Эта работа была поддержана финансирование в RAW из следующих функций: NIH гранты K01 DK083512, DP2 OD008470 и R01 DK100237; Марш Dimes Василий О&#39;Коннор Стартер Академия Award # 5-FY12-75; запуска средства из Университета Нотр-Дам колледж науки и Отделения биологических наук; и щедрый подарок в Университет Нотр-Дам от Элизабет и Майкл Галлахер от имени Галлахер семьи, чтобы способствовать исследования стволовых клеток. Доноры не было никакой роли в дизайн исследования, сбор и анализ данных, решение о публикации или подготовки рукописи. Мы благодарим штабы Отделения биологических наук за их поддержку, и Центр данио рерио исследований в Нотр-Дам за их выдающуюся преданность в обслуживании и благосостояния нашей данио колонии. Мы благодарим GF Герлах для принятия фотографии, предоставленные на рисунке 4. Наконец, мы благодарим всех членов нашей исследовательской лаборатории для своих комментариев, дискуссий и InsigHTS об этой работе.

ПРИМЕЧАНИЕ: Процедуры для работы с эмбрионов рыбок данио, описанных в этом протоколе были утверждены Комитетом Институциональная уходу и использованию животных в Университете Нотр-Дам на. ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на то следующий протокол обеспечивает демонстрацию изоляции спермы, которая включает эвтаназию мужчин, сперма может быть сбор из половых поры наркозом живут мужской данио использованием нежный внутрибрюшного давления и микрокапилл для сбора спермы 17,18. Сжатие живых мужчин требует нескольких мужчин, которые будут использоваться для того, чтобы собрать эквивалентное количество спермы, которую можно получить от одного эвтаназии мужского 17,18. Тем не менее, мужчины, которые подверглись сжимая остаются вполне здоровым и может быть использован для физических вязки или последующих процедур в пробирке 17. Всякий раз, когда это возможно, выбранные процедуры следует свести к минимуму ненужные рыбы жертву. 1. Приготовление растворов и рыбок данио стыковочных палат &lt;ол&gt; <li> Подготовка исходных растворов Хэнка (№ 1, 2, 4, 6) и Хэнка предварительный раствор (см. таблицу материалы) 19, то автоклав и хранить при температуре 4 ° C. </li><li> Выберите нужный номер взрослого данио женщина (ы) для гаплоидного коллекции сцепления. ПРИМЕЧАНИЕ: На основе опыта, используя мутагенизированных F1, состоящий из врожденного Тюбинген штамма рыбок данио, около 50% половозрелых самок были «податливый» в среднем после грунтования их, помещая их в брачный клетке ночь с мужчиной - то есть сцепление было получено с помощью процедуры сжимая - и большинство этих муфт (в диапазоне от 70-90%) производится жизнеспособных гаплоиды. С двумя исследователями, выполняющих гаплоиды подготовку, около 80 взрослых женщин F1 данио можно выжать в одно утро. Для вычисления реагенты, необходимые для гаплоидный эксперименте фактора в обоих скорости сжатия в поколении F1 и количество исследователей доступных для выполнения ехрeriment. Имейте в виду, что количество женщин, которые будут производить высококачественные гаплоидных муфты является чрезвычайно переменным, с различия, наблюдаемые между данио самок различных штаммов, возрастов и диетическое питание 15. </li><li> Подготовка спаривания клетки, помещая каждую взрослых данио женщина с взрослого мужского рыбок данио в камере системы водой так, чтобы они разделены делителя на ночь. ПРИМЕЧАНИЕ: Женщины должны подвергаться мужчины на ночь в расцвете сил, или подготовить их, для нереста через сжатия. </li></ol> 2. Рассечение семенников <ol><li> Сделать Хэнка маточного раствора # 6 свежих добавлением 0,35 г бикарбоната натрия в 10 мл дистиллированной воды. Все хорошо перемешать, чтобы растворить порошок бикарбоната натрия. </li><li> Объедините следующие в трубке на льду для того, чтобы Окончательная рабочий раствор буферизированные Хэнка для спермы: 9,9 мл Хэнкс Премикс I 100 мкл исходного раствора № 6. </li><li> Тщательно перемешать, затем аликвоту 500 мкл Хэнк7; ы Заключительный рабочий раствор в микроцентрифужную пробирку и место на льду. ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый 500 мкл аликвоты будет использоваться для подготовки спермы из яичек 4-5 мужского рыбок данио. </li><li> Выберите между 4-5 мужского рыбок данио для каждого урожая спермы. ПРИМЕЧАНИЕ: Это будет урожай достаточно спермы, чтобы собираться, обрабатываться и храниться в одном 1,5 мл трубки микроцентрифужных, которые могут быть использованы для оплодотворения около 15 гаплоидных муфты. Выберите дополнительные когорты мужчин, чтобы подготовить дополнительные трубки в зависимости от масштаба эксперимента. Если выбранный мужской данио малы или рассечение яички является неполным, обычно 5 кобелей будет необходимо. </li><li> Эвтаназии каждый самец с помощью сети, чтобы передавать осторожно рыбу в чашку, содержащую 0,2% Tricaine в течение примерно 5-6 мин при комнатной температуре. ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы гарантировать, что мужчина был правильно эвтаназии до начала вскрытие. Как правило, ждать несколько (2-3) минут после жабрах прекратить движение рыбы и рыбыбольше не реагирует на касания. </li><li> Выберите мужчина мягко пластиковой ложкой и осторожно промокните мужской сухой жидкости. Затем удалите голову самца с резким ножницами, а затем разрезать надрез вдоль вентральной срединной линии. ПРИМЕЧАНИЕ: Удаление всех лишней жидкости из рыбы необходима для предотвращения запуска активацию сперматозоидов. </li><li> Снимите кишки и связанные кишечника органы от брюшной полости с использованием тонких щипцов и место в контейнер для биологически опасных для утилизации. </li><li> Используйте тонкий пинцет, чтобы удалить яички, которые расположены вдоль спинной стенке тела, боковые для плавательного пузыря, и есть белый непрозрачный внешний вид, если смотреть под стереомикроскопа. ПРИМЕЧАНИЕ: Ведение яички нетронутыми может помочь предотвратить воздействие на сперматозоиды к водной основе жидкостей организма и, следовательно, предотвратить преждевременное активации. </li><li> Наведите яички в раствор спермы на льду и держать трубку на льду, как и другие яички расчленены. Повторяйте шаги 2.6-2.9, пока вся мэли были расчленены. </li><li> Поместите туши и все оставшиеся животные ткани в контейнер для биологически опасных для надлежащего институционального распоряжении. </li></ol> 3. УФ спермы Инактивация <ol><li> Гомогенизируют яички, осторожно измельчения микроцентрифужную пробирку со стерильным микропробирок пестиком. </li><li> Передача супернатант в небольшую чашку Петри, или часовым стеклом на льду. ПРИМЕЧАНИЕ: Не передавать ткани мусора вместе с надосадочной жидкости. Это создаст тени и поставить под угрозу УФ инактивации спермы. </li><li> Промойте спермы трубку между 300-400 мкл Final рабочего раствора Дополнительный Хэнка (полученного в стадии 2.2 и хранится на льду), и добавьте этот надосадочную мыть в небольшой чашке Петри или смотреть стекло в шаге 3.2. </li><li> Expose блюдо УФ лучей, излучаемых скамейке лампы (254 нм) на общую сумму 2 мин на расстоянии от источника лампы около 15 в (38,1 см). ПРИМЕЧАНИЕ: Соблюдайте осторожность при работе с УФ-лампой и носить защитную маску илидругой глаз индивидуальной защиты. </li><li> Вернуться тарелку в ведерке со льдом, а затем перенести УФ инактивированную сперму в свежую пробирку микроцентрифужных и хранить образцы на льду. ПРИМЕЧАНИЕ: В этот момент будет примерно 800 мкл УФ инактивируется спермы для гаплоидного сцепления оплодотворения. Сперма должны храниться на льду в течение всего периода времени, затраченного на выдавливание самок. Сперма в холодной Хэнка могут быть использованы на срок до 6 часов без снижения оплодотворения результат. Интересно, что другие исследователи сообщают, что сперма в холодный Хэнка жизнеспособна от нескольких часов до нескольких дней 18. </li></ol> 4. Яйцо закупок от взрослых данио рерио Женщину и Экстракорпоральное оплодотворение сцепления <ol><li> Подготовка Tricaine ванну для анестезии путем объединения 20 мл 0,2% Tricaine складе 80 мл системы рыбы воды. </li><li> Выберите самку для сбора яиц, используя сеть, чтобы разместить ее нежно в блюдо ПДДicaine. </li><li> Подождите в течение 2-3 мин, пока самка не находится под наркозом и больше не реагирует на прикосновения. ПРИМЕЧАНИЕ: Если женщина дергается или вызывает другие движения, дать ей дополнительное время для поддаваться на анестезию. </li><li> Используйте пластмассовую ложку, чтобы осторожно поднимите самку, переливание решение до размещения самку на бумажное полотенце, чтобы фитиль от лишней жидкости. ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не оставить дополнительное решение на самке, как жидкость вызовет активацию яйца перед добавлением спермы. </li><li> Поместите женщина на ее горкой в ​​чистом чашку Петри и визуализировать ее живот под стереомикроскопа. </li><li> Ход самки живот мягко в течение приблизительно 10-20 сек с помощью одного или двух пальцев от одной стороны выжать яйца из ее живота, тем временем поддержки самки спину, поместив один или два пальца с другой стороны, сразу за ее спинной стенке тела. ПРИМЕЧАНИЕ: По поглаживая самки живот, яйца должны выйти очень легко. Если яйца не возникают остроумиеч облегчить это не рекомендуется, чтобы &quot;выдвинуть тяжелее&quot; и сила яйца от самки. Это означает, что яйца нет и / или не готова к оплодотворению, и продолжал толкает связано со значительным риском причинения вреда самку (например, разваливающийся плавательный пузырь или вызывает иное смертоносное повреждения внутренних органов). Если женщина выдавливается но предоставляет ни один или несколько яиц, вернуться самку на объект животного. Через 1-2 недели отдыха, пара самку мужчина для естественного спаривания, чтобы вычистить остаточного мусора яйцо. Отделять самок, сопряженные естественно в бак еще на 1-2 недели отдыха, прежде чем пытаться второй давить. Кроме того, женщины могут быть отдохнувшим в течение 4 недель, в течение которых они могут быть созданы для физических вязки 15. </li><li> Используйте тонкую зонд или небольшой шпатель, чтобы выкопать яйца из-под женщина и / или ее поверхности живота. </li><li> Аккуратно поднимите самку и вернуть ее к соответствующей маркировкой бака изоляции, содержащей системы рыба воду. &lt;/ Li&gt; <li> Добавить 50 мкл раствора УФ инактивированной спермы к муфте яиц, и инкубируют при комнатной температуре в течение 30 сек, во время которого, прикрепить метку, соответствующую к блюду отслеживать его с номера, присвоенного женского родителя. </li><li> Добавить 1 мл E3 к яйцам, и инкубируют при комнатной температуре в течение 1 мин. </li><li> Добавьте достаточное решение E3, чтобы заполнить блюдо на полпути, и поместите эмбрионы при 28 ° С в течение последующей инкубации. Примечание: добавление пенициллин / стрептомицин (1% (объем / объем) ручка-острый раствор, содержащий 5000 единиц пенициллина и 5 мг стрептомицина на мл) 19 до Е3 может помочь в общее состояние здоровья гаплоидных зародышей. </li></ol> 5. Наблюдение и регулировать гаплоидных эмбрионов <ol><li> После 4-8 часов, удалить неоплодотворенные эмбрионы из чашки и мыть оставшиеся эмбрионы, заменив эмбриона СМИ E3 свежим раствором E3. ПРИМЕЧАНИЕ: неоплодотворенных эмбрионы будут отобразить белый, непрозрачный внешний вид или может отображать прозраченppearance с деформированным одной клетки. </li><li> Инкубируйте до желаемого времени точки интереса, а затем использовать в нужном анализе экрана или другой исследовательской заявки (заявок). </li></ol>

<ol>
	<li>Haffter, P., N&#252;sslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+scale+genetics+in+a+small+vertebrate,+the+zebrafish.">Large scale genetics in a small vertebrate, the zebrafish.</a> Int J Dev Biol. 40, 221-227 (1996).</li><li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+human+disease:+zebrafish+swim+into+view.">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nat Rev Genet. 8, 353-367 (2007).</li><li>Kimmel, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).</li><li>Santoriello, C., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hooked!+Modeling+human+disease+in+zebrafish.">Hooked! Modeling human disease in zebrafish.</a> J Clin Invest. 122, 2337-2343 (2012).</li><li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome.">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496, 498-503 (2013).</li><li>Haffter, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+identification+of+genes+with+unique+and+essential+functions+in+the+development+of+the+zebrafish,+Danio+rerio.">The identification of genes with unique and essential functions in the development of the zebrafish, Danio rerio.</a> Development. 123, 1-26 (1996).</li><li>Driever, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+screen+for+mutations+affecting+embryogenesis+in+zebrafish.">A genetic screen for mutations affecting embryogenesis in zebrafish.</a> Development. 123, 37-43 (1996).</li><li>Eisen, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+make+a+big+splash.">Zebrafish make a big splash.</a> Cell. 87, 969-977 (1996).</li><li>Amsterdam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large-scale+insertional+mutagenesis+screen+in+zebrafish.">A large-scale insertional mutagenesis screen in zebrafish.</a> Genes Dev. 13, 2713-2724 (1999).</li><li>Bradford, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZFIN:+enhancements+and+updates+to+the+zebrafish+model+organism+database.">ZFIN: enhancements and updates to the zebrafish model organism database.</a> Nucleic Acids Res. 39, (2011).</li><li>Bowen, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+mapping+and+cloning+of+mutations+in+zebrafish+by+low-coverage+whole-genome+sequencing.">Efficient mapping and cloning of mutations in zebrafish by low-coverage whole-genome sequencing.</a> Genetics. 190, 1017-1024 (2012).</li><li>Leshchiner, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+mapping+and+identification+by+whole-genome+sequencing.">Mutation mapping and identification by whole-genome sequencing.</a> Genome Res. 22, 1541-1548 (2012).</li><li>Obholzer, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+positional+cloning+of+zebrafish+mutations+by+linkage+and+homozygosity+mapping+using+whole-genome+sequencing.">Rapid positional cloning of zebrafish mutations by linkage and homozygosity mapping using whole-genome sequencing.</a> Development. 139, 4280-4290 (2012).</li><li>Voz, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+homozygosity+mapping+and+identification+of+a+zebrafish+ENU-induced+mutation+by+whole-genome+sequencing.">Fast homozygosity mapping and identification of a zebrafish ENU-induced mutation by whole-genome sequencing.</a> PLoS ONE. 7, (2012).</li><li>Walker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haploid+screens+and+gamma+ray+mutagenesis.">Haploid screens and gamma ray mutagenesis.</a> Meth Cell Biol. 60, 43-70 (1999).</li><li>Steisinger, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+clones+of+homozygous+diploid+zebra+fish+(Brachydanio+rerio).">Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio).</a> Nature. 291, 293-296 (1981).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+2,+Embryo+Production+by+in+vitro+fertilization.&#8221;.">Chapter 2, Embryo Production by in vitro fertilization.&#8221;.</a> The Zebrafish Book 4th ed. , (2000).</li><li>Walker, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+gynogenetic+diploid+zebrafish+by+early+pressure.">Making gynogenetic diploid zebrafish by early pressure.</a> (28), (2009).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+10:+Recipes.&#8221;.">Chapter 10: Recipes.&#8221;.</a> The Zebrafish Book 4th ed. , (2000).</li><li>Yi, M., Hong, N., Hong, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+medaka+fish+haploid+embryonic+stem+cells.">Generation of medaka fish haploid embryonic stem cells.</a> Science. 326, 430-433 (2009).</li><li>Yi, M., Hong, N., Hong, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+characterization+of+haploid+embryonic+stem+cell+cultures+in+medaka+fish.">Derivation and characterization of haploid embryonic stem cell cultures in medaka fish.</a> Nat Protoc. 5, 1418-1430 (2010).</li><li>Layton, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Undertaking a successful gynogenetic haploid screen in zebrafish.&#8221; Zebrafish, Methods and Protocols. 1st ed. , (2009).</li><li>Wingert, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cdx+genes+and+retinoic+acid+control+the+positioning+and+segmentation+of+the+zebrafish+pronephros.">The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros.</a> PLoS Genet. 3, 1922-1938 (2007).</li><li>Wingert, R. A., Davidson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+nephrogenesis+involves+dynamic+spatiotemporal+expression+changes+in+renal+progenitors+and+essential+signals+form+retinoic+acid+and+irx3b.">Zebrafish nephrogenesis involves dynamic spatiotemporal expression changes in renal progenitors and essential signals form retinoic acid and irx3b.</a> Dev Dyn. 240, 2011-2027 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Гаплоидных скрининг может быть полезен, чтобы обнаружить существенные гены необходимые для ранних стадий развития. Кроме того, культивирование гаплоидных клеток из оризия рыбы был использован для изоляции ES-подобные клеточные линии, которые имеют многочисленные исследовательские приложений и потенциал, демонстрируя, что гаплоидные клетки могут обеспечить ценную будущего места для других типов генетических исследований позвоночных 20,21. Этот протокол обеспечивает демонстрацию методов, связанных с выполнением производство гаплоидных эмбрионов данио рерио через экстракорпорального оплодотворения с УФ инактивируется спермы. Эта методика может быть использована для выполнения вперед гаплоидных экраны с мутагенезу рыбы F1, которые могут быть сделаны с использованием дикого типа трансгенные или мутантные штаммы, для энхансер / супрессора скрининга. Хотя время скрининга с использованием гаплоидный стратегии является значительно сокращен по сравнению с диплоидной скрининга, оно, тем не менее занять несколько месяцев, чтобы закончить. Как мы descriкровать ранее, Есть много преимуществ, которые существуют, выполняя экран с помощью гаплоидный схему, все из которых могут помочь в создании новых взносов в современных знаний о любом количестве событий в развитии. Методология Гаплоидный экран является более эффективным для идентификации рецессивных мутантных аллелей, чем диплоидных основе экранов в связи с сокращением времени, пространства и количества рыбы, которые необходимы. Тем не менее, есть несколько подводных камней в гаплоидном экране. Гаплоидны экран может только идентификации мутантов в генах, которые активны в течение первых нескольких дней развития, как эмбрион может выжить только в течение ограниченного времени с гаплоидный геном. Гены, которые выражаются затем в развитии должны быть определены другим способом, например, диплоидной экране. Кроме того, некоторые органы не развиваются должным образом в гаплоидном организма. Там могут быть анатомические аномалии, или с задержкой времени развития, которые могут привести мутация будет хватать на гаплоидного метод скрининга. Ян Кроме того, некоторые штаммы рыбы не развиваются, а в гаплоидного состоянии 15. Гаплоиды могут быть классифицированы по классификации серии хороших, средних и плохих эмбриональных особенностей, с эмбрионы быть самый нормальный, B для обозначения эмбрионов с дефектами в оси, но ясно, голова и хвост, и C / D для обозначения эмбрионов с неузнаваемым особенности (массы клеток на вершине желтка шаров) 15,17. Пропорции эмбрионов в рамках этих категорий зависит от данио штамма, с увеличением числа более качественных гаплоидов наиболее распространенных в частности генетическим фоном 15,17. В силу этих факторов, необходимо найти правильный штамм рыбок данио для выполнения мутагенеза и последующие кресты. В нашем недавнем опыте, дикого типа Тюбинген штамм производится жизнеспособных гаплоиды скрининга (как показано на рисунках 3 и 4), хотя исторически данио исследователи использовали AB или AB * штаммы для гаплоидного Эксперимтации 15. В дополнение к этим вышеупомянутых проблем, не все загрунтованные взрослых самок данио будет производить сцепление на выполнении методики сжатия. Например, при работе с ENU-мутагенизированных деформации самок Tubingen, приблизительно половина всех женщин производится сцепление на сжатие, а некоторые из них фракция (обычно 10-30%) были низким качеством эмбрион или не могли быть оплодотворены. Таким образом, для выполнения гаплоидный экран нужно планируют поднять минимум в два раза столько рыбы, как нужно экранировать нужное количество геномов (каждая самка является одним геном скрининг). Независимо от этого рассмотрения, преимущества гаплоидного метода скрининга для покрытия большого количества геномов без массивного объекта животного действительно весьма значительным, если анализ поддается гаплоидного государства. Тем не менее, следует также отметить, что дальнейшее изучение мутации (ы) определены в гаплоидного сцепления полностью зависит от успешного привлечениян ауткросс от женской основателя. Как и в любом экране, &#39;парад&#39; первоначально определены в процессе скрининга необходимо заново определены в диплоидной государства. Несмотря ловушек с использованием гаплоидный экран, он показал, чтобы быть очень успешным в выявлении мутантов, которые были проанализированы в глубину с проницательными выгоды для научной области 15. Гаплоидные экраны могут быть реализованы для исследования других мало изученных процессов развития позвоночных. Использование гаплоиды для усилителей и супрессоров экранов является одним из способов, чтобы получить более глубокое представление о деятельности и регуляторной сети интересующего гена. Гаплоидный метод скрининга также может быть использован для идентификации энхансеры и ограничителей мутантов, которые уже были изолированы с помощью методов, таких как химическая или инсерционного мутагенеза или обратной генетики подходы, такие как ТИЛЛИНГ или Talens. Короче говоря, ранее выделен мутант может быть мутагенезу с ЕНУ и подвергают скринингу на усилители или сuppressors исходного мутантного фенотипа. Мутант должны быть в состоянии достигнуть взрослых этапы, поэтому необходимо иметь гетерозиготное животное или слабый гомозиготных мутантов рыбу выполнять этот экран, однако последние достижения в трансгенеза позволили исследователям обойти эту проблему. Научиться управлять путей в развитии может привести к много интересных возможностей, включая перспективой возмущающих путей для лечения болезненных состояний.

Основные процессы, которые руководят развитие позвоночных широко сохраняется 1. Мощный способ идентификации генов с эфирными ролей в развитии является изоляция наследуемые мутации, которые приводят к фенотипическим дефектов в процессе интерес. Данио, Данио рерио, является небольшой пресноводный вид костистых принадлежащие рыбы семейства карповых, которая стала широко используемой моделью организм для позвоночных генетики развития в течение последних нескольких десятилетий 2. Данио рерио яйца оплодотворены внешне, позволяя доступ к зиготы от начала оплодотворения 3. Кроме того, в начале эмбрион является оптически прозрачным, что позволяет визуализировать развития с простым стереомикроскопа 3. Данио рерио онтогенеза является быстрым, с процессами расщепления, гаструляцией, и органогенеза многих структур, таких как сердце и почки, в значительной степени завершена в течение первого дня развития 3. Тон время от личиночной стадии к половой зрелости занимает 2-3 месяцев, и взрослые мелкими позвоночными примерно 3-4 см в длину, столько рыб содержат в минимальном пространстве 2. Кроме того, данио взрослые имеют высокую плодовитость, с каждой рыбы, способную производить несколько сотен эмбрионов в неделю 2. Эти атрибуты оказали удобство манипулирования из рыбок данио для прямого и обратного генетические экраны. Данио рерио обладают высокой степенью сохранения в их анатомии, клеточной биологии и физиологии с более продвинутых видов позвоночных, как млекопитающие 2,4. В самом деле, недавний анализ последовательности показал, что геном содержит данио гомологи в около 70% человеческих генов 5. Это сохранение позволило исследователям использовать данио в качестве модели для многочисленных заболеваний человека, в том числе и эмбриональных и взрослых условиях 2,4. Взятые вместе, эти факторы сделали данио отличная система для экранов с целью выявления генов,необходим для нормального позвоночных онтогенеза. Ряд больших экранах масштабных были проведены у рыбок данио и выявили несколько тысяч мутаций в генах развития 6-8. Данио взрослый мужчина поддается мутагенеза и хромосомные изменения могут быть получены с относительно высокой частотой с помощью химического мутагена ethylnitrosourea (ЕНУ) 6,7 или ретровирусную инсерционного мутагенеза 9. На сегодняшний день более 9000 наследственные мутации были созданы, и включают в себя гены, которые влияют практически все аспекты эмбриогенеза. Данио сообщество установило централизованного банка от этих мутантов в Международном центре данио рерио ресурсов (или Zirc) 10, который собрал около 5000 мутантных и трансгенных аллели со всего мира. Многие из этих мутаций были проанализированы и клонировали, давая исследователям через биологических дисциплин ценную информацию, которая была использована, чтобы дразнить друг от друга Numeroнас клеточные и физиологические пути через прозрения, происходящих с данио экспериментов. Хотя вперед экраны определили внушительное число важных генов, многое еще, чтобы оценить о генетических регуляторных сетей, которые обеспечивают множество процессов. Многие экраны, предпринятые до сих пор не достиг насыщения, и, таким образом вперед, а также обратные генетические экраны остались краеугольным для выявления и анализа механизмов эмбриогенеза. В то время как есть огромные идеи, которые можно почерпнуть из какой-либо одной данио мутантной линии, основным ограничивающим фактором в области исторически была трудоемким усилия, затраченные в позиционного клонирования. По этой причине, личность многих химически индуцированных мутаций остался загадкой. Тем не менее, с появлением в последнее время весь геном подходов секвенирования, которые облегчают быстрое клонирование 11-14, невероятно эффективным идентификация генетических мутаций теперь Feasible. Прототипом вперед экран у рыбок данио является диплоидным экран, который может определить рецессивные мутации в течение трех поколений 6,7 (рис. 1, столбец слева). Этот метод включает генерирующие мутации в репродуктивных клетках родителей (Р) Для мужчин, а затем спаривания этот мужчина с дикого типа женщины. Каждый из первого поколения (F1) потомства от этой вязки будет питать один или несколько уникальных мутаций из-за хромосомных вкладов мутировавшего отцовской генома. Потомство F1 поднимаются и скрещивали с дикими видами, чтобы создать F2 семей. В семье F2, братьев будет либо дикого типа или гетерозиготных носителей, и incrossed случайным образом генерировать F3 муфты, которые анализируются для фенотипа (ов), представляющего интерес. В F3 клатчи из гетерозиготных носителей будет содержать 25% дикого типа, 50% гетерозиготных и 25% гомозиготных мутантов рыбу. Это несколько поколений скрининг схема эффективна, однако один главный недостаток к этомухо д входит время, необходимое для подготовки к экрану: по крайней мере, 1 год только рыбного хозяйства участвует, так как каждое поколение требует около 3 месяцев, чтобы достичь половой зрелости. Другие ограничения этого типа диплоидной экране являются работы, пространство, и стоимость жилья эти поколения. Гаплоидный экран является одним альтернативой, которая может быть использована для идентификации, а затем изолировать рецессивные мутации с использованием аналогичных стратегий мутагенеза 15 (рис. 1, правая колонка). Производство гаплоидных эмбрионов данио рерио сначала было описано более 30 лет назад 16 и способность обычно диплоидной данио разработать в течение нескольких дней с гаплоидный хромосомный плоидности была использована для многочисленных генетических исследований с этого времени. Основное преимущество гаплоидного экране в том, что этот метод не предполагает повышения F2 семьи, чтобы экран для рецессивных мутантных аллелей. Вместо этого, самки поколения F1 оценивают погетерозиготность рецессивных мутаций в процессе интересом исследуя их F2 потомства в гаплоидном состоянии (рис. 1, правая колонка). В целом, шаги, которые закупают гаплоидных зародышей относительно просты (рис. 2). После подготовки необходимых решений для обработки спермы, яйца получаются от самок F1 поколения ручного манипулирования с тем, чтобы выдавить (или &quot;сжать&quot;) яйца от пуза. Как только яйца получаются, они оплодотворяются в пробирке под воздействием ультрафиолетового (УФ) инактивируется спермы. УФ инактивированный сперма не способны внести вклад жизнеспособной ДНК в яйцо в связи с тем, что короткий длина волны УФ сшивает отцовской ДНК. Тем не менее, сперма все еще способны вызывать яйцо активность и события, связанные с зиготического развития. По метаболической активации, яйцо завершит мейоза II, и приступить к разработке только с одной материнской хранение копию каждой chromosoя. Из-за этого 1N плоидности, эмбрион является предметом развития последствий рецессивного мутантного аллеля, если он присутствует на материнской хромосоме. Таким образом, каждый F2 гаплоидны сцепления будет содержать 50% дикого типа и 50% мутантных эмбрионов, если мать является гетерозиготным носителем полностью пенетранта рецессивного аллеля. Такое распределение эмбриональных генотипов позволяет относительную легкость с точки зрения оценки сцепления на наличие мутантного фенотипа (ов), представляющего интерес. Если такой фенотип обнаруживается, самка основатель поколения F1 впоследствии скрещивали дикого типа мужского рыбок данио, чтобы создать и собрать больше гетерозиготных носителей. Потому что это не необходимо поднять несколько поколений, чтобы выполнить экран, исследователь может значительно сэкономить время, труд, и аквариум пространство, но все еще имеет силу для обследования значительное количество геномов на основе ряда F1 женщин исследуемой. Таким образом, гаплоидные экраны особенно целесообразно для небольших лабораторий или проектов, инициированных в absencэ существенного финансирования. Тем не менее, существует несколько ограничений и недостатков использования гаплоидов. Во-первых, гаплоидные эмбрионы рыбок данио живут всего несколько дней, и, обычно умирают от 3 ​​до 5 дней после оплодотворения (DPF) 15. Гаплоидные эмбрионы рыбок данио можно отличить от диплоидов на основе нескольких характеристик, прежде всего среди них быть короткой и коренастый тело, которое, тем не менее имеет нормальный ряд сомитных сегментов 15,17. По мере продвижения разработки, экспонаты мозга увеличилась гибель клеток и кровообращение плохое, как правило, связаны с объединения крови на 2-3 DPF и отека 15,17. Кроме того, гаплоиды не в состоянии надуть 15,17 плавательного пузыря. Независимо от этих морфологических различий, большинство крупных органы и ткани образуются, в том числе сердца, глаз и хорды 15,17. Одной из особенностей отмечено о гаплоидных муфт в том, что они содержат ряд фенотипов в плане сортов дефектных эмбрионов и #8212; особенность наблюдается по штаммов данио. Таким образом, следует проверить, если ткань (ы) и время достопримечательность показывают достаточно нормальное развитие в дикого типа гаплоидного деформации и, следовательно, есть потенциал, чтобы быть оценена для генетических дефектов в экран или другой научно-исследовательского проекта. Несмотря на эти проблемы, гаплоидные экраны были реализованы успешно, чтобы идентифицировать гены, необходимые для начала процессов развития в данио, и гаплоидные протоколы были хорошо известны ресурсов в обществе на протяжении многих лет 15-19. Совсем недавно, процесс создания гаплоидных зародышей рыб была использована исследователями для создания гаплоидный эмбриональных стволовых (ES) клеточных культур от оризия рыбы 20,21. После производства оризии гаплоидных эмбрионов в пробирке, эмбрионы были использованы для получения первичных клеточных культур, которые пассировали в течение приблизительно 15 недель с последующим еще 5-8 недель, чтобы генерировать чистые клоны гаплоидных клеток сES клеток свойства 15-19. Поколение рыбы гаплоидных клеточных линий ES имеет широкий будущей перспективы для анализа рецессивных фенотипов в позвоночных клеточных клонов, и представляет собой новый подход к генетического анализа в ближайшие годы. Таким образом, поколение гаплоидных зародышей рыб уже растет приложений в биомедицинских исследований сообщества. Это видео статья обеспечивает визуальное демонстрацию этапов с производством гаплоидных данио эмбрионов в пробирке с использованием УФ-инактивируется сперму на основе установленных протоколов 15-19,22.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="797">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:99px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:364px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Hank&#39;s Stock Solution #1</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:364px;">8.0 g NaCl, 0.4 g KCl in 100 ml ddH2O</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;">Hank&#39;s Stock Solution #2</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:364px;">0.358 g Na2HPO4 anhydrous; 0.60 g K2H2PO4 in 100 ml ddH2O</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Hank&#39;s Stock Solution #4</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:364px;">0.72 g CaCl2 in 50 ml ddH2O</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Hank&#39;s Stock Solution #5</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:364px;">1.23 g MgSO4-7H2O in 50 ml ddH2O</td>
		</tr>
		<tr height="88">
			<td height="88" style="height:88px;">Hank&#39;s Premix</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:364px;">Combine in the following order: (1) 10.0 ml HS#1, (2) 1.0 ml HS#2, (3) 1.0 ml HS#4, (4) 86 ml ddH2O, (5) 1.0 ml HS#5.&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Store all HS Solutions and Premix at 4 degrees Celcius.</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;">Hank&#39;s Stock Solution #6</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:364px;">0.35 g NaHCO3 in 10.0 mls ddH2O; make fresh on day of use.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Hank&#39;s Final working solution</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:364px;">Combine 9.9 ml of Hank&#39;s Premix with 0.1 ml HS Stock #6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">XX-Series UV Bench lamp</td>
			<td style="width:99px;">UVP</td>
			<td style="width:119px;">95-0042-05</td>
			<td style="width:364px;">Model XX-15S Bench Lamp</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">XX Bench Stand (Adjustable)</td>
			<td style="width:99px;">UVP</td>
			<td style="width:119px;">18-0062-01</td>
			<td style="width:364px;">Model XX-15 Stand</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Embryo incubation dish</td>
			<td style="width:99px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">35-1005</td>
			<td style="width:364px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">50 X E3</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:364px;">250 mM NaCl, 8.5 mM KCL, 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4 in distilled water. Supplement with methylene blue (1 x 10-5 M) (Sigma M9140) to inhibit contamination.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1 X E3</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:364px;">Dilute 50 X E3 in distilled water</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:99px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">SMZ645; SMZ1000</td>
			<td style="width:364px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of haploid zebrafish embryos by in vitro fertilization

Данио стало основной позвоночных модель, которая имеет отношение к многим дисциплинам научного изучения. Данио рерио особенно хорошо подходит для прямого генетического анализа процессов развития в связи с их внешнего оплодотворения, эмбрионального размера, быстрое онтогенеза и оптической прозрачности - созвездие черт, которые позволяют прямое наблюдение событий, начиная от гаструляции в органогенеза с основной стереомикроскопа. Кроме того, эмбрионы рыбок данио может выжить в течение нескольких дней в гаплоидного государства. Производство гаплоидных эмбрионов в пробирке является мощным инструментом для мутационного анализа, так как она позволяет идентифицировать рецессивных мутантных аллелей, присутствующих в первом поколении (F1) женщин-носительниц следующие мутагенеза в родительской (P) поколения. Такой подход исключает необходимость поднять несколько поколений (F2, F3 и т.д.), включает в себя разведение мутантных семей, тем самым экономя время исследователь вместе с сокращениемпотребности в данио пространстве колонии, труда, стоимость животноводства. Хотя данио были использованы для проведения вперед экраны для последних нескольких десятилетий, имело место постоянное расширение трансгенных и геномных инструментов редактирования. Эти инструменты предлагают множество способов создания нюансы анализов для экранов следующего поколения, которые могут использоваться для дальнейшего препарировать генные регуляторных сетей, которые управляют позвоночных онтогенез. Здесь мы описываем, как подготовить гаплоидных эмбрионов рыбок данио. Этот протокол может быть реализован в новых будущих гаплоидных экранов, таких как энхансер и супрессоров экранов, для решения механизмы развития для широкого ряда процессов и тканей, которые образуют на ранних эмбриональных стадий.

Watch this Scientific Journal Video about Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization at JoVE.com

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

The zebrafish is a powerful model system for developmental biology and human disease research due to their genetic similarity with higher vertebrates. This protocol describes a methodology to create haploid zebrafish embryos that can be utilized for forward screen strategies to identify recessive mutations in genes essential for early embryogenesis.

Производство гаплоидных эмбрионов данио по<em&gt; Экстракорпоральное</em&gt; Оплодотворение

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for ...

production-of-haploid-zebrafish-embryos-by-in-vitro-fertilization

Research

JoVE Journal

Biology

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

24.4K Views.  University of Notre Dame. The zebrafish is a powerful model system for developmental biology and human disease research due to their genetic similarity with higher vertebrates. This protocol describes a methodology to create haploid zebrafish embryos that can be utilized for forward screen strategies to identify recessive mutations in genes essential for early embryogenesis.

Video: Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

Микроинъекция мРНК и Олигонуклеотиды морфолино антисмысловых в данио рерио эмбрионов.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

Микроинъекции данио рерио Эмбрионы для анализа функции гена

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an organism that contains cells from more than one animal; mosaics are one type of chimera in which cells from more than one genotype are mixed, usually wild-type and mutant. In the zebrafish, chimeras can be readily made by transplantation of cells from a donor embryo into a host embryo at the appropriate embryonic stage. Labeled donor cells are generated by injection of a lineage marker, such as a fluorescent dye, into the one-cell stage embryo. Labeled donor cells are removed from donor embryos and introduced into unlabeled host embryos using an oil-controlled glass pipette mounted on either a compound or dissecting microscope. Donor cells can in some cases be targeted to a specific region or tissue of the developing blastula or gastrula stage host embryo by choosing a transplantation site in the host embryo based on well-established fate maps.

A step-by-step guide to generating targeted chimeric zebrafish embryos by transplantation at the blastula or gastrula stage.

Создание химерных эмбрионов данио рерио по трансплантации

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to the original protocol that both streamline the procedure and increase sample uniformity.  First, we normalize all sperm volumes using freezing media that does not contain the cryoprotectant. Second, cryopreserved sperm are stored in cryovials instead of capillary tubes.  The rates of sperm freezing and thawing (&delta;&deg;C/time) are probably the two most critical variables to control in this procedure.  For this reason, do not substitute different tubes for those specified.  Working in teams of 2 it is possible to freeze the sperm of 100 males per team in ~2 hrs.  Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility (measured as the number of viable embryos generated in an in vitro fertilization divided by the total number of eggs fertilized) and this percent fertility is stable over many years.

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a high-throughput sperm cryopreservation protocol for zebrafish. Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility in subsequent vitro fertilization and is stable over many years.

Высокая пропускная метод для криоконсервации спермы и данио рерио In Vitro Оплодотворение

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

Два-Фотон основе Фотоактивация в Живом данио рерио Эмбрионы

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Imaging Glycans in Zebrafish Embryos by Metabolic Labeling and Bioorthogonal Click Chemistry

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or alkyne-tagged monosaccharides1, 2. The modified monosaccharides, processed by the glycan biosynthetic machinery, are incorporated into cell surface glycoconjugates. The bioorthogonal azide or alkyne tags then allow covalent conjugation with fluorescent probes for visualization, or with affinity probes for enrichment and glycoproteomic analysis. This protocol describes the procedures typically used for noninvasive imaging of fucosylated glycans in zebrafish embryos, including: 1) microinjection of one-cell stage embryos with GDP-5-alkynylfucose (GDP-FucAl), 2) labeling fucosylated glycans in the enveloping layer of zebrafish embryos with azide-conjugated fluorophores via biocompatible Cu(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC), and 3) imaging by confocal microscopy3. The method described here can be readily extended to visualize other classes of glycans, e.g. glycans containing sialic acid4 and N-acetylgalactosamine5, 6, in developing zebrafish and in other living organisms.

A click-chemistry based method that allows for the rapid, noninvasive, and robust labeling of alkyne-tagged glycans in zebrafish embryos is described. Fucosylated glycans in the enveloping layer of zebrafish embryos in the late gastrulation stage were imaged in this study.

Изображений гликанов в данио рерио Эмбрионы от метаболического Маркировка и Bioorthogonal химии нажмите

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or ...

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these relationships will help to understand the underlying etiology for a range of diseases linked with mitochondrial dysfunction, such as diabetes and obesity. Recent advances in instrumentation, has enabled the monitoring of distinct parameters of mitochondrial function in cell lines or tissue explants. Here we present a method for a rapid and sensitive analysis of mitochondrial function parameters in vivo during zebrafish embryonic development using the Seahorse bioscience XF 24 extracellular flux analyser. This protocol utilizes the Islet Capture microplates where a single embryo is placed in each well, allowing measurement of bioenergetics, including: (i) basal respiration; (ii) basal mitochondrial respiration (iii) mitochondrial respiration due to ATP turnover; (iv) mitochondrial uncoupled respiration or proton leak and (iv) maximum respiration. Using this approach embryonic zebrafish respiration parameters can be compared between wild type and genetically altered embryos (mutant, gene over-expression or gene knockdown) or those manipulated pharmacologically. It is anticipated that dissemination of this protocol will provide researchers with new tools to analyse the genetic basis of metabolic disorders in vivo in this relevant vertebrate animal model.

Zebrafish represent a powerful vertebrate model that has been under-utilised for metabolic studies. Here we describe a rapid way to measure the in vivo metabolic profile of developing zebrafish that allows the comparison of different mitochondrial function parameters between genetically or pharmacologically manipulated embryos, thereby increasing the applicability of this organism.

Метаболический Анализ профиля эмбрионов данио рерио

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...

Analysis of Apoptosis in Zebrafish Embryos by Whole-mount Immunofluorescence to Detect Activated Caspase 3

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis in zebrafish embryos. The whole-mount analysis provides spatial information in regard to tissue specificity of apoptosing cells, although sectioning and/or colabeling is ultimately required to pinpoint the exact cell types undergoing apoptosis. The whole-mount Casp3 assay is optimized for analysis of fixed embryos between the 4-cell stage and 32 hr-post-fertilization and is useful for a number of applications, including analysis of zebrafish mutants and morphants, overexpression of mutant and wild-type mRNAs, and exposure to chemicals. Compared to acridine orange staining, which can identify apoptotic cells in live embryos in a matter of hours, Casp3 and TUNEL assays take considerably longer to complete (2-4 days). However, because of the dynamic nature of apoptotic cell formation and clearance, analysis of fixed embryos ensures accurate comparison of apoptotic cells across multiple samples at specific time points. We have also found the Casp3 assay to be superior to analysis of apoptotic cells by the whole-mount TUNEL assay in regard to cost and reliability. Overall, the Casp3 assay represents a robust, highly reproducible assay in which to analyze apoptotic cells in early zebrafish embryos.

Certain genetic perturbations or exposure to toxins can disrupt normal developmental processes leading to death of specific cell types. The analysis of activated Caspase 3 by whole-mount immunofluorescence in zebrafish embryos reveals stage- and tissue-specific localization of cells specifically undergoing apoptosis.

Анализ апоптоза у эмбрионов данио рерио по целом монтажа иммунофлуоресценции для обнаружения активированного каспазы 3

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis ...

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes oxidation of molecules (lipid, DNA, protein) and leads to cell death. Oxidative stress also impacts the progression of several pathological conditions such as diabetes, retinopathies, neurodegeneration, and cancer. Thus, it is important to define tools to investigate oxidative stress conditions not only at the level of single cells but also in the context of whole organisms. Here, we consider the zebrafish embryo as a useful in vivo system to perform such studies and present a protocol to measure in vivo oxidative stress. Taking advantage of fluorescent ROS probes and zebrafish transgenic fluorescent lines, we develop two different methods to measure oxidative stress in vivo: i) a &#8220;whole embryo ROS-detection method&#8221; for qualitative measurement of oxidative stress and ii) a &#8220;single-cell&#160;ROS detection method&#8221; for quantitative measurements of oxidative stress. Herein, we demonstrate the efficacy of these procedures by increasing oxidative stress in tissues by oxidant agents and physiological or genetic methods. This protocol is amenable for forward genetic screens and it will help address cause-effect relationships of ROS in animal models of oxidative stress-related pathologies such as neurological disorders and cancer.

Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses.

Анализ окислительного стресса у эмбрионов данио рерио

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are frequently used to identify chemicals that modulate gene expression. Chemical screens that assay fluorescence in live zebrafish often rely on expensive, specialized equipment for high content screening. We describe a procedure using a standard epifluorescence microscope with a motorized stage to automatically image zebrafish embryos and detect tissue-specific fluorescence. Using transgenic zebrafish that report estrogen receptor activity via expression of GFP, we developed a semi-automated procedure to screen for estrogen receptor ligands that activate the reporter in a tissue-specific manner. In this video we describe procedures for arraying zebrafish embryos at 24-48 hours post fertilization (hpf) in a 96-well plate and adding small molecules that bind estrogen receptors. At 72-96 hpf, images of each well from the entire plate are automatically collected and manually inspected for tissue-specific fluorescence. This protocol demonstrates the ability to detect estrogens that activate receptors in heart valves but not in liver.

Described here is a protocol for semi-automated imaging of tissue-specific fluorescence in zebrafish embryos.

Полуавтоматическая изображений тканеспецифических флуоресценции у эмбрионов данио рерио

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are ...