Чтобы получить органоид из одного гепатоцеллюлярного рецептора B2, продуцирующего эритропоэтин, или FEB2-положительной кишечной стволовой клетки, проведите сортировку клеток, активированную флуоресценцией, на основе экспрессии FEB2, и разделите полученные клетки на четыре группы: высокие, средние, низкие и отрицательные. После сбора высококлеточных гранул FEB2 центрифугированием при 390G в течение трех минут при четырех градусах Цельсия поместите одиночные отсортированные клетки FEB2 с высоким содержанием в ECM с помощью пипетки, затем засейте клетки на 24-луночную пластину со скоростью 100 синглов на 40 микролитров ECM на лунку. Инкубируйте 24-луночную пластину в течение 15 минут при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа для полимеризации ECM.
Затем покройте ECM 500 микролитрами питательной среды, содержащей 10 микромолярных киназ, связанных с рядом, или ингибитор горных пород в течение первых двух дней для поддержания высокого уровня клеток FEB2. Вручную осмотрите клетки с помощью инвертированного микроскопа с 40-кратным увеличением и наблюдайте жизнеспособные органоиды с образованием сфероидов и выпячиванием крипты. Самоорганизующиеся структуры крипты, напоминающие нормальную тонкую кишку, были воссозданы из единичных высоких клеток FEB2.
К пятому дню культуры образовались сфероидоподобные структуры, а с седьмого по девятый день происходила эвагинация пятен с образованием крипт.
