокол гибридизации, мы всегда проверяем наши зонды испо...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Paraformaldehyde 16% solution, EM Grade</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Services</td>
<td>15710</td>
<td>Dilute to 4% in 1.33x PBS (final 1x). Store in 2ml aliquots at &#x2013;20&deg;C</td>
</tr>
<tr>
<td>Proteinase K, recombinant PCR grade</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>03115879001</td>
<td>Make a 20mg/ml stock solution in water. Store in 1ml aliquots at &#x2013;20&deg;C</td>
</tr>
<tr>
<td>Blocking Reagent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>11096176001</td>
<td>Make a 10% stock solution in 1x maleic acid buffer. Store in 50ml aliquots at &#x2013;20&deg;C. Stable over multiple freeze/thaws.</td>
</tr>
<tr>
<td>Anti-Fluorescein-POD, Fab fragments</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>11426346910</td>
<td>Aliquot and store at -20&deg;C. Keep one working aliquot at 4&deg;C.</td>
</tr>
<tr>
<td>Anti-Digoxigenin-POD, Fab fragments</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>11207739910</td>
<td>As above.</td>
</tr>
<tr>
<td>TSA Plus Fluorescein system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Perkin Elmer</td>
<td>NEL741001KT</td>
<td>Prepare each vial of TSA reagent only when needed. Dissolve in 60&mu;l DMSO. Store at 4&deg;C.</td>
</tr>
<tr>
<td>TSA Plus Cyanine5 system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Perkin Elmer</td>
<td>NEL745001KT</td>
<td>As above</td>
</tr>
<tr>
<td>TSA Plus Cyanine3 system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Perkin Elmer</td>
<td>NEL744001KT</td>
<td>As above</td>
</tr>
<tr>
<td>TSA Kit #16 AlexaFluor647 tyramide (plus HRP-goat-anti-rabbit IgG)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Probes /Invitrogen</td>
<td>T20926</td>
<td>Dissolve tyramide reagent in 150&mu;l DMSO, aliquot and store at &#x2013;20&deg;C.</td>
</tr>
<tr>
<td>RNase, DNase free</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>11119915001</td>
<td>Supplied as 500&mu;g/ml solution</td>
</tr>
<tr>
<td>Propidium Iodide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Probes /Invitrogen</td>
<td>P-3566</td>
<td>Supplied as 1mg/ml solution in water.</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

zebrafish whole mount high-resolution double fluorescent in situ hybridization

Всего горе<em&gt; На месте</em&gt; Гибридизации является одним из наиболее широко используемых методов в биологии развития. Здесь мы представляем высоким разрешением двумя люминесцентными<em&gt; На месте</em&gt; Гибридизации протокола для анализа точных выражению одного гена и для определения перекрытия выражение доменов двух генов. Протокол представляет собой модифицированную версию стандарта<em&gt; На месте</em&gt; Гибридизации с использованием щелочной фосфатазы и основания, такие как НБТ / BCIP и быстрая Красный<sup&gt; 1,2</sup&gt;. Этот протокол использует стандартные digoxygenin и флуоресцеина меченых зондов наряду с tyramide усиления сигнала (TSA)<sup&gt; 3</sup&gt;. Имеющиеся в продаже TSA комплекты позволяют гибко опытно-конструкторских как флуоресценции выбросов от зеленого до дальнего красного может быть использован в сочетании с различными ядерными пятна, такие как пропидий йодида или флуоресценции иммуногистохимии для белков. TSA производит реактивные флуоресцентного подложки, которая быстро ковалентно связывается с фрагментами, как правило, остатков тирозина, в непосредственной близости от меченых антисмысловых riboprobe. В результате окрашивания моделей высокого разрешения в этом субклеточные локализации мРНК можно наблюдать с помощью лазерной сканирующей конфокальной микроскопии<sup&gt; 3,4</sup&gt;. Можно наблюдать зарождающейся стенограммы на хромосомные локусы, различают ядерные и цитоплазматические окрашивания и визуализации других шаблонов, таких как корковой локализации мРНК. Исследования в<em&gt; Drosophila</em&gt; Показывают, что примерно 70% от мРНК выставку определенные шаблоны внутриклеточной локализацией, которые часто коррелирует с функцией закодированного белка<sup&gt; 5</sup&gt;. В сочетании с автоматизированной реконструкции 3D конфокальной наборов данных, наш протокол позволяет детальный анализ мРНК распределение с субклеточном разрешением в целых зародышей позвоночных.

Watch this Scientific Journal Video about Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization at JoVE.com

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Всего монтирования в гибридизация является одним из наиболее широко используемых методов в биологии развития. Здесь мы представляем высоким разрешением двумя люминесцентными на месте протокол гибридизации для анализа точных выражению одного гена и для определения перекрытия выражение доменов двух генов. Мы включаем пропидий йодида ответного ядерного пятно, чтобы выделить ткани организации.

Данио рерио Всего горе высокого разрешения двумя люминесцентными В Ситу Гибридизация

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

zebrafish-whole-mount-high-resolution-double-fluorescent-situ

Research

JoVE Journal

Biology

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

23.1K Views.  Yale University. Всего монтирования в гибридизация является одним из наиболее широко используемых методов в биологии развития. Здесь мы представляем высоким разрешением двумя люминесцентными на месте протокол гибридизации для анализа точных выражению одного гена и для опр...

Video: Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

Дважды Всего горе на месте гибридизация раннего куриных эмбрионов

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying antibody expression in developing brain, neural tube and somite. This video demonstrates the different steps in whole-mount antibody staining using HRP conjugated secondary antibodies; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, endogenous peroxidase is inactivated; The embryo is then exposed to primary antibody. After several washes, the embryo is incubated with secondary antibody conjugated to HRP. Peroxidase activity is revealed using reaction with diaminobenzidine substrate. Finally, the embryo is fixed and processed for photography and sectioning. The advantage of this method over the use of fluorescent antibodies is that embryos can be processed for wax sectioning, thus enabling the study of antigen sites in cross section. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell 1.

This video demonstrates whole mount immunohistochemistry, a method by which the spatial and temporal expression pattern of an antigen can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell.

Метод полного окрашивания антител горе в Чик

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Whole mount in situ hybridization (WISH) is a common technique in molecular biology laboratories used to study gene expression through the localization of specific mRNA transcripts within whole mount specimen. This technique (adapted from Albertson and Yelick, 2005) was used in an upper level undergraduate Comparative Vertebrate Biology laboratory classroom at Syracuse University. The first two thirds of the Comparative Vertebrate Biology lab course gave students the opportunity to study the embryology and gross anatomy of several organisms representing various chordate taxa primarily via traditional dissections and the use of models. The final portion of the course involved an innovative approach to teaching anatomy through observation of vertebrate development employing molecular techniques in which WISH was performed on zebrafish embryos. A heterozygous fibroblast growth factor 8 a (fgf8a) mutant line, ace, was used. Due to Mendelian inheritance, ace intercrosses produced wild type, heterozygous, and homozygous ace/fgf8a mutants in a 1:2:1 ratio. RNA probes with known expression patterns in the midline and in developing anatomical structures such as the heart, somites, tailbud, myotome, and brain were used. WISH was performed using zebrafish at the 13 somite and prim-6 stages, with students performing the staining reaction in class. The study of zebrafish embryos at different stages of development gave students the ability to observe how these anatomical structures changed over ontogeny. In addition, some ace/fgf8a mutants displayed improper heart looping, and defects in somite and brain development. The students in this lab observed the normal development of various organ systems using both external anatomy as well as gene expression patterns. They also identified and described embryos displaying improper anatomical development and gene expression (i.e., putative mutants).
For instructors at institutions that do not already own the necessary equipment or where funds for lab and curricular innovation are limited, the financial cost of the reagents and apparatus may be a factor to consider, as will the time and effort required on the part of the instructor regardless of the setting. Nevertheless, we contend that the use of WISH in this type of classroom laboratory setting can provide an important link between developmental genetics and anatomy. As technology advances and the ability to study organismal development at the molecular level becomes easier, cheaper, and increasingly popular, many evolutionary biologists, ecologists, and physiologists are turning to research strategies in the field of molecular biology. Using WISH in a Comparative Vertebrate Biology laboratory classroom is one example of how molecules and anatomy can converge within a single course. This gives upper level college students the opportunity to practice modern biological research techniques, leading to a more diversified education and the promotion of future interdisciplinary scientific research.

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Whole mount in situ hybridization (WISH) was used in an upper level undergraduate Comparative Vertebrate Biology course in addition to vertebrate dissections. This gave students the opportunity to study gene expression patterns as well as gross anatomy, linking the study of molecular and organismal biology within one course.

Использование Всего горе На месте Гибридизация в ссылку молекулярной биологии и организменном

Whole mount in situ hybridization (WISH) is a common technique in molecular biology laboratories used to study gene expression through the localization of ...

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures are lengthy and technically demanding with multiple important steps that collectively contribute to the quality of the final result. This protocol describes in detail several key quality control steps for optimizing probe labeling and performance. Overall, our protocol provides a detailed description of the critical steps necessary to reproducibly obtain high quality results. First, we describe the generation of digoxygenin (DIG) labeled RNA probes via in vitro transcription of DNA templates generated by PCR. We describe three critical quality control assays to determine the amount, integrity and specific activity of the DIG-labeled probes. These steps are important for generating a probe of sufficient sensitivity to detect endogenous mRNAs in a whole mouse embryo. In addition, we describe methods for the fixation and storage of E8.5-E11.5 day old mouse embryos for in situ hybridization. Then, we describe detailed methods for limited proteinase K digestion of the rehydrated embryos followed by the details of the hybridization conditions, post-hybridization washes and RNase treatment to remove non-specific probe hybridization. An AP-conjugated antibody is used to visualize the labeled probe and reveal the expression pattern of the endogenous transcript. Representative results are shown from successful experiments and typical suboptimal experiments.

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

This whole mount in situ hybridization protocol discusses critical steps that ensure reproducible high quality results for gene expression studies in E8.5-E11.5 day old mouse embryos.

Всего горы<em&gt; На месте</em&gt; Гибридизация E8.5 в E11.5 эмбрионов мыши

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 protein variants encoded by the var genes.
The haploid P. falciparum genome harbors approximately 60 different var genes of which only one has been believed to be transcribed per cell at a time during the blood stage of the infection. How such mutually exclusive regulation of var gene transcription is achieved is unclear, as is the identification of individual var genes or sub-groups of var genes associated with different receptors and the consequence of differential binding on the clinical outcome of P. falciparum infections. Recently, the mutually exclusive transcription paradigm has been called into doubt by transcription assays based on individual P. falciparum transcript identification in single infected erythrocytic cells using RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) analysis of var gene transcription by the parasite in individual nuclei of P. falciparum IE1.
Here, we present a detailed protocol for carrying out the RNA-FISH methodology for analysis of var gene transcription in single-nuclei of P. falciparum infected human erythrocytes. The method is based on the use of digoxigenin- and biotin- labeled antisense RNA probes using the TSA Plus Fluorescence Palette System2 (Perkin Elmer), microscopic analyses and freshly selected P. falciparum IE. The in situ hybridization method can be used to monitor transcription and regulation of a variety of genes expressed during the different stages of the P. falciparum life cycle and is adaptable to other malaria parasite species and other organisms and cell types.

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

Fluorescent in situ hybridization (FISH) to identify mRNA transcripts in individual cells allows analysis of polygenic activity such as the simultaneous transcription of more than one member of the var multigene family in Plasmodium falciparum infected erythrocytes 1. The technique is adaptable and can be used on different types of genes, cells and organisms.

Анализ одноклеточных транскрипции гена РНК-флуоресцентный<em&gt; В Situ</em&gt; Гибридизация (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The specification of replication timing is thought to be a dynamic process regulated by tissue-specific and developmental cues that are responsive to epigenetic modifications. However, the mechanisms regulating where and when DNA replication initiates along chromosomes remains poorly understood. Homologous chromosomes usually replicate synchronously, however there are notable exceptions to this rule. For example, in female mammalian cells one of the two X chromosomes becomes late replicating through a process known as X inactivation1. Along with this delay in replication timing, estimated to be 2-3 hr, the majority of genes become transcriptionally silenced on one X chromosome. In addition, a discrete cis-acting locus, known as the X inactivation center, regulates this X inactivation process, including the induction of delayed replication timing on the entire inactive X chromosome. In addition, certain chromosome rearrangements found in cancer cells and in cells exposed to ionizing radiation display a significant delay in replication timing of &gt;3 hours that affects the entire chromosome2,3. Recent work from our lab indicates that disruption of discrete cis-acting autosomal loci result in an extremely late replicating phenotype that affects the entire chromosome4. Additional 'chromosome engineering' studies indicate that certain chromosome rearrangements affecting many different chromosomes result in this abnormal replication-timing phenotype, suggesting that all mammalian chromosomes contain discrete cis-acting loci that control proper replication timing of individual chromosomes5.
Here, we present a method for the quantitative analysis of chromosome replication timing combined with fluorescent in situ hybridization. This method allows for a direct comparison of replication timing between homologous chromosomes within the same cell, and was adapted from6. In addition, this method allows for the unambiguous identification of chromosomal rearrangements that correlate with changes in replication timing that affect the entire chromosome. This method has advantages over recently developed high throughput micro-array or sequencing protocols that cannot distinguish between homologous alleles present on rearranged and un-rearranged chromosomes. In addition, because the method described here evaluates single cells, it can detect changes in chromosome replication timing on chromosomal rearrangements that are present in only a fraction of the cells in a population.

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

A quantitative method for the analysis of chromosome replication timing is described. The method utilizes BrdU incorporation in combination with fluorescent in situ hybridization (FISH) to assess replication timing of mammalian chromosomes. This technique allows for the direct comparison of rearranged and un-rearranged chromosomes within the same cell.

Хромосома Репликация времени в сочетании с Флуоресцентные<em&gt; В месте</em&gt; Гибридизация

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Assessing the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization properties of its transcribed RNA, are key features for understanding its biological function during development. RNA in situ hybridization (RNA-ISH) is a powerful method used for visualizing RNA distribution properties, be it at the organismal, cellular or subcellular levels 1. RNA-ISH is based on the hybridization of a labeled nucleic acid probe (e.g. antisense RNA, oligonucleotides) complementary to the sequence of an mRNA or a non-coding RNA target of interest 2. As the procedure requires primary sequence information alone to generate sequence-specific probes, it can be universally applied to a broad range of organisms and tissue specimens 3. Indeed, a number of large-scale ISH studies have been implemented to document gene expression and RNA localization dynamics in various model organisms, which has led to the establishment of important community resources 4-11. While a variety of probe labeling and detection strategies have been developed over the years, the combined usage of fluorescently-labeled detection reagents and enzymatic signal amplification steps offer significant enhancements in the sensitivity and resolution of the procedure 12. Here, we describe an optimized fluorescent in situ hybridization method (FISH) employing tyramide signal amplification (TSA) to visualize RNA expression and localization dynamics in staged Drosophila embryos. The procedure is carried out in 96-well PCR plate format, which greatly facilitates the simultaneous processing of large numbers of samples.

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Here we describe a whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol for determining the expression and localization properties of RNAs expressed during embryogenesis in the fruit fly, Drosophila melanogaster.

Всего горы РНК Флуоресцентные<em&gt; На месте</em&gt; Гибридизация<em&gt; Drosophila</em&gt; Эмбрионы

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

Marine elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity and have unique mechanisms for osmoregulation 1-3. As the most primitive living jawed-vertebrates with paired appendages, elasmobranchs are an evolutionarily important model, especially for studies in evolution and development. Marine elasmobranchs have also been used to study aquatic toxicology and stress physiology in relationship to climate change 4. Thus, development and adaptation of methodologies is needed to facilitate and expand the use of these primitive vertebrates to multiple biological disciplines. Here I present the successful adaptation of RNA whole mount in situ hybridization and histological techniques to study gene expression and cell histology in elasmobranchs.
Monitoring gene expression is a hallmark tool of developmental biologists, and is widely used to investigate developmental processes 5. RNA whole mount in situ hybridization allows for the visualization and localization of specific gene transcripts in tissues of the developing embryo. The expression pattern of a gene's message can provide insight into what developmental processes and cell fate decisions a gene may control. By comparing the expression pattern of a gene at different developmental stages, insight can be gained into how the role of a gene changes during development.
While whole mount in situ's provides a means to localize gene expression to tissue, histological techniques allow for the identification of differentiated cell types and tissues. Histological stains have varied functions. General stains are used to highlight cell morphology, for example hematoxylin and eosin for general staining of nuclei and cytoplasm, respectively. Other stains can highlight specific cell types. For example, the alcian blue stain reported in this paper is a widely used cationic stain to identify mucosaccharides. Staining of the digestive tract with alcian blue can identify the distribution of goblet cells that produce mucosaccharides. Variations in mucosaccharide constituents on short peptides distinguish goblet cells by function within the digestive tract 6. By using RNA whole mount in situ's and histochemical methods concurrently, cell fate decisions can be linked to gene-specific expression.
Although RNA in situ's and histochemistry are widely used by researchers, their adaptation and use in marine elasmobranchs have met limited and varied success. Here I present protocols developed for elasmobranchs and used on a regular basis in my laboratory. Although further modification of the RNA in situ's hybridization method may be needed to adapt to different species, the protocols described here provide a strong starting point for researchers wanting to adapt the use of marine elasmobranchs to their scientific inquiries.

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

By combining methods for RNA whole mount in situ hybridization and histology, gene expression can be linked with cell fate decisions in the developing embryo. These methods have been adapted to marine elasmobranchs and facilitate the use of these animals as model organisms for biomedical, toxicology and comparative studies.

РНК<em&gt; В месте</em&gt; Гибридизации эмбрионов Всего в гору и сотовых гистологии адаптированный для морских хрящевых рыб

Marine  elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as  they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity ...

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression both in terms of tissue distribution and developmental stage. Protocols are described for the use of WISH of zebrafish embryos using antisense RNA probes labeled with digoxigenin. Probes are generated by incorporating digoxigenin-linked nucleotides through in vitro transcription of gene templates that have been cloned and linearized. The chorions of embryos harvested at defined developmental stages are removed before incubation with specific probes. Following a washing procedure to remove excess probe, embryos are incubated with anti-digoxigenin antibody conjugated with alkaline phosphatase. By employing a chromogenic substrate for alkaline phosphatase, specific gene expression can be assessed. Depending on the level of gene expression the entire procedure can be completed within 2-3 days.

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

The zebrafish, a small tropical fish, has become a popular model for studying gene function during vertebrate development and disease. The temporal and spatial expression of target genes can be determined by in situ hybridization. Our improved protocol allows for the detection of low abundant transcripts with low non-specific background signal.

Высокое разрешение Всего горе<em&gt; В Ситу</em&gt; Гибридизация в Эмбрионы рыбок данио изучить экспрессию генов и функции

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...

Analysis of Apoptosis in Zebrafish Embryos by Whole-mount Immunofluorescence to Detect Activated Caspase 3

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis in zebrafish embryos. The whole-mount analysis provides spatial information in regard to tissue specificity of apoptosing cells, although sectioning and/or colabeling is ultimately required to pinpoint the exact cell types undergoing apoptosis. The whole-mount Casp3 assay is optimized for analysis of fixed embryos between the 4-cell stage and 32 hr-post-fertilization and is useful for a number of applications, including analysis of zebrafish mutants and morphants, overexpression of mutant and wild-type mRNAs, and exposure to chemicals. Compared to acridine orange staining, which can identify apoptotic cells in live embryos in a matter of hours, Casp3 and TUNEL assays take considerably longer to complete (2-4 days). However, because of the dynamic nature of apoptotic cell formation and clearance, analysis of fixed embryos ensures accurate comparison of apoptotic cells across multiple samples at specific time points. We have also found the Casp3 assay to be superior to analysis of apoptotic cells by the whole-mount TUNEL assay in regard to cost and reliability. Overall, the Casp3 assay represents a robust, highly reproducible assay in which to analyze apoptotic cells in early zebrafish embryos.

Certain genetic perturbations or exposure to toxins can disrupt normal developmental processes leading to death of specific cell types. The analysis of activated Caspase 3 by whole-mount immunofluorescence in zebrafish embryos reveals stage- and tissue-specific localization of cells specifically undergoing apoptosis.

Анализ апоптоза у эмбрионов данио рерио по целом монтажа иммунофлуоресценции для обнаружения активированного каспазы 3

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis ...