نشكر السيدة باولا لتربية الأسماك روي ممتازة ، وEkker ستيف لهدية كريمة من البلازميد pDB600. وتم تمويل هذه الدراسات من جانب منحة لسادس من NHGRI.

1. اختيار واستنساخ تسلسل حفظها للاختبار <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يجب على المرء أولا تحديد متواليات التنظيمية المحتملة لاختبار وظيفية. نحن نعتمد على الحفاظ على التسلسل التطوري كمعيار لتحديد متواليات ، وغالبا ما تستخدم PhastCons الخوارزمية ، الذي هو في متناول الجميع باعتباره المسار على متصفح الجينوم UCSC (http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway). ومع ذلك ، هناك العديد من الخوارزميات الأخرى المتاحة لتقييم الحفظ عبر تسلسل الأنواع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة لدينا تحديد تسلسل لدينا ، ونحن تصميم الاشعال لتضخيم كل تسلسل الحمض النووي من الجيني. وينبغي اختيار الاشعال لتضخيم المنطقة بالاضافة الى الحفاظ أزواج قاعدة 30 أو أكثر على أي من الجانبين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عن التضخيم من متواليات اخترنا استخدام نظام تاكارا TaqTM لوس انجليس. سوف polymerases الأعمال الأخرى ، ولكن من المهم أن استخدام مزيج يتضمن انزيم مع القدرة على تصحيح التجارب المطبعية ، لتقليل فرص الأخطاء التي أدخلت خلال التضخيم. علينا التحقق من حجم amplicon بواسطة agarose هلام إستشراد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نستخدم 8/GW/TOPO PCR TA الاستنساخ كيت (Invitrogen) لاستنساخ منتج PCR إلى مواقع تحتوي على دخول ناقلات attL إعادة التركيب ، لإنشاء بوابة دخول استنساخ. رد فعل الاستنساخ هو أكثر كفاءة مع المنتج PCR جديدة ، لذلك فمن الأفضل لأداء الاستنساخ خلال يوم واحد من PCR. يتم تنفيذ التحول في سلالات DH5α تليها اختيار المقاومة سبكتينوميسين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> علينا التحقق من نتاج الاستنساخ بواسطة TA هضم ~ 500ng من البلازميد مع EcoRI للافراج عن إدراج ، وتأكيد حجم إدراج بواسطة agarose هلام إستشراد. أوصينا تسلسل للتحقق من إدراج تسلسل والتوجيه ؛ ويمكن أيضا استخدامه لتضخيم الاشعال تستعمل لأجل التسلسل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استنساخ من الدخول ، وزيارات مكوكية تسلسل غير الترميز التي تحفظها تأشب LR لدينا ناقلات الوجهة عبارة جاهزة ، pGW_cfosGFP1 ، وذلك باستخدام عبارة LR Clonase الثاني انزيم ميكس (Invitrogen). يتم تنفيذ التحول في سلالات DH5α تليها اختيار المقاومة أمبيسيلين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> علينا التحقق من نتاج إعادة التركيب من قبل LR هضم ~ 500ng من البلازميد مع EcoRV للافراج عن إدراج ، والتأكد من حجم إدراج بواسطة agarose هلام إستشراد. مرة واحدة وقد تم استنساخ رصدوا دقيقة ، ونحن نستعد DNA البلازميد باستخدام HiSpeed ​​Qiagen ® مجموعة ميدي البلازميد. ونحن كذلك تنقية البلازميد باستخدام تنقية PCR QIAquick كيت ، وفقا لبروتوكولات الشركة المصنعة ، وأزل الحمض النووي مع 30 ميكرولتر ريبونوكلياز المياه مجانا. وتضعف البلازميد إلى تركيز من 125 نانوغرام / ميكرولتر وتخزينها في 4 درجات مئوية قبل الحقن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هو كتب الحمض النووي الريبي الترميز الفنية انزيم transposase Tol2 في المختبر من plasmid2 pDB600 و. نحن تنقية البلازميد باستخدام لوار الإعدادية Qiagen عدة ، ثم يصبح خطي 10-20 ميكروغرام مع XbaI. ويتم تجميع مرنا في أعقاب بروتوكول mMESSAGE كيت mMACHINE (Ambion). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمكننا تطهير وترسيب الحمض النووي الريبي وفقا لتعليمات الطقم. resuspend نحن RNA إلى التركيز النهائي لل1μg/μl ~ ، أو 20 ميكرولتر عن رد فعل واحد ، في الماء ريبونوكلياز الحرة ، وتحديد القياس الطيفي بواسطة الأشعة فوق البنفسجية. نحن نحلل أيضا ~ 1μg من الحمض النووي الريبي التي agarose هلام إستشراد للتحقق من النسخ الكاملة الطول. على الرغم من أن تاي القياسية أو هلام TBE غير كافية لهذا التحليل ، ينبغي أن تستخدم في تغيير طبيعة وشملت عينة العازلة مع عدة نسخ وفقا لتعليمات الطقم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> علينا اختبار كل دفعة جديدة من الحمض النووي الريبي لtransposase فعالية عن طريق إجراء عمليات الحقن التي تحتوي على (الشكل 1) البلازميد معروفة. بعد التحقق ، ينقسم الحمض النووي الريبي في aliquots الصغيرة وتخزينها في -80 درجة مئوية ، لتجنب تكرار وذوبان refreezing من aliquots الفردية. <img src="/files/ftp_upload/1722/1722fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. الزرد الجنين حقنوا محسن Sox10 الماوس كعنصر تحكم (الأعلى) Brightfield صورة (القاع) GFP مضان الصورة. يتم اختبار كل دفعة جديدة من الحمض النووي الريبي لtransposase الفعالية. </li></ol> 2. Microinjection الأجنة الزرد لتحليل الفسيفساء المعدلة وراثيا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نحن لسحب الإبر microinjection من 1.2 ملم خيوط الزجاج OD الشعرية على بولير P - 97 Micropipette سوتر ، مع برنامج مصمم لانتاج تلميح قوي مع تفتق حاد نوعا ما على اختراق chorions سليمة. علينا كسر نصائح باليد تحت stereomicroscope إلى القطر الخارجي حوالي 15 ميكرون ، وذلك باستخدام شفرة حلاقة نظيفة وشريحة ميكرون. ويمكن إجراء هذه الإبر في اليوم قبل الحقن ، وتخزينها في صحن عقد مغطاة للحفاظ على نظافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نحافظ على موقعنا في الزرد دورة العادية ضوء الظلام ، مع 14 ساعة من الضوء ، في إطار conditions3 القياسية. في اليوم قبل أداء microinjections ، أنشأنا الأسماك للتزاوج موقوتة في خزانات تربية صغيرة ، كل منها يتكون من خزان القاعدة ، وإدراج فترة زمنية محددة ، وغطاء بلاستيكي. نضع ثلاث إناث أو اثنين من الذكور لكل طنكرانك في صفوف متوازية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في صباح يوم من microinjections ، وبعد فترة وجيزة من بدء دورة الضوء ، ونحن نبدأ الجمع بين الذكور والإناث في نظام المياه المعالجة النظيفة لإنتاج البيض. فمن المهم للاطمئنان على الأسماك في كثير من الأحيان ، وجمع البيض في غضون بضع دقائق من زرع ، للحصول على دفعات تتزامن أيضا. يمكن الحفاظ على إنتاج البيض لمدة سنتين إلى ثلاث ساعات ، من خلال الاستمرار في الجمع بين مجموعات من الأسماك الطازجة في جميع أنحاء الصباح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع تجويف واسع ، 5 1 / 4 &quot;زجاج باستور ماصة مزودة مبة اللاتكس ، ونحن فرز الأجنة التي تم جمعها في 60 × 15 مم أطباق بتري ، ملأ جزئيا مع Medium2 الأجنة ، في مجموعات من 50 الأجنة ، وعلامة في الوقت التي يتم جمعها على غطاء كل طبق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السمك مرة واحدة بدأت زرع ، ونحن نستعد الطازجة حل حقن عن طريق المزج ما يلي في أنبوب microfuge على الجليد : <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> مكون </td><td></td></tr><tr><td> ينقول الأسهم البلازميد (125ng/μl) </td><td> 1μl </td></tr><tr><td> Transposase RNA الأسهم (175ng/μl) </td><td> 1μl </td></tr><tr><td> الفينول الأسهم الحمراء (2 ٪ في H 2 O) </td><td> 0.5μl </td></tr><tr><td> ريبونوكلياز المياه مجانا </td><td> 2.5μl </td></tr></tbody></table> وضعت الإبر الحقن في عقد الأطباق ويشغلها pipetting 500 قطرات من محلول الحقن NL على نطاق واسع في نهاية كل إبرة. بعد يوجه السائل إلى غيض من خلال العمل الشعري ، ويمكن أن تضاف إلى حل إضافية مجموعه 1،5-2 ميكرولتر. نحن نستعد اثنين على الاقل من الإبر لكل حل الحقن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تحميل شغل الإبرة في ناحية عقد الإبرة حامل بيكو مضخة هوائية أو ما شابه ذلك حاقن الضغط ، وتكوين وتوصيلها إلى خزان N2 فقا لتعليمات الشركة الصانعة. نحن معايرة حقن كميات من خلال قياس قطرها من قطرات الزيت المعدني في طرد على شريحة ميكرون. عادة ، فإن الوقت حقن 120 مللي مع ضغط 20 رطل العائد قطرات من حوالي 1 NL ، ولكن هناك اختلافات طفيفة في إبرة قطرها سوف تؤثر هذه المعايير ، ويمكن إعادة تقويم المطلوبة بين الإبر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تنفيذ عمليات الحقن تحت stereomicroscope في 6 - 10X التكبير. علينا استخدام زوج من غرامة ملقط لعقد الجنين في مكان ، ودفع الإبرة الحقن مع الضغط المستمر من خلال المشيماء والمح الى وجود الجنين في خلية واحدة أو المرحلة المبكرة من الخلايا اثنين. من الناحية المثالية ، ونحن موقف الطرف إبرة في صفار البيض فقط دون blastomeres. وطرد ما يقرب من 1 NL حل الحقن وسحب الإبرة. لكل بناء نحن حقن ≥ 200 الأجنة. بل هو أيضا مهم جدا ، بالنسبة لكل مخلب الأجنة التي تم جمعها ، لإنقاذ طبق من الأجنة uninjected السيطرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الانتهاء من حقن نحن فرز الأجنة عن طريق إزالة بويضة غير مخصبة والأجنة التالفة ، والحقن الفاشلة (مع عدم وجود أجنة أحمر الفينول في blastomeres). نحن احتضان ثم الأجنة في المتوسط ​​28.5 في جنين درجة مئوية حتى الوقت المناسب للملاحظات. </li></ol> 3. تحليل أنماط التعبير الفسيفساء <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد فترة حضانة مناسبة ، ونحن فحص الأجنة لحقن مضان. توقيت يعتمد على نمط التعبير العادية من الجين الزرد الذاتية ، ولكن نحن ننظر عادة يومية من خلال أول 5 أيام الإخصاب آخر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ندرس الأجنة لمضان على macroscope MVX10 أوليمبوس المجهزة لepifluorescence ، ولكن أي المجهر مماثلة قادرة على التصوير منخفضة الطاقة والعمل. إذا كان هناك عدد كبير من الأجنة التي وضعت بشكل غير طبيعي أو توفي في اليوم الأول ، أن ننظر في uninjected ضوابط لهذا مخلب لمعرفة إذا كانت تبدو طبيعية. إذا كانت الضوابط تبدو عادية ، والمشكلة الأكثر شيوعا هو نقاء كافية من الحمض النووي حقن. أيضا ، الأجنة في المراحل المبكرة حساسة لالمبلغ الإجمالي للبلازميد حقن ، ولذلك فمن الممكن أن تقدير غير دقيق وتم حقن الدنا كثيرا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عند فحص الأجنة ، أن نضع في اعتبارنا أن سيكونون جميعا في فسيفساء لبناء حقن. وسوف يكون من الضروري أن ننظر بعناية في كل من الأجنة ، وخاصة إذا كان من المتوقع المجال للتعبير صغير. نتذكر أيضا أن التعبير يمكن أن تكون دينامية ؛ مضان قوية يوم 1 قد يختفي بحلول يوم 2 ، والأجنة السلبية للتعبير عن أول 3 ايام قد تظهر شيئا في يوم 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نختار بعض الأجنة مع التعبير أكثر اتساعا ، واستخدام هذه الوثيقة لنمط مضان بواسطة تصوير مجهري. بعد 5 أيام من الملاحظات ، ينبغي إرجاع الأجنة إلى المرفق ونشأ الأسهم. في عدة أشهر ، يمكن فرزهم من البالغين لإحالته germline من الجينات المحورة. </li></ol> 4. النتائج نرى الخامس واسعةariety أنماط ومستويات التعبير ، واعتمادا على العنصر محسن يجري تحليلها. نحن مهتمون عادة في أنماط التعبير الأنسجة جدا محددة ، وغالبا ما يركزون على الجينات التي أعرب عنها في الهيكل العظمي. وغالبا ما يركزون على الجينات التي أعرب عنها في الهيكل العظمي. ويبين الشكل 2 أمثلة لأنماط التعبير الفسيفساء لاحظناه في الأجنة لدينا حقن ، مع القدرة على تنظيم التعبير في الغضاريف والعظام. أخيرا ، وجزء كبير من تسلسل اختبار لا تنظم التعبير أنسجة معينة. لهؤلاء ، ونحن غالبا ما نرى مضان القليل جدا ، وربما بضع خلايا منتشرة في جنين. أقل في كثير من الأحيان ، قد نرى مضان ، ولكن فقط في موقعين مشتركة للتعبير خارج الرحم ، والبشرة والعضلات والهيكل العظمي (الشكل 3). <img src="/files/ftp_upload/1722/1722fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2. مثال على أنماط التعبير الغضاريف والعظام التي لوحظت في الأجنة المحقونة. <img src="/files/ftp_upload/1722/1722fig3.jpg" alt="الشكل 3" /> الشكل 3. هناك ارتباط كبير بين مكان قريب محسن لهذا الجين والتنظيم والتعبير. جزء كبير من تسلسل اختبار لا تنظم التعبير أنسجة معينة. هذه غالبا ما يكون مضان قليلا جدا ، أو قد يكون موقعين مشتركة للتعبير خارج الرحم : البشرة والعضلات والهيكل العظمي. (الأعلى) Brightfield صورة صورة GFP (القاع) مضان.

<ol>
	<li>Fisher, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+the+biological+relevance+of+putative+enhancers+using+Tol2+transposon-mediated+transgenesis+in+zebrafish.">Evaluating the biological relevance of putative enhancers using Tol2 transposon-mediated transgenesis in zebrafish.</a> Nat Protoc. 1 (3), 1297-12 (2006).</li><li>Balciunas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+a+high+cargo-capacity+transposon+for+genetic+applications+in+vertebrates.">Harnessing a high cargo-capacity transposon for genetic applications in vertebrates.</a> PLoS Genet. 2 (11), e169-169 (2006).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book. , (1995).</li></ol>

وقد برهنا على النهج المستخدمة في المختبر لدينا لتحليل كفاءة القدرة على احتمال استخدام transgenesis الزرد. في معظم الأحيان ، ونحن نستخدم هذا النهج للبحث عن الأنسجة الخاصة والقدرة على الجينات البشرية المرتبطة. على الرغم من عدم وجود تسلسل واضح تناظر معظم الوقت بين الإنسان وا...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Takara LA Taq</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Takara Bio Inc</td>
<td>RR02M</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>pCR8/GW/TOPO TA Cloning Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>K2500-20</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gateway LR Clonase II enzyme Mix</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11791-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Library efficiency competent cells DH5&alpha;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>12535-019</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Library efficiency competent cells DB3.1</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11782-018</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>mMESSAGE mMACHINE Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion</td>
<td>AM1340</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HiSpeed Plasmid Midi Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>12643</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>QIAquick PCR Purification Kit </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>28104</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Flaming/Brown Micropipette Puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instrument</td>
<td>P-97</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pneumatic PicoPump</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>SYS-PV820</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

mosaic zebrafish transgenesis for evaluating enhancer sequences

وقد سلط الضوء على الانتهاء من تسلسل الجينوم البشري ، مع أن الكثير من الأنواع الأخرى ، والتحدي المتمثل في وظيفة محددة يرجع إلى عدم تسلسل الترميز. وظيفة واحدة بارزة نفذتها الكسر غير الترميز من الجينوم هو تنظيم النسخ الجيني ، ولكن لا توجد وسائل فعالة للتنبؤ على نطاق واسع مقرون التنظيم عناصر من تسلسل الحمض النووي الرئيسي. قمنا بتطوير بروتوكول لتقييم كفاءة من الناحية الوظيفية المحتملة مقرون عناصر التنظيم من خلال transgenesis الزرد. نهجنا يقدم مزايا هامة على خلية ثقافة تقنيات استنادا للجينات هامة تنمويا ، نظرا لأنه يقدم معلومات عن تنظيم الجينات المكانية والزمانية. على العكس ، هو أسرع وأقل تكلفة من التجارب المماثلة في الفئران المعدلة وراثيا ، ونحن نطبق بشكل روتيني لمتواليات معزولة عن الجينوم البشري. هنا نظهر نهجنا في اختيار عناصر لاختبار القائمة على الحفاظ على تسلسل وبروتوكول لدينا تسلسل الاستنساخ وmicroinjecting لهم في الأجنة الزرد.

Watch this Scientific Journal Video about Mosaic Zebrafish Transgenesis for Evaluating Enhancer Sequences at JoVE.com

Mosaic Zebrafish Transgenesis for Evaluating Enhancer Sequences

نظهر نهجنا لإيجاد العناصر المحتملة محسن من الجينات تنظم تنمويا وتقييمها من خلال وظيفتها transgenesis الزرد الفسيفساء.

فسيفساء Transgenesis اسماك الزرد لتقييم متواليات محسن

The completion of the human genome sequence, along with that of many other species, has highlighted the challenge of ascribing specific function to non ...

mosaic-zebrafish-transgenesis-for-evaluating-enhancer-sequences

Research

JoVE Journal

Biology

13.9K Views.  University of Pennsylvania. نظهر نهجنا لإيجاد العناصر المحتملة محسن من الجينات تنظم تنمويا وتقييمها من خلال وظيفتها transgenesis الزرد الفسيفساء.

Video: Mosaic Zebrafish Transgenesis for Evaluating Enhancer Sequences

Zebrafish Brain Ventricle Injection

Proper brain ventricle formation during embryonic brain development is required for normal brain function.  Brain ventricles are the highly conserved cavities within the brain that are filled with cerebrospinal fluid.  In zebrafish, after neural tube formation, the neuroepithelium undergoes a series of constrictions and folds while it fills with fluid resulting in brain ventricle formation.  In order to understand the process of ventricle formation, and the neuroepithelial shape changes that occur at the same time, we needed a way to visualize the ventricle space in comparison to the brain tissue.  However, the nature of transparent zebrafish embryos makes it difficult to differentiate the tissue from the ventricle space.  Therefore, we developed a brain ventricle injection technique where the ventricle space is filled with a fluorescent dye and imaged by brightfield and fluorescent microscopy.  The brightfield and the fluorescent images are then processed and superimposed in Photoshop.  This technique allows for visualization of the ventricle space with the fluorescent dye, in comparison to the shape of the neuroepithelium in the brightfield image.  Brain ventricle injection in zebrafish can be employed from 18 hours post fertilization through early larval stages.  We have used this technique extensively in our studies of brain ventricle formation and morphogenesis as well as in characterizing brain morphogenesis mutants (1-3).

After neural tube formation, the neuroepithelium constricts and folds while the tube fills with embryonic cerebrospinal fluid (eCSF) to form the embryonic brain ventricles. We developed this ventricle injection technique to better visualize the fluid filled space in contrast to the neuroepithelial shape in a live embryo.

الزرد حقن الدماغ البطين

Proper brain ventricle formation during embryonic brain development is required for normal brain function.  Brain ventricles are the highly conserved ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment 1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection 2, 5, 9. In all cases, resident M&uuml;ller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons. 
	We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis 10. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina. 
	Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts 11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or "knockdown" protein expression for three to five days 12. 
	Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells. 
	Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

A method to conditionally knockdown a target protein&#x2019;s expression in the adult zebrafish retina is described, which involves intravitreally injecting antisense morpholinos and electroporating them into the retina. The resulting protein is knocked down for several days, which allows testing the protein&#x2019;s role in the regenerating or intact retina.

في الجسم الحي من Electroporation Morpholinos في شبكية العين اسماك الزرد الكبار

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration of adult tissues, such as the heart1, retina2, spinal cord3, optic nerve4, sensory hair cells5, and fins6.
The zebrafish fin is a relatively simple appendage that is easily manipulated to study multiple stages in epimorphic regeneration. Classically, fin regeneration was characterized by three distinct stages: wound healing, blastema formation, and fin outgrowth. After amputating part of the fin, the surrounding epithelium proliferates and migrates over the wound. At 33 &deg;C, this process occurs within six hours post-amputation (hpa, Figure 1B)6,7. Next, underlying cells from different lineages (ex. bone, blood, glia, fibroblast) re-enter the cell cycle to form a proliferative blastema, while the overlying epidermis continues to proliferate (Figure 1D)8. Outgrowth occurs as cells proximal to the blastema re-differentiate into their respective lineages to form new tissue (Figure 1E)8. Depending on the level of the amputation, full regeneration is completed in a week to a month.
The expression of a large number of gene families, including wnt, hox, fgf, msx, retinoic acid, shh, notch, bmp, and activin-betaA genes, is up-regulated during specific stages of fin regeneration9-16. However, the roles of these genes and their encoded proteins during regeneration have been difficult to assess, unless a specific inhibitor for the protein exists13, a temperature-sensitive mutant exists or a transgenic animal (either overexpressing the wild-type protein or a dominant-negative protein) was generated7,12. We developed a reverse genetic technique to quickly and easily test the function of any gene during fin regeneration.
Morpholino oligonucleotides are widely used to study loss of specific proteins during zebrafish, Xenopus, chick, and mouse development17-19. Morpholinos basepair with a complementary RNA sequence to either block pre-mRNA splicing or mRNA translation. We describe a method to efficiently introduce fluorescein-tagged antisense morpholinos into regenerating zebrafish fins to knockdown expression of the target protein. The morpholino is micro-injected into each blastema of the regenerating zebrafish tail fin and electroporated into the surrounding cells. Fluorescein provides the charge to electroporate the morpholino and to visualize the morpholino in the fin tissue.
This protocol permits conditional protein knockdown to examine the role of specific proteins during regenerative fin outgrowth. In the Discussion, we describe how this approach can be adapted to study the role of specific proteins during wound healing or blastema formation, as well as a potential marker of cell migration during blastema formation.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

We describe a method to conditionally knockdown the expression of a target protein during adult zebrafish fin regeneration. This technique involves micro-injecting and electroporating antisense oligonucleotide morpholinos into fin tissue, which allows testing the protein&#x2019;s role in various stages of fin regeneration, including wound healing, blastema formation, and regenerative outgrowth.

في Electroporation المجراة من Morpholinos في الكبار التجديد زعنفة الذيل الزرد

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...

Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of genetically-encoded fluorescent proteins has proven a valuable strategy for elucidating dynamic morphogenetic processes as they occur in the intact organism. During the past decade, the development of photoactivatable and photoconvertible fluorescent proteins has opened the possibility to investigate the fate of discrete subpopulations of tagged proteins1. Unlike photoactivatable proteins, photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) are readily tracked and imaged in their native emission state prior to photoconversion, making it easier to identify and select regions by optical inspection. PCFPs, such as Kaede2, KikGR3, Dendra4 and EosFP5, can be shifted from green to red upon exposure to UV or blue light due to a His-Tyr-Gly tripeptide sequence which forms a green chromophore that can be photoconverted to a red one by a light-catalyzed &beta;-elimination and subsequent extension of a &pi;-conjugated system3. PCFPs and their monomeric variants are useful tools for tracking cells6-10 and studying protein dynamics11-14, respectively. During recent years, PCFPs have been expressed in different animal model, such as zebrafish6, chicken7,8 and mouse9,10 for cell fate tracking. Here we report a protocol for cell-specific photoconversion of PCFPs in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted proteins at later developmental stages. This methodology allows studying, in a tissue-specific manner, cell biological events underlying morphogenesis in the zebrafish animal model.

Here, we present a method for the photoactivated switch of photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted protein at specific time points during development. This methodology allows monitoring of cell biological events underlying different developmental processes in a live vertebrate organism.

تتبع الخلية عن طريق البروتينات Photoconvertible خلال التنمية اسماك الزرد

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of ...

Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections (bupivacaine, cardiotoxin or notexin), muscle transplantations (denervation-devascularization induced regeneration), intensive exercise, but also murine muscular dystrophy models such as the mdx mouse (for a review of these approaches see 1). In zebrafish, genetic approaches include mutants that exhibit muscular dystrophy phenotypes (such as runzel2 or sapje3) and antisense oligonucleotide morpholinos that block the expression of dystrophy-associated genes4. Besides, chemical approaches are also possible, e.g. with Galanthamine, a chemical compound inhibiting acetylcholinesterase, thereby resulting in hypercontraction, which eventually leads to muscular dystrophy5. However, genetic and pharmacological approaches generally affect all muscles within an individual, whereas the extent of physically inflicted injuries are more easily controlled spatially and temporally1. Localized physical injury allows the assessment of contralateral muscle as an internal control. Indeed, we recently used laser-mediated cell ablation to study skeletal muscle regeneration in the zebrafish embryo6, while another group recently reported the use of a two-photon laser (822 nm) to damage very locally the plasma membrane of individual embryonic zebrafish muscle cells7.
Here, we report a method for using the micropoint laser (Andor Technology) for skeletal muscle cell injury in the zebrafish embryo. The micropoint laser is a high energy laser which is suitable for targeted cell ablation at a wavelength of 435 nm. The laser is connected to a microscope (in our setup, an optical microscope from Zeiss) in such a way that the microscope can be used at the same time for focusing the laser light onto the sample and for visualizing the effects of the wounding (brightfield or fluorescence). The parameters for controlling laser pulses include wavelength, intensity, and number of pulses.
Due to its transparency and external embryonic development, the zebrafish embryo is highly amenable for both laser-induced injury and for studying the subsequent recovery. Between 1 and 2 days post-fertilization, somitic skeletal muscle cells progressively undergo maturation from anterior to posterior due to the progression of somitogenesis from the trunk to the tail8, 9. At these stages, embryos spontaneously twitch and initiate swimming. The zebrafish has recently been recognized as an important vertebrate model organism for the study of tissue regeneration, as many types of tissues (cardiac, neuronal, vascular etc.) can be regenerated after injury in the adult zebrafish10, 11.

The method presented here comprises the precise injury of live zebrafish embryos with high-energy laser pulses and the subsequent analysis of these injuries and their recovery with time. We also show how genetically labeled single or groups of skeletal muscle cells can be tracked during and after laser light induced damage.

الليزر بإلحاق الضرر من العضلات الهيكلية اسماك الزرد الجنينية

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections ...

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Drosophila eye is widely used as a model for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic recombination technique, elegant genetic screens based on clonal analysis have led to the identification of signaling pathways involved in eye development and photoreceptor (PR) differentiation at larval stages. We describe here the Tomato/GFP-FLP/FRT method, which can be used for rapid clonal analysis in the eye of living adult Drosophila. Fluorescent photoreceptor cells are imaged with the cornea neutralization technique, on retinas with mosaic clones generated by flipase-mediated recombination. This method has several major advantages over classical histological sectioning of the retina: it can be used for high-throughput screening and has proved an effective method for identifying the factors regulating PR survival and function. It can be used for kinetic analyses of PR degeneration in the same living animal over several weeks, to demonstrate the requirement for specific genes for PR survival or function in the adult fly. This method is also useful for addressing cell autonomy issues in developmental mutants, such as those in which the establishment of planar cell polarity is affected.

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Tomato/GFP-FLP/FRT method involves visualizing mosaic photoreceptor cells in living Drosophila. It can be used to follow individual photoreceptor cell fates in the retina for days or weeks. This method is ideal for studies of retinal degeneration and neurodegenerative diseases or photoreceptor cell development.

والطماطم / GFP-FLP / FRT الطريقة للتصوير لايف من الفسيفساء الكبار<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; خلايا مستقبلة للضوء

The Drosophila eye is widely used as a model  for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic  recombination technique, ...

Separation of Spermatogenic Cell Types Using STA-PUT Velocity Sedimentation

Mammalian spermatogenesis is a complex differentiation process that occurs in several stages in the seminiferous tubules of the testes. Currently, there is no reliable cell culture system allowing for spermatogenic differentiation in vitro, and most biological studies of spermatogenic cells require tissue harvest from animal models like the mouse and rat. Because the testis contains numerous cell types - both non-spermatogenic (Leydig, Sertoli, myeloid, and epithelial cells) and spermatogenic (spermatogonia, spermatocytes, round spermatids, condensing spermatids and spermatozoa) - studies of the biological mechanisms involved in spermatogenesis require the isolation and enrichment of these different cell types. The STA-PUT method allows for the separation of a heterogeneous population of cells - in this case, from the testes - through a linear BSA gradient. Individual cell types sediment with different sedimentation velocity according to cell size, and fractions enriched for different cell types can be collected and utilized in further analyses. While the STA-PUT method does not result in highly pure fractions of cell types, e.g. as can be obtained with certain cell sorting methods, it does provide a much higher yield of total cells in each fraction (~1 x 108 cells/spermatogenic cell type from a starting population of 7-8 x 108 cells). This high yield method requires only specialized glassware and can be performed in any cold room or large refrigerator, making it an ideal method for labs that have limited access to specialized equipment like a fluorescence activated cell sorter (FACS) or elutriator.

The STA-PUT method allows for the separation of different populations of spermatogenic cells based on size and density.

الفصل بين أنواع الخلايا المنوية عن طريق STA-PUT سرعة الترسيب

Mammalian spermatogenesis is a complex  differentiation process that occurs in several stages in the seminiferous  tubules of the testes. Currently, there ...

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Intracellular Ca2+ signals are commonly studied with fluorescent Ca2+ indicator dyes and microscopy techniques. However, quantitative analysis of Ca2+ imaging data is time consuming and subject to bias. Automated signal analysis algorithms based on region of interest (ROI) detection have been implemented for one-dimensional line scan measurements, but there is no current algorithm which integrates optimized identification and analysis of ROIs in two-dimensional image sequences. Here an algorithm for rapid acquisition and analysis of ROIs in image sequences is described. It utilizes ellipses fit to noise filtered signals in order to determine optimal ROI placement, and computes Ca2+ signal parameters of amplitude, duration and spatial spread. This algorithm was implemented as a freely available plugin for ImageJ (NIH) software. Together with analysis scripts written for the open source statistical processing software R, this approach provides a high-capacity pipeline for performing quick statistical analysis of experimental output. The authors suggest that use of this analysis protocol will lead to a more complete and unbiased characterization of physiologic Ca2+ signaling.

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Here a novel region of interest analysis protocol based on sorting best-fit ellipses assigned to regions of positive signal within two-dimensional time lapse image sequences is demonstrated. This algorithm may enable investigators to comprehensively analyze physiological Ca2+ signals with minimal user input and bias.

التحليل الآلي من ديناميك كا<sup&gt; 2 +</sup&gt; إشارات في تسلسلات الصور

Intracellular Ca2+ signals are commonly studied with fluorescent Ca2+ indicator dyes and microscopy techniques. However, quantitative analysis of Ca2+ ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

سم كلوي حقن مكروي في الزرد لنموذج قصور كلوي حاد

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

In Vivo Surface Electrocardiography for Adult Zebrafish

The electrocardiogram waveforms of adult zebrafish and those of humans are remarkably similar. These electrocardiogram similarities enhance the value of zebrafish not only as a research model for human cardiac electrophysiology and myopathies but also as a surrogate model in high throughput pharmaceutical screening for potential cardiotoxicities to humans, such as QT prolongation. As such, in vivo electrocardiography for adult zebrafish is an electrical phenotyping tool that is necessary, if not indispensable, for cross-sectional or longitudinal in vivo electrophysiological characterizations. However, too often, the lack of a reliable, practical, and cost-effective recording method remains a major challenge preventing this in vivo diagnostic tool from becoming more readily accessible. Here, we describe a practical, straightforward approach to in vivo electrocardiography for adult zebrafish using a low-maintenance, cost-effective, and comprehensive system that yields consistent, reliable recordings. We illustrate our protocol using healthy adult male zebrafish of 12-18 months of age. We also introduce a rapid real-time interpretation strategy for quality validation to ensure data accuracy and robustness early in the electrocardiogram recording process.

Here, we present a reliable, minimally invasive, and cost-effective method to record and interpret electrocardiograms in live anesthetized adult zebrafish.

في فيفو سطح الكهربائي لحمار وحشي الكبار

The electrocardiogram waveforms of adult zebrafish and those of humans are remarkably similar. These electrocardiogram similarities enhance the value of ...