Biz bu protokolü geliştirme Dörthe Jülich, Jennifer Yuvarlak ve Andrew Mara katkılarını kabul etmek istiyorum. NICHD, Amerikan Kanser Derneği ve Dimes Mart tarafından sağlanan araştırma desteği.

1. FİKSASYON <ol><li> Fix 4 geceleme embriyolar ° C PBS içinde% 4 paraformaldehid (PFA). </li><li> Kaldır düzeltmek ve oda sıcaklığında (RT) 2 x PBS, her 5 dakika yıkayın. </li><li> Saatçi forseps kullanarak bir bardak depresyon plaka PBS Manuel dechorionate embriyolar. Polipropilen pipetler yapışabilir dechorionation sonra, embriyolar bir yangın parlatılmış cam Pasteur pipeti kullanılarak aktarılır. </li><li> Her 5 dakika için bir dizi% 25,% 50 ve PBS içinde% 75 metanol ile embriyo transferine. </li><li> % 100 metanol ile sıvı değiştirin, inkübasyon ve 5 dakika sonra taze metanol ile değiştirin. </li><li> En az bir saat için -20 ° C&#39;de Yeri embriyolar. (Biz genellikle in situ hibridizasyon Standart bir yıldan daha fazla süre saklanan embriyolar üzerinde çalışacak. Gecede embriyoların inkübe, ancak biz değil, uzun süreli depolama floresan in situ hibridizasyon yüksek çözünürlüklü kayıp olup olmadığı incelenir.) </li><li> 5 dakika% 75,% 50,% 25 RT PBST metanol embriyolar yıkayın. RT az 5 dakika PBST içinde her biri için iki kez yıkayın. </li><li> 4 RT PBS içinde% PFA 20 dakika için tekrar sabitleyin. </li><li> RT az 5 dakika PBST içinde her biri için iki kez yıkayın. </li></ol> PFA İLGİLİ NOT: (Reaktiflerin tabloya bakınız), -20 º C&#39;de alikotları% 4 PFA depolar. Ilk sabitleme için, biz sadece daha önceden çözülmüş olmamıştı PFA kullanabilirsiniz. Sonraki tespitler, genellikle daha önceden çözülmüş olduğunu PFA kullanmak. Ilk fiksasyon bu protokol ile başarılı bir şekilde boyanması için kritik görünüyor. 2. Proteinaz ve Postfiksasyon <ol><li> Embriyoların permeabilize 3 ila 12 dakika RT proteinaz K (PBST içinde 5μg/ml) ile Digest. (Inkübasyon süresi, genç aşamalarında daha duyarlı olmaları nedeniyle embriyoların yaşına bağlıdır. Aynı zamanda, enzim toplu bağlıdır.) Somitogenesis dönem embriyoların için, genellikle 3-4 dakika permeabilize. Bu İnkübasyon sırasında, mikrosantrifüj tüp yan yattı. </li><li> PBST kısaca durulayın ve PBST 5 dakika için bir kez yıkayın. </li><li> 4 RT PBS içinde% PFA 20 dakika için tekrar sabitleyin. </li><li> RT PBST, her 5 dakika için, iki kez yıkayın. </li></ol> 3. PREHYBRIDIZATION <ol><li> Embriyoların 65 º C&#39;de 5 dakika inkübe HYB. </li><li> HYB en az 1 saat 65 º C&#39;de Prehybridize. </li></ol> 4. Melezleme <ol><li> Ama preHYB 50 ul çıkarın, ancak tamamen sular altında embriyolar tutmak için emin olun. </li><li> Tüp hafifçe Flicking embriyo ve karıştırmak için her Spastine Özgü Riboprop 1-2 ul (digoxygenin ve floresein etiketli riboprobes) ekleyin. Prob miktarı genellikle 1-2μl 20μl prob sentez reaksiyonu. </li><li> Floresein ışığa duyarlı olduğu göz önüne alındığında, tüpler alüminyum folyo ile sarılmış veya başka bir şekilde bu noktadan itibaren en az ışığa maruz olmalıdır. </li><li> Embriyoların gece 65 º C&#39;de inkübe </li></ol> 5. PROBE GİDERİLMESİ Bu noktadan ileriye eksikliği deterjan çözümler unutmayın. Deterjan giderilmesi boyama reaksiyonları yardımcı olmak için görünür ama embriyoların oldukça yapışkan hale neden. <ol><li> Spastine Özgü Riboprop çıkarın. </li><li> 65 º C&#39;de% 50 formamide/2xSSC içinde 2 x 30 dakika yıkayın. </li><li> 2 x SSC 65 º C&#39;de 15 dakika süreyle yıkayın. </li><li> 0.2 x SSC - 65 º C &#39;de 30 dakika süreyle yıkayın. </li></ol> 6. ANTİ-floresein ANTİKOR KULUÇKA <ol><li> 1x maleik asit tampon artı% 2 engelleme reaktifi (reaktiflerin tabloya bakınız) bir çözüm 500μl oda sıcaklığında en az 1 saat Blok. </li><li> Roche tarafından verilen anti-Floresein-POD antikor, 1:500 dilüsyon engelleme çözüm ekleyin. </li><li> 4 º C&#39;de bir gece inkübe Bu İnkübasyon sırasında, mikrosantrifüj tüp yan yattı. </li><li> 1x maleik asit tampon 4 x 20 dakika yıkayın. PBS içinde her 5 dakika için iki kez yıkayın. </li></ol> 7. Floresein Etiketli SONDA VE ALGILAMA <ol><li> TSA Plus Floresein Çözüm 30-60 dakika inkübe edin. (Reaksiyon için boyama çözüm yapmadan önce TSA substrat aşağı Spin tyramide reaktif Perkin Elmer amplifikasyon seyreltici tampon 01:50 sulandırmak.) Bu kuluçka sırasında, yan mikrosantrifüj tüp yatıyordu. Reaksiyon zamanı, her sonda için ampirik olarak tespit edilmelidir. Ne yazık ki, boyama reaksiyon yüzey floresan gibi görsel olarak izlenebilir edemez ve bir boyama reaksiyon boyunca her yerde yeşil floresan göreceksiniz. </li><li> % 30,% 50,% 75 ve% 100 PBS içinde metanol her biri için 10 dakika yıkayın. </li><li> Ilk peroksidaz inaktive etmek için 30 dakika boyunca metanol,% 1 H 2 0 2 bir çözüm inkübe edin . </li><li> % 75,% 50 ve% 30 metanol PBS içinde her biri 10 dakika yıkayın. Sonra her biri 10 dakika PBS içinde iki kez yıkayın. Bu önemli olduğunu görüştü, tümhanol kaldırıldı. </li></ol> TYRAMIDE SİNYAL YÜKSELTME İLE İLGİLİ NOTLAR: Biz Perkin Elmer TSA Kitleri kullanıyoruz. Alexa-Tyramide yüzeyler Perkin Elmer amplifikasyon seyreltici tampon kullanarak leke olduğunu bulmak, ama biz Invitrogen / Moleküler Problar Kitleri ile sağlanan boyama tampon kullanarak başarılı olmadı. Son olarak, floresein ve Alexa-647 etkilenmez Cy5 floresan sonraki Metanol / H 2 O 2 tedavisi ile ortadan olduğunu bulduk. Cy3 yapısal Cy5 ile ilgili olarak Metanol / H 2 O 2 tedavisi de olumsuz etkilenebilir. Bu nedenle, Cy3 ve Cy5 TSA reaksiyonlar sadece bir çift floresan in situ protokolde ikinci boyama reaksiyon için kullanılan olmalıdır. 8. ANTİ-Digoxygenin ANTİKOR KULUÇKA <ol><li> 1x maleik asit tampon artı% 2 engelleme reaktif bir çözüm oda sıcaklığında en az 1 saat embriyoların tekrar engelleyin. </li><li> Yukarıdaki çözüm engelleme 1:1000 dilüsyon Roche tarafından verilen anti-DIG POD antikor ekle </li><li> 4 º C&#39;de bir gece inkübe Bu İnkübasyon sırasında, mikrosantrifüj tüp yan yattı. </li><li> 1x maleik asit tampon 4 x 20 dakika yıkayın. PBS içinde her 5 dakika için iki kez yıkayın. </li></ol> 9 - Digoxygenin Etiketli SONDA VE ALGILAMA <ol><li> (TSA substrat aşağı boyama çözüm yapmadan önce Spin reaksiyonu, amplifikasyon seyreltici tampon tyramide reaktif 01:50 sulandırmak) TSA Plus Cy5 Çözüm 30-60 dakika inkübe bu kuluçka sırasında, yan mikrosantrifüj tüp yatıyordu. Reaksiyon zamanı, her sonda için ampirik olarak tespit edilmelidir. </li><li> PBST içinde her 10 dakikada üç kez yıkayın. </li></ol> 10 Propidium iyodür BOYAMA <ol><li> 2 x SSC her 5 dakika için iki kez yıkayın. </li><li> 37 az 30 dakika boyunca inkübe embriyolar ° C, 10 ul RNAse (100μg/ml son bir konsantrasyon için) ile 50 ul 2 x SSCT. </li><li> RT az 2 x SSC her 3 dakikada altı kez yıkayın. </li><li> 8 dakika 2 x SSC 330μg/ml propidium iyodür bir çözüm için embriyolar Leke. </li><li> RT az 2 x SSC her 3 dakikada altı kez yıkayın. </li><li> 4 oda sıcaklığında PBS içinde% PFA 20 dakika saptamak için. </li><li> RT PBST, her 5 dakika için, iki kez yıkayın. </li></ol> 11. MONTAJ <ol><li> Embriyoların her biri% 25 ve PBST% 50 gliserol 10 dakika inkübe edin. 4 º C&#39;de% 75 gliserol gecede temizleyin </li><li> Biz incelemek ve deyolk embriyoların ve düz bir mikroskop lamı üzerine monte. Yumurta sarısı önemli bir eşiğe üretebilir. Diseksiyon embriyolar gylcerol ovenight temizlenir sonra çok daha kolay. </li></ol> ÇÖZÜMLER: <table border="1"><tbody><tr><td> PBST </td><td> PBS artı% 0.1 Tween </td><td></td></tr><tr><td> SSCT </td><td> SSC artı% 0.1 Tween </td><td></td></tr><tr><td> HYB- </td><td> 50% formamid 5xSSC % 0.1 Tween-20 </td><td></td></tr><tr><td> HYB + </td><td> HYB- 5mg/ml Torula (maya) RNA 50μg/ml heparin </td><td style="width: 300px;"> Torula RNA RNA proteinaz K sindirimi tarafından hazırlanan sonraki fenol, fenol-kloroform ve kloroform-extraction.The RNA çöktürülmüş ve DEPC arıtılmış su içinde çözünmüş. </td></tr><tr><td> 1 x maleik asit tampon </td><td> 150mm maleik asit, 100 mM NaCl (pH 7.5) </td><td></td></tr></tbody></table><img src="/files/ftp_upload/1229/Brend_Holley_Fig1.png" alt="Şekil 1" width="600" height="688" /> Şekil 1 tüm montaj Temsilcisi sonuçları çift floresan in situ hibridizasyon. (AC). Görüntüler zebrafish on hücre gruplarının aşamada embriyo posterior bölge üzerinden tek bir konfokal bölümünde gösteriyor. Görünümü, üst anterior ile birlikte dorsal. Propidium iyodür ile Çekirdekler boyanmış mavi renkli. (A) deltaC mRNA bir digoxygenin etiketli Spastine Özgü Riboprop ve TSA-Cy5 reaktif kullanılarak tespit edildi. (B) her1 gen transkripsiyonu mRNA bir floresein etiketli Spastine Özgü Riboprop ve TSA-floresein reaktifi ile tespit edildi. (C) net bir şekilde yeşil ve kırmızı kanalları birleştirme iki gen veya örtüşen farklı gen ifade bölgeleri tanımlar. (D, E) Bu prosedürün yüksek çözünürlük göstermektedir. Her1 ifade Detay MRNA hücre içi lokalizasyonu açıkça ayırt edilebilir. Arrowheads çekirdeğinde boyama noktalar ortaya koyduğu aktif transkripsiyon sergileyen bir hücre göstermektedir. Oklar mRNA sitoplazmik lokalizasyon gösteren bir hücre göstermektedir. Her1 ve deltaC için (F, G) Çift boyama, hem genler (beyaz ok ucu), ya da ayrı ayrı gen (kırmızı ve yeşil ok başları) transkripsiyonu hücreleri ortaya koymaktadır .

<ol>
	<li>Schulte-Merker, S., Ho, R. K., Herrmann, B. G., N&#252;sslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+product+of+the+zebrafish+homologue+of+the+mouse+T-gene+is+expressed+in+nuclie+of+the+germ+ring+and+the+notochord+of+the+early+embryo.">The protein product of the zebrafish homologue of the mouse T-gene is expressed in nuclie of the germ ring and the notochord of the early embryo.</a> Development. 116, 1021-1027 (1992).</li><li>Jowett, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+in+situ+hybridization+techniques+in+zebrafish.">Double in situ hybridization techniques in zebrafish.</a> Methods. 23, 345-358 (2001).</li><li>J&#252;lich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beamter/deltaC+and+the+role+of+Notch+ligands+in+the+zebrafish+somite+segmentation,+hindbrain+neurogenesis+and+hypochord+differentiation.">beamter/deltaC and the role of Notch ligands in the zebrafish somite segmentation, hindbrain neurogenesis and hypochord differentiation.</a> Dev Biol. 286, 391-404 (2005).</li><li>Mara, A., Schroeder, J., Chalouni, C., Holley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Priming,+Initiation+and+Synchronization+of+the+Segmentation+Clock+by+deltaD+and+deltaC.">Priming, Initiation and Synchronization of the Segmentation Clock by deltaD and deltaC.</a> Nat Cell Biol. 9, 523-530 (2007).</li><li>Lecuyer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+mRNA+localization+reveals+a+prominent+role+in+organizing+cellular+architecture+and+function.">Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function.</a> Cell. 131, 174-187 (2007).</li></ol>

Burada sunulan protokol tipik bir alkalin fosfataz aracılı reaksiyon 30-45 dakika boyandıktan sonra temiz ve güçlü bir sinyal vermek problar ile iyi çalışır. Floresan in situ hibridizasyon protokolü performans öncesinde, her zaman bizim probları standart floresan olmayan protokolü (prob sentezi protokolü ile birlikte tamamlayıcı malzeme) kullanarak test edin. Zayıf problar kullanarak, floresan in situ hibridizasyon protokol az başarı oldu, ama bazı durumlarda mümkün olabilir. Β-katenin 3</su...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Paraformaldehyde 16% solution, EM Grade</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Services</td>
<td>15710</td>
<td>Dilute to 4% in 1.33x PBS (final 1x). Store in 2ml aliquots at &#x2013;20&deg;C</td>
</tr>
<tr>
<td>Proteinase K, recombinant PCR grade</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>03115879001</td>
<td>Make a 20mg/ml stock solution in water. Store in 1ml aliquots at &#x2013;20&deg;C</td>
</tr>
<tr>
<td>Blocking Reagent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>11096176001</td>
<td>Make a 10% stock solution in 1x maleic acid buffer. Store in 50ml aliquots at &#x2013;20&deg;C. Stable over multiple freeze/thaws.</td>
</tr>
<tr>
<td>Anti-Fluorescein-POD, Fab fragments</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>11426346910</td>
<td>Aliquot and store at -20&deg;C. Keep one working aliquot at 4&deg;C.</td>
</tr>
<tr>
<td>Anti-Digoxigenin-POD, Fab fragments</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>11207739910</td>
<td>As above.</td>
</tr>
<tr>
<td>TSA Plus Fluorescein system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Perkin Elmer</td>
<td>NEL741001KT</td>
<td>Prepare each vial of TSA reagent only when needed. Dissolve in 60&mu;l DMSO. Store at 4&deg;C.</td>
</tr>
<tr>
<td>TSA Plus Cyanine5 system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Perkin Elmer</td>
<td>NEL745001KT</td>
<td>As above</td>
</tr>
<tr>
<td>TSA Plus Cyanine3 system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Perkin Elmer</td>
<td>NEL744001KT</td>
<td>As above</td>
</tr>
<tr>
<td>TSA Kit #16 AlexaFluor647 tyramide (plus HRP-goat-anti-rabbit IgG)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Probes /Invitrogen</td>
<td>T20926</td>
<td>Dissolve tyramide reagent in 150&mu;l DMSO, aliquot and store at &#x2013;20&deg;C.</td>
</tr>
<tr>
<td>RNase, DNase free</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>11119915001</td>
<td>Supplied as 500&mu;g/ml solution</td>
</tr>
<tr>
<td>Propidium Iodide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Probes /Invitrogen</td>
<td>P-3566</td>
<td>Supplied as 1mg/ml solution in water.</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

zebrafish whole mount high-resolution double fluorescent in situ hybridization

Tüm montaj<em&gt; In situ</em&gt; Hibridizasyon gelişim biyolojisi en yaygın olarak kullanılan teknikleri biridir. Burada, yüksek çözünürlüklü bir çift floresan mevcut<em&gt; In situ</em&gt; Hibridizasyon, tek bir genin kesin ifadelerde desen analiz ve iki gen ifadesi etki çakışma belirlenmesi için protokol. Protokol, standart modifiye edilmiş bir versiyonu<em&gt; In situ</em&gt; Hibridizasyon kullanarak alkalin fosfataz ve NBT / BCIP ve Hızlı Kırmızı gibi yüzeylerde<sup&gt; 1,2</sup&gt;. Bu protokol tyramide sinyal amplifikasyon (TSA) ile birlikte standart digoxygenin ve flöresein etiketli probları kullanır<sup&gt; 3</sup&gt;. Piyasada bulunan TSA kitleri uzak kırmızı yeşil floresan emisyon olarak esnek bir deneysel tasarım propidium iyodür veya proteinler için floresan immünohistokimya gibi çeşitli nükleer lekeleri ile birlikte kullanılabilir izin verir. TSA hızlı kovalent etiketli antisens Spastine Özgü Riboprop hemen yakınında, moieties genellikle tirozin kalıntılarının bağlanır reaktif bir floresan substrat üretir. Konfokal mikroskobi lazer tarama kullanarak boyanma mRNA bu hücre içi lokalizasyonu yüksek çözünürlükte görülebilir<sup&gt; 3,4</sup&gt;. Bir kromozom bölgeleri, doğmakta olan transkript gözlemlemek nükleer ve sitoplazmik boyanma ayırt ve mRNA kortikal lokalizasyon gibi diğer desen görselleştirmek. Yapılan çalışmalar<em&gt; Drosophila</em&gt; MRNA&#39;ların kabaca% 70, sık sık kodlanmış proteinin fonksiyonu ile korelasyon Subselüler localisation özel kalıplara uyduğunu gösterir<sup&gt; 5</sup&gt;. 3D konfokal veri setleri, bilgisayar destekli bir yeniden yapılanma ile birlikte kullanıldığında, bütün omurgalı embriyolarının alt hücresel çözünürlük ile mRNA dağıtım protokolü detaylı analiz sağlar.

Watch this Scientific Journal Video about Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization at JoVE.com

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

In situ hibridizasyon Tüm montaj, gelişim biyolojisi en yaygın olarak kullanılan teknikleri biridir. Burada, tek bir genin kesin ifadelerde desen analiz ve iki genin ifadesi etki çakışma belirlenmesi için çift floresan in situ hibridizasyon protokol yüksek çözünürlüklü sunuyoruz. Biz bir doku organizasyon vurgulamak için propidium iyodür nükleer karşı leke içerir.

Zebra balığı Tüm Dağı Yüksek Çözünürlüklü Çift Floresan Yerinde Hibridizasyon

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

zebrafish-whole-mount-high-resolution-double-fluorescent-situ

Research

JoVE Journal

Biology

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

23.1K Görüntüleme.  Yale University. In situ hibridizasyon Tüm montaj, gelişim biyolojisi en yaygın olarak kullanılan teknikleri biridir. Burada, tek bir genin kesin ifadelerde desen analiz ve iki genin ifadesi etki çakışma belirlenmesi için çift floresan in situ hibridizasyon protokol yüksek çözünürlüklü sunuyoruz. Biz bir doku organizasyon vurgulamak için propidium iyodür nükleer karşı leke içerir.