Целая монтированная иммуногистохимия является относительно быстрым и простым методом, который позволяет осуществлять пространственное и временное наблюдение белков непосредственно в тканях или организме с использованием помеченных антител. Полезность этого метода заключается в том, что он позволяет окрашивание нетронутой ткани или организма без необходимости первого раздела его и конфокальная микроскопия может быть использована для создания трехмерного представления шаблона экспрессии белка. Иммуногистохимия широко используется в биомедицинских исследованиях для понимания этиологии и молекулярных механизмов, которые лежат в основе болезни.
Это также ценный диагностический инструмент для выявления опухолей в патологических образцах. Для начала подготовьте нерестовые резервуары, наполненные системной водой и с помощью сетки или прорези лайнера на месте. Поместите взрослых зебрафиш смешанных половых пар в группах в танках на ночь.
Используйте 14-часовой/10-часовой световой/темный цикл с включенными огнями в 9 часов .m. На следующее утро, с включенным светом, изменить нереста цистерны воды с пресной системой воды для удаления кала. После того, как яйца откладываются, вернуть взрослых домой танки.
Соберите яйца, рисуя их с помощью передачи пипетки. Перенесите 50 яиц в каждую чашку Петри, заполненную на полпути со средой эмбриона. Удалите любые непрозрачные и мутные яйца, которые мертвы или не смогли разделить.
Инкубировать блюдо из яиц при 28,5 градусов по Цельсию до 23 часов после оплодотворения. Если эмбрионы старше 24 часов после оплодотворения, с пипеткой передачи эмбрионов 200 микромоляных ПТУ в среде эмбриона для предотвращения меланогенеза. Под стерео микроскопом, dechorionate unhatched эмбрионов с помощью ультра тонкой типсов отзыв.
Используя полированные огнем пипетки Pasteur, чтобы свести к минимуму повреждения, перенесите их в стеклянные или пластиковые чашки Петри, покрытые 1-2%agarose растворяется в среде эмбриона. Затем перенесите эмбрионы в 1,5 миллилитровые центрифуги с помощью пластиковой или огнеполированной пипетки. Удалить эмбриона среды с помощью микропипетта.
Оставьте только достаточно жидкости, чтобы просто покрыть эмбрионы. Исправить эмбрионы в 4%PFA в течение одного-двух часов с нежным качания при комнатной температуре. Затем мыть эмбрионы три раза в 1X PBS и 1%PBTriton в течение пяти минут.
Используйте эмбрионы немедленно или хранить при четырех градусах по Цельсию в течение одной недели. Для длительного хранения обезвоживают и хранят эмбрионы в 100% метаноле при температуре минус 20 градусов по Цельсию. Для регидратации эмбрионов, выполнять серийные инкубации пять минут каждый при комнатной температуре с уменьшением количества метанола и PBS и PBTriton для окончательного мытья.
Продолжить подготовку эмбриона в соответствии с рукописью. Выберите блокирующий раствор, соответствующий вторичным видам антител, например, сыворотке 10%goat в PBTriton с или без двух миллиграммов на миллилитр BSA. Добавьте 0,5 миллилитров блокирующего раствора в трубку, содержащую эмбрион, и поместите трубку на рокер в течение одного-трех часов при комнатной температуре.
Затем инкубировать эмбрион в первичных антител, разбавленных в блокирующий раствор и PBTriton ночь на четыре градуса по Цельсию во время качания. Утром мыть эмбрион пять раз в PBTriton в течение 10 минут каждый при комнатной температуре во время качания. Затем выберите вторичное антитело на основе вида-хозяина первичного антитела и желаемой длины волны на 488 нанометров.
Добавьте вторичное антитело, разбавленное блокирующим раствором, в трубку, содержащую эмбрион. Обложка трубки с алюминиевой фольгой и инкубировать в течение двух часов при комнатной температуре во время качания. После этого, мыть эмбрионы три раза в PBTriton в течение 10 минут каждый при комнатной температуре в то время как покрыты алюминиевой фольгой и качания.
С пипеткой, перенести эмбрионы на 50% глицерол раствор в PBS над кроватью 2%agarose в эмбрионе среды. Чтобы удалить желток, перенесите 200 микролитров 1X PBS на слайд депрессии или простой стеклянный слайд. Используйте пластиковую трубу для переноса одного или нескольких эмбрионов в капельу PBS.
Используйте ультра тонкие миппы и двойные нулевые булавки насекомых, чтобы разбить желток и очень осторожно соскребать гранулы желтка с брюшной поверхности эмбриона. Удалите желток гранулы и пополнить PBS по мере необходимости. После монтажа поместите образец на сцену микроскопа.
Найдите область интереса, выбрав относительно яркий пример. Отрегулируйте экспозицию камеры и на получите так, чтобы сигнал был достаточно ярким без насыщения. Сравнивая экспериментальные эмбрионы с маркировкой антител и контроль над эмбрионами антител, используйте те же настройки экспозиции.
Этот протокол целой монтировать иммуногистохимии является ценным инструментом для изучения пространственной и височной экспрессии белка с использованием развития зебры. Подразделение GluN1 глутаматного рецептора типа NMDA выявило экспрессию подразделений рецепторов глутамата на протяжении всего развития мышц зебры в течение 23 часов после оплодотворения. Замороженные участки 72-часовых эмбрионов после оплодотворения были установлены на слайдах и иммунотелены для фосфо-H3, маркера размножающихся клеток.
Несколько клеток выразили фосфо-H3 и выражение было наиболее заметным в желудочковых зонах. Мышь IgG контроля антител и за исключением первичных антител показали низкий уровень неспецифического выражения. Важно выбрать соответствующие блокирующие решения и вторичные антитела на основе первичных антител принимающих видов, чтобы обеспечить обнаружение и свести к минимуму неспецифическое окрашивание.
Иммуногистохимия должна быть проверена, чтобы убедиться, что сигнал наблюдается на самом деле белок интереса. Последующие эксперименты обычно включают использование генетически или экологически модифицированных организмов. Иммуногистохимия предоставляет исследователям возможность наблюдать белки на месте, значительно ускоряя наше понимание многочисленных систем как в основной, так и прикладной биологии, особенно во время развития эмбриона.
Метанол и формальдегид токсичны и должны быть обработаны тщательно. Отходы должны собираться и утилизироваться в соответствии с институциональными процедурами.
